Današnji†Trenutni naslov: OX11 0DE, Združeno kraljestvo, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Združeno kraljestvo, Diamond Light Source Co., Ltd., Center za elektronsko biološko slikanje.
Reakcijski center, ki zajema svetlobo, kompleks 1 (RC-LH1) je osrednja fotosintetska komponenta vijoličnih fototrofnih bakterij. Predstavili smo dve strukturi kompleksa RC-LH1 iz Rhodopseudomonas palustris, pridobljeni s krioelektronsko mikroskopijo. Struktura kompleksa RC-LH114-W z ločljivostjo 2,65 Å je sestavljena iz 14 podenotnih zank LH1, ki obdajajo RC, ki ga prekine protein W, medtem ko je kompleks brez proteina W v celoti sestavljen iz RC, obdanega z RC. Zaprta zanka LH1 s 16 podenotami. Primerjava teh struktur ponuja vpogled v dinamiko kinona v kompleksu RC-LH1, vključno s prej nedoločenimi konformacijskimi spremembami pri vezavi kinona na mesto QB RC, kot tudi lokacijo pomožnih vezavnih mest kinona, ki pomagajo pri njihovem prenosu na RC. Edinstvena struktura proteina W preprečuje zaprtje zanke LH1 in s tem ustvarja kanal za pospešitev izmenjave kinona/kinolona.
Energija, ki jo zagotavlja fotosinteza, lahko vzdržuje skoraj vse življenje na Zemlji in ima velik potencial za sončno biotehnologijo. Vijolične fototrofne bakterije poleg spodbujanja globalne fotosinteze kažejo tudi različne energijske načine in presnovne sposobnosti. Lahko se izognejo fotosintezi in rastejo kot heterotrofne bakterije v temi, lahko fiksirajo dušik in ogljikov dioksid, proizvajajo vodik in razgrajujejo aromatske spojine (1-3). Da bi zagotovili energijo za te procese, je treba svetlobo hitro in učinkovito pretvoriti v kemično energijo. Ta proces se začne, ko antenski kompleks, ki lovi svetlobo, absorbira svetlobo in prenese ujeto energijo v reakcijski center (RC), s čimer se začne ločevanje naboja (4–7). Osnovna enota fotosinteze pri vijoličnih fototrofnih bakterijah je sestavljena iz RC tipa 2, obdanega s kompleksom, ki lovi svetlobo 1 (LH1), ki tvori osrednji kompleks RC-LH1. LH1 tvori niz ukrivljenih heterodimerov αβ, od katerih vsak veže dve molekuli bakterijskega klorofila (BChl) a in enega ali dva karotenoida (8-12). Najenostavnejša antena LH1 je sestavljena iz 16 ali 17 αβ heterodimerov, ki obkrožajo RC (9-13) v zaprti zanki, vendar v drugih osrednjih kompleksih transmembranski peptidi prekinjajo kontinuiteto okoliškega LH1, s čimer spodbujajo difuzijo kinola/kinona med RC in kompleksom citokroma bc1 (11, 13-15). Vijolična fototrofna rastlina Rhodopseudomonas (Rps.) je modelni organizem, ki lahko razume prenos energije in elektronov, ki podpira fotosintezo. Prva kristalna struktura Rps. Model kompleksa palustris RC-LH1 je RC, obdan s 15 heterodimernimi zankami LH1, ki jih prekinja neznana beljakovina, imenovana »protein W« (14). Beljakovina W je bila pozneje identificirana kot RPA4402, ki je neznačilna beljakovina z 10,5 kDa in tremi predvidenimi transmembranskimi vijačnicami (TMH) (16). Predlagamo, da gen rpa4402, ki kodira protein W, preimenujemo v pufW, da bi bil skladen z nomenklaturo, ki se uporablja za gene, ki kodirajo podenote RC-L, M (pufL, pufM) in LH1α, β (pufA, pufB). Zanimivo je, da je protein W prisoten le v približno 10 % RC-LH1, kar razkriva, da Rps. palustris proizvaja dva različna kompleksa RC-LH1. Tukaj poročamo o visokoločljivostnih krio-EM (cryo-EM) strukturah dveh osrednjih kompleksov, enem s proteinom W in 14 αβ heterodimeri, drugem pa brez proteina W in zaprto 16-heterodimerno zanko LH1. Naša struktura predstavlja korak naprej v razumevanju kompleksa RC-LH1 Rps. palustris, ker smo analizirali homogeno populacijo vsake variante in imamo zadostno ločljivost, da jasno dodelimo vsak peptid in vezane pigmente ter sorodne lipide in kinone. Primerjava teh struktur kaže, da trije TMH proteini-W, ki jih doslej še nismo našli v nobenem drugem kompleksu RC-LH1, ustvarjajo kinonski kanal za pospešitev izmenjave kinona/kinolona. Identificirali smo številna ohranjena vezavna mesta za lipide in kinone, odkrili pa smo tudi novo konformacijsko spremembo po kombinaciji kinona in RC, ki je lahko primerna za RC fotosistema II (PSII) oksigeniranih fototrofnih organizmov. Naše ugotovitve ponujajo nov vpogled v kinetiko vezave in izmenjave kinona/kinolona v osrednjem kompleksu RC-LH1 vijoličnih fototrofnih bakterij.
Da bi olajšali podrobno študijo obeh kompleksov, ki ju najdemo v Rps. palustris, smo vsak RC-LH1 izolirali z biokemijsko metodo. Kompleks s pomanjkanjem proteina W (v nadaljevanju ΔpufW) smo očistili iz seva, ki mu manjka gen pufW (16), in lahko se proizvede le en kompleks RC-LH1. Kompleks, ki vsebuje protein W, proizvaja sev. Protein W tega seva je na svojem C-koncu modificiran z 10x His oznako, tako da se lahko kompleks, ki vsebuje protein W, učinkovito kombinira z večino proteina W, ki mu manjka, z imobilizacijo kovine. Kompleks se učinkovito loči (16) z afinitetno kromatografijo (IMAC).
Kot je prikazano na sliki 1, oba kompleksa vsebujeta tri podenote RC (RC-L, RC-M in RC-H), obdane z anteno LH1. Struktura 2,80 Å kompleksa brez proteina W kaže 16 αβ heterodimerov, ki tvorijo zaprto zanko LH1, ki popolnoma obdaja RC, v nadaljevanju kompleks RC-LH116. Struktura 2,65 Å kompleksa, ki vsebuje protein W, ima 14-heterodimer LH1, ki ga prekinja protein W, v nadaljevanju RC-LH114-W.
(A in B) Površinska predstavitev spojine. (C in D) Vezani pigmenti, izraženi v paličicah. (E in F) Kompleksi, opazovani s citoplazemske površine, imajo peptide in podenote LH1, predstavljene v risankah, in so oštevilčeni v smeri urinega kazalca od vrzeli protein-W [skladno s številčenjem Rba. kompleks sphaeroides (13)]. Za LH1-α je barva podenote proteina rumena; za LH1-β je barva podenote proteina modra; za protein-W je protein rdeč; za RC-H je cijan; za RC-L je oranžna; za RC-M je magenta. Kofaktorji so predstavljeni s palicami, zelena predstavlja molekuli BChl in BPh a, vijolična predstavlja karotenoide, rumena pa molekule UQ10. (G in H) Povečan pogled na vrzel protein-W v ekvivalentnem območju kompleksa RC-LH114-W (G) in kompleksa RC-LH116 (H). Kofaktorji so prikazani v obliki zapolnjevanja prostora, kelirani kinon je prikazan v modri barvi. Vrzel protein-W je označena z modro črtkano črto v (G), majhne luknje, kjer kinon/kinolol difundira na obroču LH116, pa so označene s črno črtkano črto v (H).
Slika 1 (A in B) prikazuje RC, obdan z odprtimi ali zaprtimi nizi heterodimerov LH1αβ, od katerih se vsak veže na dva BChl in en karotenoid (slika 1, C in D). Prejšnje študije so pokazale, da je Rps kompleks LH1. V biosintetski poti spirulinskega ksantina te vrste vsebujejo mešane populacije karotenoidov (17). Vendar je spiropiroksantin prevladujoči karotenoid in njegova gostota je zadovoljiva. Zato smo se odločili za modeliranje spiroksantina na vseh vezavnih mestih LH1. Alfa in beta polipeptidi so posamezni TMH s kratkimi zunanjimi regijami membrane (slika 1, A, B, E in F). Čeprav gostota 17 ostankov na C-terminusu ni bila opažena, je bil alfa polipeptid v obeh kompleksih razcepljen od Met1 do Ala46. β polipeptid je bil v RC-LH116 reduciran od Gly4 do Tyr52, v RC-LH114-W pa od Ser5 do Tyr52. Gostote 3 ali 4 N-terminalnih ali 13 C-terminalnih ostankov niso opazili (slika S1). Analiza mešanega kompleksa RC-LH1, pripravljenega iz seva divjega tipa, z masno spektrometrijo je pokazala, da je manjkajoča regija posledica heterologne cepitve teh peptidov (slika S1 in S2). Opazili so tudi N-terminalno formilacijo α-Met1 (f). Analiza je pokazala, da α-peptid sestavljajo ostanki od fMet1 do Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, β-peptid pa ostanki od Ser2 do Ala53, kar se dobro ujema z gostotno karto nizkotemperaturnega EM.
Koordinacija α-His29 in β-His36 povzroči, da so BChl-i v nasprotni smeri; vsak αβ heterodimer se sestavi s svojimi sosedi in tvori odprto zanko (RC-LH114-W) ali zaprto zanko (RC-LH116) okoli RC ekscitonsko sklopljene matrike pigmentov (slika 1, C in D). V primerjavi s pasom 877 nm RC-LH114-W je absorpcijski rdeči premik RC-LH116 pri 880 nm 3 nm (slika 2A). Vendar pa je spekter krožnega dikroizma skoraj enak (slika 2B), kar kaže, da je lokalno okolje BChl-ov zelo podobno, čeprav obstaja jasna razlika med odprtimi in zaprtimi zankami. Absorpcijski rdeči premik je lahko posledica zmanjšanega toplotnega gibanja in povečane stabilnosti na zaprti zanki (18, 19), spremembe v vezavi pigmentov, ki jo povzroča zaprta zanka (20, 21), ali kombinacije teh dveh učinkov (11).
(A) Ultravijolični/vidni/bližnji infrardeči absorpcijski spekter, katerega vrhovi so označeni z ustreznimi pigmenti in normalizirani na vrh BPh pri 775 nm. (B) Spekter krožnega dikroizma, normaliziran na absorbanco BChl pri 805 nm. (C in D) Izbrani ΔA spektri iz časovno ločenih absorpcijskih spektrov kompleksa RC-LH114-W (C) in kompleksa RC-LH116 (D). Za boljšo primerljivost so vsi spektri normalizirani na ∆A od −A pri 0,2 ps. (E) Hitrost oksidacije citokroma c2 po obsevanju v prisotnosti različnih koncentracij UQ2 (za surove podatke glejte sliko S8). (F) V celicah, gojenih pod nizko, srednje ali visoko intenzivno svetlobo (10, 30 ali 300 μMm-2 s-1), podenoti proteina W in RC-L v prečiščenem kompleksu in razmerje ločenih membran. Raven beljakovin določite z elektroforezo v SDS-poliakrilamidnem gelu in imunološkim testom (za surove podatke glejte sliko S9). Določite razmerje glede na prečiščen kompleks RC-LH114-W. Stehiometrično razmerje med RC-L in beljakovinami-W v kompleksu je 1:1.
BChl na položaju 1 v deformirani zanki αβ14 RC-LH114-W (slika 1, A, C in E) so za 6,8 Å bližje primarnemu donorju RC (P) kot ekvivalentni BChl v RC-LH116 (slika 1, B, D in F ter slika S3); vendar pa kinetika prehodne absorpcije obeh kompleksov kaže, da sta za RC-LH114-W in RC-LH116 časovni konstanti prenosa vzbujevalne energije iz LH1 v RC 40 ± 4 in 44 ± 3 ps (slika 2). , C in D, slika S4 in tabela S2). Prav tako ni bistvene razlike v elektronskem prenosu znotraj RC (slika S5 in povezano dodatno besedilo). Domnevamo, da je tesno ujemanje časa prenosa energije med LH1 in RC-P posledica podobne razdalje, kota in potencialne energije večine BChl v obeh zankah LH1. Zdi se, da raziskovanje energijskega vzorca LH1 za doseganje minimalne razdalje ni hitrejše od neposrednega prenosa energije iz neoptimalnih mest v RC. Zanka LH1 z odprto zanko v RC-LH114-W je lahko pri nizkih temperaturah za strukturno analizo podvržena tudi zanemarljivemu toplotnemu gibanju, pri sobni temperaturi pa je od pigmentacijske razdalje βBChls na položaju RC1 daljša konformacija obroča αβ14.
Kompleks RC-LH116 vsebuje 32 BChl in 16 karotenoidov, njegova celotna razporeditev pa je enaka kot pri sevih Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (PDB ID 7C9R) (12) in zelenih alg (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Po poravnavi so bila opažena le majhna odstopanja v položajih heterodimerov αβ, zlasti 1-5, 15 in 16 (slika S6). Prisotnost proteina-W ima pomemben vpliv na strukturo LH1. Njegovi trije TMH so povezani s kratkimi zankami, pri čemer je N-terminal na lumnski strani kompleksa, C-terminal pa na citoplazmatski strani (sliki 1A in 3, od A do D). Protein-W je večinoma hidrofoben (slika 3B), TMH2 in TMH3 pa interagirata z LH1αβ-14 in tvorita transmembransko površino (slika 3, B in E do G). Stik je v transmembranskem območju sestavljen predvsem iz ostankov Phe, Leu in Val. Ti ostanki so zloženi s hidrofobnimi aminokislinami in pigmenti αβ-14. K interakciji prispevajo tudi nekateri polarni ostanki, vključno z vodikovo vezjo med W-Thr68 in β-Trp42 na površini kompleksne votline (slika 3, F in G). Na površini citoplazme se Gln34 nahaja ob keto skupini karotenoidov αβ-14. Poleg tega je bila molekula n-dodecil β-d-maltozida (β-DDM) ločena, njen hidrofobni rep pa se je razširil do stika med proteinom-W in αβ-14, lipidni rep pa se lahko nahaja v telesu. Opazili smo tudi, da so C-terminalne ločljive regije proteinov W in RCH zelo blizu, vendar ne v okviru tvorbe specifičnih interakcij (slika 1, A in E). Vendar pa lahko pride do interakcij v nerazrešenih C-terminalnih aminokislinah teh dveh proteinov, kar lahko zagotovi mehanizem za rekrutiranje proteina W med sestavljanjem kompleksa RC-LH114-W.
(A) Protein-W, ki je v risani obliki obrnjen proti vmesniku z LH1αβ14, ima paličasto stransko verigo (rdeča), prikazano v delu diagrama elektrostatičnega potenciala (prozorna siva površina s konturno stopnjo 0,13). (B) Protein-W, predstavljen s hidrofobno obarvano površino. Polarna in nabita območja so prikazana v cijan barvi, hidrofobna območja so prikazana v beli barvi, močno hidrofobna območja pa so prikazana v oranžni barvi. (C in D) Protein-W, predstavljen v risani obliki, ima enako orientacijo kot v (A) (C) in je zasukan za 180° (D). Glede na položaj v zaporedju razločljivi ostanki prevzamejo mavrično barvno shemo, kjer je N-terminal moder, C-terminal pa rdeč. (E) Protein-W v istem pogledu kot v (A), ostanki na vmesniku protein-W:LH1 pa so predstavljeni s palicami s pritrjenimi oznakami. (F) Protein-W je zasukan za 90° glede na (E) in LH1αβ14 v risani predstavitvi in ​​glede na ostanke vmesnika v stolpčni predstavitvi. Previsni ostanki beta polipeptida so označeni. Kofaktor je prikazan kot črtica, ki se ujema z barvo slike 1, razgrajeni β-DDM je prikazan sivo, kisik pa rdeče. (G) Pogled v (F) je zasukan za 180°, z vidnimi ostanki označenega alfa polipeptida.
Protein-W nadomešča heterodimer αβ (15. na sliki 1F), s čimer preprečuje zaprtje zanke in nagibanje prvih treh heterodimerov αβ. Ugotovljeno je bilo, da je bil največji kot naklona prvega heterodimera αβ-1 glede na normalo filma od 25° do 29° (slika 1, A in E), kar je nastalo z naklonom αβ-1 od 2° do 8° v RC A, kar je oster kontrast - LH116 (slika 1, B in F). Drugi in tretji heterodimer sta nagnjena od 12° do 22° oziroma od 5° do 10°. Zaradi sterične ovire RC naklon αβ-1 ne vključuje drugega para αβ (ki ustreza 16. αβ na sliki 1F), kar tvori jasno vrzel v obroču LH1 (slika 1, A in E). Zaradi pomanjkanja dveh heterodimerov αβ, ki ga spremlja izguba štirih BChl in dveh karotenoidov, se noben od karotenoidov ne veže na zavito podenoto αβ-1, kar ima za posledico obroč LH114-W, ki vsebuje 13 vegetarijanskih karotenoidov in 28 BChl. Ocene lokalne ločljivosti obeh kompleksov v regijah αβ1 do 7 so nižje od ocen preostale zanke LH1, kar lahko odraža inherentno plastičnost podenote LH1, ki meji na mesto RC QB (slika 4).
Slike RC-LH114-W (A in B) in RC-LH116 (C in D) so prikazane z istega pogleda od zgoraj/strani (A in B) (A in C) in površine votline kot na sliki 1 (B in D). Barvne tipke so prikazane na desni.
Edini drug značilen osrednji kompleks s stehiometričnim razmerjem 1:14 je dimer Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Vendar protein W in PufX nimata očitne homologije in imata pomemben vpliv na njuni strukturi LH1. PufX je en sam TMH z N-terminalno citoplazemsko domeno, ki interagira s citoplazemsko stranjo podenote RC-H (13) na položaju, ki ustreza Rps. palustris LH116αβ-16. PufX ustvari kanal za izmenjavo kinona/kinolona med RC-LH1 in kompleksom citokroma bcl in je prisoten v vseh osrednjih kompleksih Rba. sphaeroides (13). Čeprav je vmesnik monomer-monomer v Rba. Dimer sphaeroides RC-LH1-PufX se nahaja na vezavnem položaju proteina W v RC-LH114-W, vrzel, ki jo povzročata PufX in protein-W, pa je na enakovrednem položaju (slika S7A). Vrzel v RC-LH114-W je poravnana tudi s hipotetičnim kinonskim kanalom (8) Pseudomonas rosea LH1, ki ga tvorijo peptidi, ki niso povezani s proteinom W ali PufX (slika S7B). Poleg tega se kinonski kanal v Blc. Smaragdno zeleni LH1, ki nastane z izključitvijo ene γ podenote (7), nahaja na podobnem položaju (slika S7C). Čeprav ga posredujejo različne beljakovine, se zdi, da je pojav teh kinonskih/kinololnih kanalov na skupnem mestu v kompleksu RC-LH1 primer konvergentne evolucije, kar kaže, da lahko vrzel, ki jo ustvari protein W, deluje kot kinonski kanal.
Vrzel v zanki LH114-W omogoča nastanek neprekinjenega membranskega območja med notranjim prostorom kompleksa RC-LH114-W in membrano (slika 1G), namesto da bi obe domeni povezali skozi proteinsko poro, kot je to v proteinih. Kompleks RC-LH116 je podoben zaprtemu igličastemu kompleksu Tch (22) (slika 1H). Ker je difuzija kinona skozi membrano hitrejša od difuzije skozi ozek proteinski kanal, lahko odprta zanka LH114-W omogoči hitrejši promet RC kot zaprta zanka LH116, difuzija kinona v RC pa je lahko bolj omejena. Da bi preverili, ali protein W vpliva na pretvorbo kinonov skozi RC, smo izvedli test oksidacije citokroma na določeni koncentraciji ubikinona 2 (UQ2) (analog naravnega UQ10 s krajšim izoprenskim repom) (slika 2E). Čeprav prisotnost kelatiranega kinona ovira natančno določanje navidezne Michaelisove konstante (RC-LH114-W in RC-LH116 sta primerna za 0,2 ± 0,1 μM oziroma 0,5 ± 0,2 μM), je največja hitrost RC-LH114-W (4,6 ± 0,2 e-RC-1 s-1) za 28 ± 5 % večja kot pri RC-LH116 (3,6 ± 0,1 e-RC-1 s-1).
Sprva smo ocenili, da je protein-W prisoten v približno 10 % osrednjega kompleksa (16); tukaj so stopnje zasedenosti rastnih celic pri šibki, srednji in visoki svetlobi 15 ± 0,6 %, 11 ± 1 % oziroma 0,9 ± 0,5 % (slika 2F). Kvantitativna primerjava masne spektrometrije je pokazala, da dodatek histidinske oznake ni zmanjšal relativne številčnosti proteina-W v primerjavi s sevi divjega tipa (P = 0,59), zato te ravni niso artefakt modificiranega proteina-W (slika S10). Vendar pa lahko ta nizka zasedenost proteina-W v kompleksu RC-LH1 omogoči nekaterim RC, da se pospešeno preoblikujejo, s čimer se ublaži počasnejša izmenjava kinona/kinolona v kompleksu RC-LH116. Opazili smo, da stopnja zasedenosti pri visoki svetlobi ni v skladu z nedavnimi transkriptomskimi podatki, kar kaže, da se izražanje gena pufW poveča pri močni svetlobi (slika S11) (23). Razlika med transkripcijo pufW in vključitvijo proteina W v kompleks RC-LH1 je zmedena in lahko odraža kompleksno regulacijo proteina.
V RC-LH114-W je dodeljenih in modeliranih 6 molekul kardiolipina (CDL), 7 molekul fosfatidilholina (POPC), 1 molekula fosfatidilglicerola (POPG) in 29 molekul β-DDM: 6 molekul CDL, 24 molekul POPC, 2 molekuli POPG in 12 molekul βDDM. RC-LH116 (slika 5, A in B). V teh dveh strukturah se CDL nahaja skoraj na citoplazmatski strani kompleksa, medtem ko se POPC, POPG in β-DDM večinoma nahajajo na luminalni strani. V območju αβ-1 do αβ-6 kompleksa RC-LH114-W sta bili izolirani dve molekuli lipida in detergenta (slika 5A), v ekvivalentnem območju RC-LH116 pa pet (slika 5B). Več lipidov je bilo najdenih na drugi strani kompleksa, predvsem CDL, ki so se nabrali med RC in αβ-7 do αβ-13 (slika 5, A in B). Drugi strukturno razločeni lipidi in detergenti se nahajajo zunaj obroča LH1, dobro razločene acilne verige pa se raztezajo med podenotami LH1, ki so v RC-LH114-W okvirno označene kot β-DDM in v RC-Zmes β-DDM in POPC-LH116 definirane kot β-DDM. Podobni položaji kelirajočih lipidov in detergentov v naši strukturi kažejo, da so fiziološko pomembna vezavna mesta (slika S12A). Položaji enakovrednih molekul v Tch imajo tudi dobro konsistenco. Nežni in Trv. Sev 970 RC-LH1 (slika S12, B do E) (9, 12) in ostanki vodikovih vezi lipidne glave so pokazali dokaj dobro ohranjenost v poravnavi zaporedja (slika S13), kar kaže, da so ta mesta lahko ohranjena v kompleksu RC-LH1 (24), ki se veže na ohranjen CDL.
(A in B) Peptidi RC-LH114-W (A) in RC-LH116 (B) so predstavljeni z risanimi črkami, pigmenti pa s palicami, pri čemer je uporabljena barvna shema na sliki 1. Lipidi so prikazani z rdečo barvo, detergenti pa s sivo. UQ, vezan na mesti RC QA in QB, je rumen, izolirani UQ pa moder. (C in D) Isti pogledi kot (A) in (B), z izpuščenimi lipidi. (E do G) Povečan pogled na Q1(E), Q2(F) in Q3(G) iz RC-LH116 s stranskimi verigami, ki vplivajo druga na drugo. Vodikove vezi so prikazane kot črne črtkane črte.
V RC-LH116 sta tako RC QA kot QB UQ, ki sodelujeta pri prenosu elektronov v procesu ločevanja naboja, razgrajena na svojih vezavnih mestih. Vendar pa v RC-LH114-W kinon QB ni bil razločen in bo podrobneje obravnavan v nadaljevanju. Poleg kinonov QA in QB sta v strukturi RC-LH114-W razporejeni dve kelirani molekuli UQ (ki se nahajata med obročema RC in LH1) glede na njuni dobro razločeni glavni skupini (ki se nahajata v prostoru Q1 oziroma Q2). Slika 5C). Q1 sta dodeljeni dve izoprenski enoti, zemljevid gostote pa razloči vseh 10 izoprenskih repov Q2. V strukturi RC-LH116 so bile razločene tri kelirane molekule UQ10 (Q1 do Q3, slika 5D) in vse molekule imajo jasno gostoto po celotnem repu (slika 5, D do G). V obeh strukturah imajo položaji kinonskih glav Q1 in Q2 odlično konsistenco (slika S12F) in interagirajo le z RC. Q1 se nahaja na vhodu v W režo RC-LH114-W (slika 1G in 5, C, D in E), Q2 pa se nahaja blizu vezavnega mesta QB (slika 5, C, D in F). Ohranjena ostanka L-Trp143 in L-Trp269 sta zelo blizu Q1 in Q2 ter omogočata potencialne π-zlagalne interakcije (slika 5, E in F ter slika S12). L-Gln88, 3,0 Å od distalnega kisika Q1, zagotavlja močno vodikovo vez (slika 5E); ta ostanek je ohranjen v vseh RC, razen v najbolj oddaljeni povezavi (slika S13). L-Ser91 je konzervativno substituiran s Thr v večini drugih RC (slika S13), je 3,8 Å oddaljen od metilnega kisika Q1 in lahko tvori šibke vodikove vezi (slika 5E). Zdi se, da Q3 nima specifične interakcije, vendar se nahaja v hidrofobnem območju med podenoto RC-M in podenoto LH1-α 5 do 6 (slika 5, D in G). Q1, Q2 in Q3 ali bližnji kelirani kinoni so bili prav tako razločeni v Tch. Gentle, Trv. Strain 970 in Blc. Struktura šarenice (9, 10, 12) kaže na ohranjeno pomožno vezavno mesto kinona v kompleksu RC-LH1 (slika S12G). Pet razgrajenih UQ v RC-LH116 se dobro ujema s 5,8 ± 0,7 vsakega kompleksa, določenimi z visokozmogljivo tekočinsko kromatografijo (HPLC), medtem ko so trije razgrajeni UQ v RC-LH114-W nižji od Izmerjena vrednost 6,2 ± 0,3 (slika S14) kaže, da so v strukturi nerazrešene molekule UQ.
Psevdosimetrična polipeptida L in M ​​vsebujeta vsak pet TMH in tvorita heterodimer, ki združuje en dimer BChl, dva monomera BChl, dva monomera bakteriofaga (BPh) in eno nehemsko železo ter eno ali dve molekuli UQ10. Zaradi prisotnosti vodikovih vezi na terminalni ketonski skupini in njenega znanega kopičenja v Rps so karotenoidi vključeni v podenoto M, ki se imenuje cis-3,4-dehidroorhodopin. Vrste (25). Domena zunanje membrane RC-H je zasidrana na membrano z enim samim TMH. Celotna struktura RC je podobna tripodenotni strukturi RC sorodnih vrst (kot je Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Makrocikli BChl in BPh, karotenoidna hrbtenica in nehemsko železo se prekrivajo znotraj območja ločljivosti teh struktur, prav tako glavna skupina UQ10 na mestu QA in kinon QB na RC-LH116 (slika S15).
Razpoložljivost dveh struktur RC z različnimi stopnjami zasedenosti mest QB ponuja novo priložnost za preučevanje doslednih konformacijskih sprememb, ki spremljajo vezavo kinona QB. V kompleksu RC-LH116 se kinon QB nahaja v popolnoma vezanem "proksimalnem" položaju (26), vendar ločitev RC-LH114-W ne vsebuje kinona QB. V RC-LH114-W ni kinona QB, kar je presenetljivo, saj je kompleks aktiven, bolj kot kompleks RC-LH116 s strukturno raztopljenim kinonom QB. Čeprav dva obroča LH1 kelirata približno šest kinonov, jih je pet strukturno raztopljenih v zaprtem obroču RC-LH116, medtem ko so le trije strukturno omejeni v odprtem obroču RC-LH114-W. Ta povečana strukturna motnja lahko odraža hitrejšo zamenjavo mest QB RC-LH114-W, hitrejšo kinetiko kinona v kompleksu in povečano verjetnost prečkanja zanke LH1. Predlagamo, da je pomanjkanje UQ na mestu RC QB RC-LH114-W lahko posledica bolj kompleksnega in aktivnejšega kompleksa, mesto QB RC-LH114-W pa je bilo takoj zamrznjeno v prometu UQ. Specifična faza (vhod na mesto QB je bil zaprt) odraža konformacijo te aktivnosti.
Brez QB je spremljajoča rotacija L-Phe217 v položaj, ki ni združljiv z vezavo UQ10, ker bo povzročila prostorski trk s prvo izoprensko enoto repa (slika 6A). Poleg tega so očitne glavne konformacijske spremembe, zlasti vijačnica de (kratka vijačnica v zanki med TMH D in E), kjer se L-Phe217 premakne v vezavno mesto QB, in rotacija L-Tyr223 (slika 6A), da se pretrga vodikova vez z ogrodjem M-Asp45 in zapre vhod vezavnega mesta QB (slika 6B). Če se vijačnica de zavrti na svoji bazi, se Cα L-Ser209 premakne za 0,33 Å, medtem ko se L-Val221Cα premakne za 3,52 Å. V TMH D in E ni opaznih sprememb, ki bi se lahko prekrivale v obeh strukturah (slika 6A). Kolikor vemo, je to prva struktura v naravnem RC, ki zapira mesto QB. Primerjava s popolno (QB-vezano) strukturo kaže, da je pred reduciranjem kinona potrebna konformacijska sprememba, da vstopi v kinon. L-Phe217 se zavrti in tvori π-zlagalno interakcijo z glavno skupino kinona, vijačnica pa se premakne navzven, kar omogoča, da ogrodje L-Gly222 in stranska veriga L-Tyr223 tvorita mrežo vodikovih vezi s stabilno strukturo vodikovih vezi (slika 6, A in C).
(A) Prekrivajoča se risanka holograma (veriga L, oranžna/veriga M, magenta) in apo (siva) strukture, v kateri so ključni ostanki prikazani v obliki paličaste predstavitve. UQ10 je predstavljen z rumeno črto. Pikčasta črta označuje vodikove vezi, ki so nastale v celotni strukturi. (B in C) Površinska predstavitev apolipoproteina in celotne obročne strukture, pri čemer je v modri barvi označen kisik stranske verige L-Phe217 in v rdeči L-Tyr223. Podenota L je oranžna; podenoti M in H nista obarvani. (D in E) Apolipoprotein (D) in celotna (E) mesta RC QB [obarvano z (A)] in Thermophilus thermophilus PSII (zelena, modra s plastičnim kinonom; PDB ID: 3WU2) Poravnava (58).
Nepričakovano, čeprav je na voljo več struktur RC-jev s pomanjkanjem QB brez LH1, konformacijske spremembe, opažene v tej študiji, še niso bile opisane. Sem spadajo struktura z izčrpanim QB iz Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) in Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), ki so vse skoraj enake njihovi celotni strukturi QB. Podroben pregled 3PRC je pokazal, da se molekule detergenta LDAO (lauril dimetil amin oksid) vežejo na vhodu v položaj QB, kar lahko prepreči prerazporeditev v zaprto konformacijo. Čeprav se LDAO ne razgradi na istem položaju v 1EYS ali 1OGV, so ti RC pripravljeni z uporabo istega detergenta in zato lahko povzročijo enak učinek. Kristalna struktura Rba. Zdi se, da ima tudi Sphaeroides RC, sokristaliziran s citokromom c2 (PDB ID: 1L9B), zaprto mesto QB. Vendar pa v tem primeru N-terminalna regija polipeptida RC-M (ki interagira z vezavnim mestom QB preko H vezi ostanka Tyr na Q vijačnici) sprejme nenaravno konformacijo in konformacijska sprememba QB ni bila podrobneje raziskana (30). Pomirjujoče je, da nismo opazili te vrste deformacije polipeptida M v strukturi RC-LH114-W, ki je skoraj enaka N-terminalni regiji RC-LH116 RC. Prav tako je treba opozoriti, da so bili po odstranitvi antene LH1 na osnovi detergenta apolipoproteinski RC v PDB raztopljeni, kar je odpravilo notranje kinonske bazene in lipide v vrzeli med RC in notranjo površino okoliškega obroča LH1 (31, 32). RC ostane funkcionalen, ker ohrani vse kofaktorje, razen razgradljivega QB kinona, ki je manj stabilen in se med postopkom priprave pogosto izgubi (33). Poleg tega je znano, da lahko odstranitev LH1 in naravnih cikličnih lipidov iz RC vpliva na funkcije, kot je skrajšana življenjska doba nabojno ločenega stanja P+QB (31, 34, 35). Zato domnevamo, da lahko obstoj lokalnega obroča LH1, ki obdaja RC, ohranja "zaprto" mesto QB in s tem ohranja lokalno okolje v bližini QB.
Čeprav apolipoprotein (brez QB kinona) in celotna struktura predstavljata le dva posnetka prometa mesta QB in ne vrste dogodkov, obstajajo znaki, da je mogoče vezavo omejiti, da se prepreči ponovna vezava s hidrokinonom, ki zavira inhibicijo substrata. Interakcija kinolola in kinona v bližini mesta QB apolipoproteina je lahko drugačna, kar vodi do njegove zavrnitve s strani RC. Že dolgo se domneva, da imajo konformacijske spremembe vlogo pri vezavi in ​​redukciji kinonov. Sposobnost zamrznjenih RC za redukcijo kinonov po adaptaciji na temo je oslabljena (36); rentgenska kristalografija kaže, da je ta poškodba posledica QB kinonov, ki so ujeti v "distalni" konformaciji približno 4,5 Å od aktivnega proksimalnega položaja (26, 37). Predlagamo, da je ta distalna vezavna konformacija posnetek vmesnega stanja med apolipoproteinom in polno obročasto strukturo, ki sledi začetni interakciji s kinonom in odprtju mesta QB.
Retikulum tipa II, ki ga najdemo v kompleksu PSII nekaterih fototrofnih bakterij in cianobakterij, alg in rastlin, ima strukturno in funkcionalno ohranjenost (38). Strukturna poravnava, prikazana na sliki 6 (D in E), poudarja podobnost med retikulumom PSII in mestom QB bakterijskega kompleksa RC. Ta primerjava je že dolgo model za preučevanje tesno povezanih sistemov vezave in redukcije kinonov. Prejšnje publikacije so nakazovale, da redukcija kinonov s PSII spremlja konformacijske spremembe (39, 40). Zato bi lahko glede na evolucijsko ohranjenost RC ta prej neopaženi mehanizem vezave veljal tudi za mesto QB retikuluma PSII v oksigeniranih fototrofnih rastlinah.
Sevi Rps ΔpufW (neoznačena delecija pufW) in PufW-His (C-terminalni 10x His-označen protein-W, izražen iz naravnega lokusa pufW). Sev palustris CGA009 je bil opisan v našem prejšnjem delu (16). Te seve in izogeni starš divjega tipa smo iz zamrzovalnika izvlekli z nanosom majhnega števila celic na ploščo PYE (vsaka 5 g liter -1) (shranjeno v LB pri -80 °C, ki vsebuje 50 % (m/v) glicerolnega) proteina, kvasnega ekstrakta in sukcinatnega) agarja [1,5 % (m/v)]. Ploščo smo inkubirali čez noč v temi pri sobni temperaturi v anaerobnih pogojih in nato osvetljevali z belo svetlobo (~50 μmolm-2 s-1), ki so jo zagotavljale halogenske žarnice OSRAM 116-W (RS Components, Združeno kraljestvo), 3 do 5 dni, dokler se ni pojavila ena sama kolonija. Za inokulacijo 10 ml gojišča M22+ (41), dopolnjenega z 0,1 % (m/v) kazeaminokislin (v nadaljevanju M22), je bila uporabljena ena sama kolonija. Kultura je bila gojena v pogojih nizke vsebnosti kisika v temi pri 34 °C s stresanjem pri 180 vrt/min 48 ur, nato pa je bilo 70 ml kulture inokuliranih pod enakimi pogoji 24 ur. Za inokulacijo 30 ml gojišča M22 v 30 ml univerzalni prozorni steklenički z navojnim zamaškom je bila uporabljena pol-aerobna kultura s prostornino 1 ml in je bila obsevana z mešanjem (~50 μmolm-2 s-1) 48 ur s sterilno magnetno mešalno palico. Nato je bilo 30 ml kulture inokuliranih s približno 1 litrom kulture pod enakimi pogoji, ki je bila nato uporabljena za inokulacijo približno 9 litrov kulture, osvetljene s ~200 μmolm-2 s-1 72 ur. Celice smo pobrali s centrifugiranjem pri 7132 RCF 30 minut, resuspendirali v ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0) in shranili pri -20 °C do potrebe.
Po odtajanju smo resuspendiranim celicam dodali nekaj kristalov deoksiribonukleaze I (Merck, Združeno kraljestvo), lizocima (Merck, Združeno kraljestvo) in dve tableti zaviralca proteaze holoenzima Roche (Merck, Združeno kraljestvo). V francoski tlačni celici s tlakom 20.000 psi (Aminco, ZDA) smo celice 8- do 12-krat razdrli. Po odstranitvi nerazdrobljene celice in netopnih ostankov s centrifugiranjem pri 18.500 RCF 15 minut pri 4 °C smo membrano oborili iz pigmentiranega lizata s centrifugiranjem pri 113.000 RCF 2 uri pri 43.000 °C. Topno frakcijo smo zavrgli in obarvano membrano resuspendirali v 100 do 200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0) ter homogenizirali, dokler ni več vidnih agregatov. Suspendirano membrano smo inkubirali v 20 mM tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, ZDA), ki je vseboval 2 % (m/v) β-DDM, 1 uro v temi pri 4 °C ob rahlem mešanju. Nato smo centrifugirali pri 70 °C, da smo raztopili 150.000 RCF pri 4 °C 1 uro in odstranili preostale netopne snovi.
Solubilizacijsko membrano iz seva ΔpufW smo nanesli na 50 ml DEAE Sepharose ionsko izmenjevalno kolono s tremi prostorninami kolone (CV) vezavnega pufra [20 mM tris-HCl (pH 8,0), ki vsebuje 0,03 % (m/v) β-DDM]. Kolono smo sprali z dvema vezavnima pufroma CV in nato še z dvema vezavnima pufroma, ki vsebujeta 50 mM NaCl. Kompleks RC-LH116 smo eluirali z linearnim gradientom od 150 do 300 mM NaCl (v vezavnem pufru) pri 1,75 CV, preostali vezavni kompleks pa smo eluirali z vezavnim pufrom, ki vsebuje 300 mM NaCl pri 0,5 CV. Zbrali smo absorpcijski spekter med 250 in 1000 nm, frakcijo z razmerjem absorbance (A880/A280) večjim od 1 pri 880 do 280 nm, jo ​​dvakrat razredčili v vezavnem pufru in ponovili isti postopek na DEAE koloni pri čiščenju. Frakcije z razmerji A880/A280 višjimi od 1,7 in razmerji A880/A805 višjimi od 3,0 razredčimo, izvedemo tretji krog ionske izmenjave in ohranimo frakcije z razmerji A880/A280 višjimi od 2,2 in razmerji A880/A805 višjimi od 5,0. Delno prečiščen kompleks smo koncentrirali na ~2 ml v centrifugalnem filtru Amicon 100.000 z mejno vrednostjo molekulske mase (MWCO) (Merck, Združeno kraljestvo) in naložili na izključitveno kolono Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, ZDA), ki je vsebovala 200 mM NaCl pufer, nato pa eluirali v istem pufru pri 1,5 CV. Zberite absorpcijske spektre frakcije izključitve velikosti in jih koncentrirajte z razmerji A880/A280 nad 2,4 in razmerji A880/A805 nad 5,8 do 100 A880 ter jih takoj uporabite za pripravo ali shranjevanje mreže s krio-TEM. Hranite pri -80 °C, dokler jih ne potrebujete.
Solubilizacijsko membrano iz seva PufW-His smo nanesli na 20 ml kolono HisPrep FF Ni-NTA Sepharose (20 mM tris-HCl (pH 8,0) z 200 mM NaCl in 0,03 % (m/m)) v pufru IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM]. Kolono smo sprali s petimi CV pufra IMAC in nato s petimi CV pufra IMAC, ki je vseboval 10 mM histidina. Jedrni kompleks smo eluirali iz kolone s petimi pufri IMAC, ki so vsebovali 100 mM histidina. Frakcijo, ki je vsebovala kompleks RC-LH114-W, smo koncentrirali na ~10 ml v mešalni posodi, opremljeni s filtrom Amicon 100.000 MWCO (Merck, Združeno kraljestvo), 20-krat razredčili z vezavnim pufrom in nato dodali 25 ml. V koloni DEAE Sepharose smo vnaprej uporabili štiri CV, vezane na pufer. Kolono speremo s štirimi vezavnimi pufri za CV, nato kompleks eluiramo na osmih CV-jih z linearnim gradientom od 0 do 100 mM NaCl (v vezavnem pufru), preostale štiri CV-je pa vsebujejo 100 mM vezavni pufer. Preostali kompleksi, eluirani na natrijevem kloridu, v kombinaciji z razmerjem A880/A280 višjim od 2,4 in razmerjem A880/A805 višjim od 4,6, smo koncentrirali na ~2 ml v centrifugalnem filtru Amicon 100.000 MWCO in napolnili z 1,5 CV IMAC vnaprej s pufrom uravnoteženo kolono za izključitev velikosti Superdex 200 16/600 in nato eluirali v istem pufru v 1,5 CV. Zberite absorpcijske spektre frakcij z izključitvijo velikosti in koncentrirajte absorpcijske spektre z razmerji A880/A280 nad 2,1 in razmerji A880/A805 nad 4,6 do 100 A880, ki jih takoj uporabite za pripravo zamrznjene TEM mreže ali shranite pri -80 °C do potrebe.
Za pripravo nizkotemperaturnih TEM mrež je bil uporabljen potopni zamrzovalnik Leica EM GP. Kompleks je bil razredčen v pufru IMAC na A880 50, nato pa je bilo 5 μl nanesenih na novo žarilno razelektreno bakreno mrežo QUANTIFOIL 1.2/1.3 z ogljikom (Agar Scientific, Združeno kraljestvo). Mrežo smo inkubirali pri 20 °C in 60 % relativni vlažnosti 30 sekund, nato jo 3 sekunde popivnali in nato ohladili v tekočem etanu pri -176 °C.
Podatki kompleksa RC-LH114-W so bili posneti na eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) z mikroskopom Titan Krios, ki deluje pri pospeševalni napetosti 300 kV, z nominalno povečavo 130.000× in energijo - Izberite vrzel 20 eV. Za snemanje slik v načinu štetja in zbiranje podatkov je bil uporabljen Gatan 968 GIF Quantum z detektorjem vrhov K2. Kalibrirana velikost slikovne pike je 1,048 Å, hitrost doze pa 3,83 e-Å-2s-1. Film je bil zbran v 11 sekundah in razdeljen na 40 delov. Za ponovno fokusiranje mikroskopa je bilo uporabljeno območje, prevlečeno z ogljikom, nato pa so bili zbrani trije filmi na luknjo. Skupno je bilo zbranih 3130 filmov z vrednostmi defokusiranja med -1 in -3 μm.
Podatki za kompleks RC-LH116 so bili zbrani z istim mikroskopom v laboratoriju za biostrukturo Asterbury (Univerza v Leedsu, Združeno kraljestvo). Podatki so bili zbrani v načinu štetja s povečavo 130 k, velikost slikovnih pik pa je bila kalibrirana na 1,065 Å z odmerkom 4,6 e-Å-2s-1. Film je bil posnet v 12 sekundah in razdeljen na 48 delov. Skupaj je bilo zbranih 3359 filmov z vrednostmi defokusiranja med -1 in -3 μm.
Vsa obdelava podatkov se izvaja v cevovodu Relion 3.0 (42). Za korekcijo gibanja žarka z utežmi odmerka uporabite Motioncorr 2 (43), nato pa uporabite CTFFIND 4.1 (44) za določitev parametra CTF (prenosna funkcija kontrasta). Tipične fotomikrografije po teh začetnih fazah obdelave so prikazane na sliki 2. S16. Predloga za samodejno izbiro se ustvari z ročno izbiro približno 250 slikovnih pik 1000 delcev v 250-pikselnem okvirju in brez referenčne dvodimenzionalne (2D) klasifikacije, s čimer se zavrnejo tiste klasifikacije, ki ustrezajo kontaminaciji vzorca ali nimajo opaznih značilnosti. Nato je bila na vseh mikrofotografijah izvedena samodejna izbira, RC-LH114-W pa je vseboval 849.359 delcev, kompleks RC-LH116 pa 476.547 delcev. Vsi izbrani delci so bili podvrženi dvema krogoma nereferenčne 2D klasifikacije, po vsakem postopku pa so delci, ki ustrezajo območju ogljika, kontaminaciji vzorca, nimajo očitnih značilnosti ali se močno prekrivajo, zavrnjeni, kar pomeni 772.033 (90,9 %) oziroma 359.678 (75,5 %) delcev. Za 3D klasifikacijo RC-LH114-W oziroma RC-LH116 se uporabi 3D klasifikacija delcev. Začetni 3D referenčni model je bil ustvarjen z metodo stohastičnega gradientnega spuščanja. Z uporabo začetnega modela kot reference so izbrani delci v 3D razvrščeni v štiri kategorije. Z uporabo modela v tej kategoriji kot reference se izvede 3D izpopolnjevanje delcev v največji kategoriji, nato se z začetnim 15 Å nizkoprepustnim filtrom pokrije območje topila, doda 6 slikovnih pik mehkih robov in slikovne pike se naknadno obdelajo, da se popravi prenosna funkcija modulacije vrha Gatan K2 zgornjega detektorja. Za nabor podatkov RC-LH114-W je bil ta začetni model spremenjen z odstranitvijo močne gostote na robovih maske (ki je ločena od gostote jedrnega kompleksa v UCSF Chimera). Nastali modeli (ločljivosti RC-LH114-W in RC-LH116 sta 3,91 oziroma 4,16 Å) se uporabljajo kot referenca za drugi krog 3D-razvrstitve. Uporabljeni delci so združeni v začetni 3D-razred in ne vsebujejo močne korelacije s sosesko. Prekrivanje ali pomanjkanje očitnih strukturnih značilnosti. Po drugem krogu 3D-razvrstitve je bila izbrana kategorija z najvišjo ločljivostjo [Za RC-LH114-W je ena kategorija 377.703 delcev (44,5 %), za RC-LH116 pa sta dve kategoriji, ki skupaj znašata 260.752 delcev (54,7 %), kjer sta enaki le, ko sta po začetnem vrtenju poravnani z majhno razliko]. Izbrani delci so ponovno ekstrahirani v 400-pikselnem polju in prečiščeni s 3D-prečiščevanjem. Maska topila je ustvarjena z uporabo začetnega 15 Å nizkoprepustnega filtra, 3-pikselne razširitve zemljevida in 3-pikselne mehke maske. Z uporabo prečiščevanja CTF na delec, korekcije gibanja na delec in drugega kroga prečiščevanja CTF na delec se po vsakem koraku izvede 3D-prečiščevanje, maskiranje topila in naknadna obdelava za nadaljnje prečiščevanje nastale teksture. Z uporabo mejne vrednosti FSC (Fourierjev korelacijski koeficient lupine) 0,143 sta ločljivosti končnih modelov RC-LH114-W in RC-LH116 2,65 oziroma 2,80 Å. Krivulja FSC končnega modela je prikazana na sliki 2. S17.
Vsa proteinska zaporedja so prenesena iz UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProt ID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). Za konstrukcijo homolognega modela RC je bil uporabljen SWISS-MODEL (45), ki vsebuje proteinska zaporedja RC-L, RC-M in RC-H, kristalno strukturo Rba. sphaeroides RC pa je bil uporabljen kot predloga (PDB ID: 5LSE) (46). Z orodjem »fit map« v programu UCSF Chimera prilagodite ustvarjeni model zemljevidu (47), izboljšajte strukturo beljakovin in dodajte kofaktor [4×BChl a (ime ostanka v knjižnici monomerov = BCL), 2×BPh a (BPH), eno ali dve vrsti UQ10 (U10), en nehemski železov amonijum (Fe) in en 3,4-dihidroheksakarbonilholin (QAK)] s pomočjo Coota (48). Ker QAK ni na voljo v knjižnici monomerov, je bil parametriziran z orodjem eLBOW v programu PHENIX (49).
Nato je bila konstruirana podenota LH1. Sprva je bilo orodje za samodejno konstruiranje v programu PHENIX (49) uporabljeno za samodejno konstruiranje dela zaporedja LH1 z uporabo zemljevida in zaporedij proteinov LH1-α in LH1-β kot vhodnih podatkov. Izberite najpopolnejšo podenoto LH1, jo ekstrahirajte in naložite v Coot, ročno dodajte manjkajoče zaporedje in ročno izboljšajte celotno strukturo, preden dodate dva BCl a (BCL) in spiriloksantin (CRT) [glede na ustrezno gostoto kompleksa LH1 in znano vsebnost karotenoidov. Vrsta (17)]. Kopirajte celotno podenoto LH1 in z orodjem UCSF Chimera »Docking Map Tool« pritrdite sosednje nemodelno območje gostote LH1 ter ga nato izboljšajte v programu Coot; postopek ponavljajte, dokler niso modelirane vse podenote LH1. Za strukturo RC-LH114-W se z ekstrakcijo nedodeljene gostote v Cootu protein segmentira od preostalih neproteinskih komponent na zemljevidu USCF Chimera, orodje Autobuild pa se uporabi za vzpostavitev začetnega modela in modeliranja preostalih podenot (protein-W). V PHENIX (49). Nastalemu modelu v Cootu (48) dodajte vsa manjkajoča zaporedja in nato ročno izboljšajte celotno podenoto. Preostala nedodeljena gostota ustreza kombinaciji lipidov (ID knjižnice monomerov PDB CDL = CDL, POPC = 6PL in POPG = PGT), detergenta β-DDM (LMT) in molekul UQ10 (U10). Z optimizacijo PHENIX (49) in ročno optimizacijo v Cootu (48) izpopolnite celoten začetni model, dokler statistike modela in vizualne kakovosti prilagajanja ni mogoče dodatno izboljšati. Na koncu uporabite LocScale (50) za izostritev lokalnega zemljevida in nato izvedite več drugih ciklov modeliranja nedodeljene gostote ter samodejno in ročno optimizacijo.
Posamezni peptidi, kofaktorji in drugi lipidi ter kinoni, povezani znotraj njihovih ustreznih gostot, so prikazani na slikah 1 in 2. S18 do S23. Statistični podatki končnega modela so prikazani v tabeli S1.
Če ni drugače navedeno, so bili absorpcijski spektri UV/Vis/NIR zbrani na spektrofotometru Cary60 (Agilent, ZDA) v intervalih 1 nm od 250 nm do 1000 nm in s časom integracije 0,1 s.
Vzorec razredčimo v kvarčni kiveti z 2 mm potjo do A880 1 in zberemo absorpcijski spekter med 400 in 1000 nm. Krožni dikroični spektri so bili zbrani na spektropolarimetru Jasco 810 (Jasco, Japonska) v intervalih 1 nm med 400 nm in 950 nm s hitrostjo skeniranja 20 nm min-1.
Molarni ekstinkcijski koeficient se določi z redčenjem jedrnega kompleksa na A880 približno 50. 10 μl prostornine razredčimo v 990 μl vezavnega pufra ali metanola in takoj zberemo absorpcijski spekter, da zmanjšamo razgradnjo BChl. Vsebnost BChl v vsakem vzorcu metanola je bila izračunana z ekstinkcijskim koeficientom pri 771 nm 54,8 mM-1 cm-1 in določen je bil ekstinkcijski koeficient (51). Izmerjeno koncentracijo BChl delimo s 32 (RC-LH114-W) ali 36 (RC-LH116), da določimo koncentracijo jedrnega kompleksa, ki se nato uporabi za določitev absorpcijskega spektra istega vzorca, zbranega v pufru. Ekstinkcijski koeficient. Za vsak vzorec so bile opravljene tri ponovljene meritve, za izračun pa je bila uporabljena povprečna absorbanca maksimuma BChl Qy. Ekstinkcijski koeficient RC-LH114-W, izmerjen pri 878 nm, je 3280±140 mM-1 cm-1, medtem ko je ekstinkcijski koeficient RC-LH116, izmerjen pri 880 nm, 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 je bil kvantificiran po metodi v (52). Skratka, HPLC z reverzno fazo (RP-HPLC) je bila izvedena z uporabo sistema Agilent 1200 HPLC. Raztopite približno 0,02 nmol RC-LH116 ali RC-LH114-W v 50 μl 50:50 metanola:kloroforma, ki vsebuje 0,02 % (m/v) železovega klorida, in injicirajte predhodno uravnoteženo Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm. Raztopite v 1 ml-1 min-1 pri 40 °C v topilu HPLC (80:20 metanol:2-propanol) na kolono ×25 cm. Izvedite izokratsko elucijo v topilu HPLC za spremljanje absorbance pri 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoidi) in 780 nm (BChl) 1 uro. Integriran je bil vrh na kromatogramu pri 275 nm pri 25,5 minuti, ki ni vseboval nobenih drugih zaznavnih spojin. Integrirana površina se uporabi za izračun molske količine ekstrahiranega UQ10 s sklicevanjem na umeritveno krivuljo, izračunano z injiciranjem čistih standardov od 0 do 5,8 nmol (slika S14). Vsak vzorec je bil analiziran v treh ponovitvah, zabeležena napaka pa ustreza standardnemu odklonu povprečja.
Raztopino, ki je vsebovala kompleks RC-LH1 z največjo absorpcijo Qy 0,1, smo pripravili s 30 μM reduciranega citokroma c2 iz konjskega srca (Merck, Združeno kraljestvo) in od 0 do 50 μMUQ2 (Merck, Združeno kraljestvo). Pri vsaki koncentraciji UQ2 smo pripravili tri 1-mililitrske vzorce in jih inkubirali čez noč v temi pri 4 °C, da smo zagotovili popolno prilagoditev na temo pred meritvijo. Raztopino smo naložili v modularni spektrofotometer OLIS RSM1000, opremljen z rešetko plamena 300 nm/500 linij, 1,24 mm vhodnimi, 0,12 mm srednjimi in 0,6 mm izhodnimi režami. Na vhodu vzorčne fotocevke in referenčne fotopomnoževalne cevi je nameščen 600 nm dolg prepustni filter, da se izključi vzbujevalna svetloba. Absorbanca je bila spremljana pri 550 nm z integracijskim časom 0,15 s. Vzbujevalna svetloba se oddaja iz 880 nm M880F2 LED (svetleča dioda) (Thorlabs Ltd., Združeno kraljestvo) preko optičnega kabla z 90 % intenzivnostjo preko krmilnika DC2200 (Thorlabs Ltd., Združeno kraljestvo) in se oddaja proti viru svetlobe pod kotom 90°. Merilni žarek je usmerjen nasproti zrcalu, da vrne morebitno svetlobo, ki je vzorec sprva ni absorbiral. Absorbanco spremljajte 10 sekund pred osvetlitvijo 50 sekund. Nato se absorbanca dodatno spremlja 60 sekund v temi, da se oceni, v kolikšni meri kinolol spontano reducira citokrom c23+ (glejte sliko S8 za surove podatke).
Podatki so bili obdelani z linearno začetno hitrostjo v območju od 0,5 do 10 s (odvisno od koncentracije UQ2) in povprečenjem hitrosti vseh treh vzorcev pri vsaki koncentraciji UQ2. Koncentracija RC-LH1, izračunana z ustreznim koeficientom ekstinkcije, je bila uporabljena za pretvorbo hitrosti v katalitično učinkovitost, prikazano v programu Origin Pro 2019 (OriginLab, ZDA) in prilagojeno modelu Michaelis-Menten za določitev navideznih vrednosti Km in Kcat.
Za meritve prehodne absorpcije je bil vzorec RC-LH1 razredčen na ~2 μM v pufru IMAC, ki je vseboval 50 mM natrijevega askorbata (Merck, ZDA) in 0,4 mM terbutina (Merck, ZDA). Askorbinska kislina se uporablja kot žrtveni donor elektronov, tert-butaklofen pa kot zaviralec QB, da se zagotovi, da glavni donor RC ostane reduciran (torej ne fotooksidiran) skozi celoten postopek merjenja. Približno 3 ml vzorca se doda v prilagojeno rotirajočo celico (s premerom približno 0,1 m, 350 vrt/min) z dolžino optične poti 2 mm, da se zagotovi, da ima vzorec v laserski poti dovolj časa za prilagoditev na temo med vzbujevalnimi impulzi. Za ojačanje laserskega sistema Ti:Sapphire (Spectra Physics, ZDA) se uporabijo laserski impulzi ~100 fs, da se vzorec vzbudi pri 880 nm s frekvenco ponovitve 1 kHz (20 nJ za NIR ali 100 nJ za Vis). Pred zbiranjem podatkov se vzorec izpostavi vzbujevalni svetlobi približno 30 minut. Izpostavljenost bo povzročila inaktivacijo QA (morda se bo QA zmanjšala enkrat ali dvakrat). Vendar upoštevajte, da je ta proces reverzibilen, saj se bo RC po dolgem obdobju prilagajanja na temo počasi vrnil k aktivnosti QA. Za merjenje prehodnih spektrov z zakasnitvijo od -10 do 7000 ps je bil uporabljen spektrometer Helios (Ultrafast Systems, ZDA). Za razdruževanje naborov podatkov, nato združevanje in standardizacijo uporabite programsko opremo Surface Xplorer (Ultrafast Systems, ZDA). Za uporabo združenega nabora podatkov za pridobitev diferencialnih spektrov, povezanih z razpadom, uporabite programski paket CarpetView (Light Conversion Ltd., Litva) ali pa funkcijo, ki združuje več eksponentov z odzivom instrumenta, da se prilagodi spektralni evoluciji ene valovne dolžine v programu Origin (OriginLab, ZDA).
Kot je bilo že omenjeno (53), je bil pripravljen fotosintetski film, ki je vseboval kompleks LH1, ki mu ni bilo tako RC kot periferne antene LH2. Membrana je bila razredčena v 20 mM tris (pH 8,0) in nato naložena v kremenovo kiveto z 2 mm optično potjo. Za vzbujanje vzorca pri 540 nm je bil uporabljen laserski impulz 30 nJ z zakasnitvijo od -10 do 7000 ps. Nabor podatkov je bil obdelan, kot je opisano za vzorec Rps.pal.
Membrana je bila peletirana s centrifugiranjem pri 150.000 RCF 2 uri pri 4 °C, nato pa je bila njena absorbanca pri 880 nm resuspendirana v 20 mM tris-HCl (pH 8,0) in 200 mM NaCl. Membrana je bila raztopina s počasnim mešanjem v 2 % (m/v) β-DDM 1 uro v temi pri 4 °C. Vzorec je bil razredčen v 100 mM trietilamonijevem karbonatu (pH 8,0) (TEAB; Merck, Združeno kraljestvo) do koncentracije beljakovin 2,5 mg ml-1 (analiza Bio-Rad). Nadaljnja obdelava je bila izvedena po predhodno objavljeni metodi (54), začenši z redčenjem 50 μg beljakovin v skupno 50 μl TEAB, ki je vseboval 1 % (m/v) natrijevega lavrata (Merck, Združeno kraljestvo). Po 60 sekundah sonikacije smo vzorec reducirali s 5 mM tris(2-karboksietil)fosfinom (Merck, Združeno kraljestvo) pri 37 °C 30 minut. Za S-alkilacijo smo vzorec inkubirali z 10 mM metil S-metiltiometansulfonatom (Merck, Združeno kraljestvo) in ga dodali iz 200 mM osnovne raztopine izopropanola 10 minut pri sobni temperaturi. Proteolitična razgradnja je bila izvedena z dodatkom 2 μg mešanice tripsina/endoproteinaze Lys-C (Promega, Združeno kraljestvo) in inkubirana pri 37 °C 3 ure. Lavratni surfaktant smo ekstrahirali z dodatkom 50 μl etil acetata in 10 μl 10 % (v/v) trifluoroocetne kisline (TFA; Thermo Fisher Scientific, Združeno kraljestvo) ter mešali v vrtincu 60 sekund. Fazno ločevanje smo pospešili s centrifugiranjem pri 15.700 RCF 5 minut. V skladu s protokolom proizvajalca je bila za previdno aspiracijo in razsolitev spodnje faze, ki je vsebovala peptid, uporabljena spinska kolona C18 (Thermo Fisher Scientific, Združeno kraljestvo). Po sušenju z vakuumskim centrifugiranjem je bil vzorec raztopljen v 0,5 % TFA in 3 % acetonitrilu, 500 ng pa je bilo analiziranih z nanoflow RP kromatografijo v povezavi z masno spektrometrijo z uporabo sistemskih parametrov, podrobno opisanih prej.
Za identifikacijo in kvantifikacijo beljakovin uporabite MaxQuant v.1.5.3.30 (56) za iskanje v podatkovni bazi proteomov Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Podatki o proteomiki masne spektrometrije so bili deponirani v zavezništvu ProteomeXchange prek partnerskega repozitorija PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) pod identifikatorjem nabora podatkov PXD020402.
Za analizo z RPLC v povezavi z masno spektrometrijo z elektrosprejno ionizacijo je bil kompleks RC-LH1 pripravljen iz divjega tipa Rps. Z uporabo predhodno objavljene metode (16) je bila koncentracija beljakovin, proizvedenih v celicah palustris, 2 mg ml-1 v 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl in 0,03 % (m/v) β- (analiza Bio-Rad) DDM. V skladu s protokolom proizvajalca je bil za ekstrakcijo 10 μg beljakovin uporabljen komplet za 2D čiščenje (GE Healthcare, ZDA) in oborina raztopljena v 20 μl 60 % (v/v) mravljinčne kisline (FA), 20 % (v/v) acetonitrila in 20 % (v/v) vode. Pet mikrolitrov je bilo analiziranih z RPLC (Dionex RSLC) v povezavi z masno spektrometrijo (Maxis UHR-TOF, Bruker). Za ločevanje pri 60 °C in 100 μl min -1 uporabite kolono MabPac 1,2 × 100 mm (Thermo Fisher Scientific, Združeno kraljestvo) z gradientom od 85 % (v/v) topila A [0,1 % (v/v) FA in 0,02 % (V/v) vodne raztopine TFA] do 85 % (v/v) topila B [0,1 % (v/v) FA in 0,02 % (v/v) v 90 % (v/v) acetonitrilu TFA]. Z uporabo standardnega vira elektrosprejne ionizacije in privzetih parametrov za več kot 60 minut masni spektrometer doseže od 100 do 2750 m/z (razmerje med maso in nabojem). S pomočjo orodja FindPept na portalu bioinformatičnih virov ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/) preslikajte masni spekter na podenote kompleksa.
Celice smo gojili 72 ur pod 100 ml NF-nizke (10 μMm-2 s-1), srednje (30 μMm-2 s-1) ali visoke (300 μMm-2 s-1) svetlobe. Medij M22 (medij M22, v katerem je amonijev sulfat izpuščen in je natrijev sukcinat nadomeščen z natrijevim acetatom) v 100 ml steklenički z navojnim zamaškom (23). V petih 30-sekundnih ciklih smo dodajali 0,1-mikronske steklene kroglice v volumskem razmerju 1:1 za lizo celic in jih 5 minut hladili na ledu. Netopno snov, nerazbite celice in steklene kroglice smo odstranili s centrifugiranjem pri 16.000 RCF 10 minut v namizni mikrocentrifugi. Membrana je bila ločena v rotorju Ti 70.1 s 100.000 RCF v 20 mM tris-HCl (pH 8,0) s 40/15% (m/m) gradientom saharoze 10 ur.
Kot je opisano v našem prejšnjem delu, imunodetekcija His oznake na PufW (16). Skratka, prečiščen jedrni kompleks (11,8 nM) ali membrana, ki vsebuje enako koncentracijo RC (določeno z oksidacijo, odštevanjem reduciranega diferenčnega spektra in ujemanjem obremenitve na obarvanem gelu) v 2x SDS nalagalnem pufru (Merck, Združeno kraljestvo), dvakrat razredčenem. Proteine ​​smo ločili na replikacijskem 12% bis-tris NuPage gelu (Thermo Fisher Scientific, Združeno kraljestvo). Gel smo obarvali s Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Združeno kraljestvo) za nanos in vizualizacijo podenote RC-L. Protein na drugem gelu smo prenesli na metanolno aktivirano poliviniliden fluoridno (PVDF) membrano (Thermo Fisher Scientific, Združeno kraljestvo) za imunološki test. PVDF membrano smo blokirali v 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2 % (v/v) Tween-20 in 5 % (m/v) posnetem mleku v prahu, nato pa jo 4 ure inkubirali s primarnim protitelesom proti His (v pufru za razredčenje protiteles [50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl in 0,05 % (v/v) Tween-20] v razmerju 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, ZDA]. Po trikratnem 5-minutnem izpiranju v protitelesnem pufru smo membrano združili s sekundarnim protitelesom proti mišji hrenovi peroksidazi (Sigma-Aldrich, Združeno kraljestvo) (razredčeno 1:10.000 v protitelesnem pufru). Inkubirali smo, da smo omogočili detekcijo (5 minut po treh izpiranjih v protitelesnem pufru) z uporabo kemiluminiscenčnega substrata WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Italija) in Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Združeno kraljestvo).
Z risanjem porazdelitve intenzivnosti vsakega obarvanega gela ali imunološke proge, integracijo površine pod vrhom in izračunom razmerja intenzivnosti RC-L (obarvan gel) in protein-W (imunski test) v programu ImageJ (57) obdelajte sliko. Ta razmerja so bila pretvorjena v molska razmerja s predpostavko, da je razmerje med RC-L in protein-W v čistem vzorcu RC-LH114-W 1:1, in ustrezno normaliziranjem celotnega nabora podatkov.
Za dodatno gradivo k temu članku glejte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
To je članek z odprtim dostopom, distribuiran pod pogoji licence Creative Commons Attribution. Članek dovoljuje neomejeno uporabo, distribucijo in reprodukcijo v katerem koli mediju pod pogojem, da je izvirno delo pravilno citirano.
Opomba: Prosimo vas, da navedete svoj e-poštni naslov le zato, da oseba, ki jo priporočite strani, ve, da želite, da vidi e-pošto in da ne gre za neželeno pošto. E-poštnih naslovov ne bomo zbirali.
To vprašanje se uporablja za preverjanje, ali ste obiskovalec, in za preprečevanje samodejnega pošiljanja neželene pošte.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Visokoločljivostna struktura kompleksa svetlobne pasti 1 v reakcijskem centru ponuja nov vpogled v dinamiko kinonov.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Visokoločljivostna struktura kompleksa svetlobne pasti 1 v reakcijskem centru ponuja nov vpogled v dinamiko kinonov.
©2021 Ameriško združenje za napredek znanosti. vse pravice pridržane. AAAS je partner HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef in COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.