Članek je del raziskovalne teme »Napredne tehnologije bioremediacije in postopki recikliranja sintetičnih organskih spojin (SOC)«. Oglejte si vseh 14 člankov.
Nizkomolekularni policiklični aromatski ogljikovodiki (PAH), kot so naftalen in substituirani naftaleni (metilnaftalen, naftojska kislina, 1-naftil-N-metilkarbamat itd.), se pogosto uporabljajo v različnih panogah in so genotoksični, mutageni in/ali kancerogeni za organizme. Te sintetične organske spojine (SOC) ali ksenobiotiki veljajo za prednostna onesnaževala in predstavljajo resno grožnjo za globalno okolje in javno zdravje. Intenzivnost človeških dejavnosti (npr. uplinjanje premoga, rafiniranje nafte, emisije vozil in kmetijska uporaba) določa koncentracijo, usodo in transport teh vseprisotnih in obstojnih spojin. Poleg fizikalnih in kemičnih metod obdelave/odstranjevanja so se kot varna, stroškovno učinkovita in obetavna alternativa pojavile tudi zelene in okolju prijazne tehnologije, kot je bioremediacija, ki uporablja mikroorganizme, ki so sposobni popolnoma razgraditi POC ali jih pretvoriti v nestrupene stranske produkte. Različne bakterijske vrste, ki spadajo v debla Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia in Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus in Paenibacillus) in Actinobacteria (Rhodococcus in Arthrobacter) v talni mikrobioti, so pokazale sposobnost razgradnje različnih organskih spojin. Presnovne študije, genomika in metagenomska analiza nam pomagajo razumeti katabolno kompleksnost in raznolikost, ki je prisotna v teh preprostih življenjskih oblikah, kar lahko nadalje uporabimo za učinkovito biorazgradnjo. Dolgoročni obstoj PAH je privedel do pojava novih fenotipov razgradnje s horizontalnim prenosom genov z uporabo genetskih elementov, kot so plazmidi, transpozoni, bakteriofagi, genomski otoki in integrativni konjugativni elementi. Sistemska biologija in gensko inženirstvo specifičnih izolatov ali modelnih združb (konzorcijev) lahko omogočita celovito, hitro in učinkovito bioremediacijo teh PAH s sinergističnimi učinki. V tem pregledu se osredotočamo na različne presnovne poti in raznolikost, genetsko sestavo in raznolikost ter celične odzive/prilagoditve bakterij, ki razgrajujejo naftalen in substituirani naftalen. To bo zagotovilo ekološke informacije za uporabo na terenu in optimizacijo sevov za učinkovito bioremediacijo.
Hiter razvoj industrij (petrokemija, kmetijstvo, farmacija, tekstilna barvila, kozmetika itd.) je prispeval k svetovni gospodarski blaginji in izboljšanju življenjskega standarda. Ta eksponentni razvoj je povzročil proizvodnjo velikega števila sintetičnih organskih spojin (SOC), ki se uporabljajo za proizvodnjo različnih izdelkov. Te tuje spojine ali SOC vključujejo policiklične aromatske ogljikovodike (PAH), pesticide, herbicide, mehčala, barvila, farmacevtske izdelke, organofosfate, zaviralce gorenja, hlapna organska topila itd. Izpuščajo se v ozračje, vodne in kopenske ekosisteme, kjer imajo večdimenzionalne učinke in povzročajo škodljive učinke na različne biooblike s spreminjanjem fizikalno-kemijskih lastnosti in strukture združb (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Številna aromatska onesnaževala imajo močan in uničujoč vpliv na številne nedotaknjene ekosisteme/vroče točke biotske raznovrstnosti (npr. koralni grebeni, arktične/antarktične ledene plošče, visokogorska jezera, globokomorski sedimenti itd.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Nedavne geomikrobiološke študije so pokazale, da odlaganje sintetičnih organskih snovi (npr. aromatskih onesnaževal) in njihovih derivatov na površinah umetnih struktur (grajeno okolje) (npr. območja kulturne dediščine in spomeniki iz granita, kamna, lesa in kovine) pospešuje njihovo razgradnjo (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Človeške dejavnosti lahko zaradi onesnaženosti zraka in podnebnih sprememb okrepijo in poslabšajo biološko razgradnjo spomenikov in stavb (Liu et al. 2020). Ti organski onesnaževalci reagirajo z vodno paro v ozračju in se usedejo na strukturo, kar povzroča fizikalno in kemično razgradnjo materiala. Biorazgradnja je splošno prepoznana kot neželene spremembe videza in lastnosti materialov, ki jih povzročajo živi organizmi in vplivajo na njihovo ohranitev (Pochon in Jaton, 1967). Nadaljnje mikrobno delovanje (presnova) teh spojin lahko zmanjša strukturno celovitost, učinkovitost ohranjanja in kulturno vrednost (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). Po drugi strani pa se je v nekaterih primerih izkazalo, da je mikrobna prilagoditev in odziv na te strukture koristna, saj tvorijo biofilme in druge zaščitne skorje, ki zmanjšujejo hitrost propadanja/razgradnje (Martino, 2016). Zato razvoj učinkovitih dolgoročnih trajnostnih strategij ohranjanja kamnitih, kovinskih in lesenih spomenikov zahteva temeljito razumevanje ključnih procesov, ki so vključeni v ta proces. V primerjavi z naravnimi procesi (geološki procesi, gozdni požari, vulkanski izbruhi, rastlinske in bakterijske reakcije) človeške dejavnosti povzročajo sproščanje velikih količin policikličnih aromatskih ogljikovodikov (PAH) in drugega organskega ogljika (OC) v ekosisteme. Številni PAH, ki se uporabljajo v kmetijstvu (insekticidi in pesticidi, kot so DDT, atrazin, karbaril, pentaklorofenol itd.), industriji (surova nafta, oljni mulji/odpadki, plastika, pridobljena iz nafte, PCB-ji, mehčala, detergenti, razkužila, fumiganti, dišave in konzervansi), izdelkih za osebno nego (kreme za sončenje, razkužila, repelenti za žuželke in policiklični mošusi) in strelivu (eksplozivi, kot je 2,4,6-TNT), so potencialni ksenobiotiki, ki lahko vplivajo na zdravje planeta (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna in Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Ta seznam je mogoče razširiti tako, da vključuje spojine, pridobljene iz nafte (kurilna olja, maziva, asfaltene), bioplastike z visoko molekulsko maso in ionske tekočine (Amde et al., 2015). V tabeli 1 so navedena različna aromatska onesnaževala in njihova uporaba v različnih panogah. V zadnjih letih so se antropogene emisije hlapnih organskih spojin, pa tudi ogljikovega dioksida in drugih toplogrednih plinov, začele povečevati (Dvorak et al., 2017). Vendar pa antropogeni vplivi znatno presegajo naravne. Poleg tega smo ugotovili, da v mnogih okoljih vztrajajo številne organske spojine (SOC), ki so bile opredeljene kot nova onesnaževala s škodljivimi učinki na biome (slika 1). Okoljske agencije, kot je Agencija Združenih držav Amerike za varstvo okolja (USEPA), so številna od teh onesnaževal zaradi njihovih citotoksičnih, genotoksičnih, mutagenih in kancerogenih lastnosti vključile na svoj seznam prednostnih nalog. Zato so potrebni strogi predpisi o odstranjevanju in učinkovite strategije za obdelavo/odstranjevanje odpadkov iz onesnaženih ekosistemov. Različne fizikalne in kemične metode obdelave, kot so piroliza, oksidativna termična obdelava, prezračevanje zraka, odlaganje na odlagališčih, sežiganje itd., so neučinkovite in drage ter ustvarjajo korozivne, strupene in težko obdelljive stranske produkte. Z naraščajočo globalno okoljsko ozaveščenostjo mikroorganizmi, ki so sposobni razgraditi ta onesnaževala in njihove derivate (kot so halogenirani, nitro, alkilni in/ali metilni), pritegnejo vse več pozornosti (Fennell et al., 2004; Haritash in Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). Uporaba teh avtohtonih kandidatnih mikroorganizmov samih ali v mešanih kulturah (kolonijah) za odstranjevanje aromatskih onesnaževal ima prednosti v smislu okoljske varnosti, stroškov, učinkovitosti, uspešnosti in trajnosti. Raziskovalci raziskujejo tudi integracijo mikrobnih procesov z elektrokemičnimi redoks metodami, in sicer bioelektrokemičnimi sistemi (BES), kot obetavno tehnologijo za čiščenje/odstranjevanje onesnaževal (Huang et al., 2011). Tehnologija BES je pritegnila vse večjo pozornost zaradi svoje visoke učinkovitosti, nizkih stroškov, okoljske varnosti, delovanja pri sobni temperaturi, biokompatibilnih materialov in sposobnosti pridobivanja dragocenih stranskih produktov (npr. elektrike, goriva in kemikalij) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). Pojav visokozmogljivih orodij/metod za sekvenciranje genoma in omike je zagotovil bogastvo novih informacij o genetski regulaciji, proteomiki in fluksomiki reakcij različnih razgradnih mikroorganizmov. Kombinacija teh orodij s sistemsko biologijo je še izboljšala naše razumevanje izbire in natančnega uravnavanja ciljnih katabolnih poti v mikroorganizmih (tj. presnovne zasnove) za doseganje učinkovite in uspešne biorazgradnje. Za oblikovanje učinkovitih strategij bioremediacije z uporabo primernih kandidatnih mikroorganizmov moramo razumeti biokemični potencial, presnovno raznolikost, genetsko sestavo in ekologijo (avtoekologija/sinekologija) mikroorganizmov.
Slika 1. Viri in poti nizkomolekularnih PAH skozi različna okolja in različni dejavniki, ki vplivajo na bioto. Črtkane črte predstavljajo interakcije med elementi ekosistema.
V tem pregledu smo poskušali povzeti podatke o razgradnji preprostih PAH, kot sta naftalen in substituirani naftaleni, z različnimi bakterijskimi izolati, ki zajemajo presnovne poti in raznolikost, encime, vključene v razgradnjo, sestavo/vsebino in raznolikost genov, celične odzive in različne vidike bioremediacije. Razumevanje biokemijskih in molekularnih ravni bo pomagalo pri prepoznavanju primernih gostiteljskih sevov in njihovem nadaljnjem genskem inženiringu za učinkovito bioremediacijo takšnih prednostnih onesnaževal. To bo pomagalo pri razvoju strategij za vzpostavitev bakterijskih konzorcijev, specifičnih za lokacijo, za učinkovito bioremediacijo.
Prisotnost velikega števila strupenih in nevarnih aromatskih spojin (ki zadoščajo Hucklovemu pravilu 4n + 2π elektronov, n = 1, 2, 3, …) predstavlja resno grožnjo različnim okoljskim medijem, kot so zrak, tla, usedline ter površinska in podtalnica (Puglisi et al., 2007). Te spojine imajo enojne benzenske obroče (monociklične) ali več benzenskih obročev (policiklične), razporejenih v linearni, kotni ali grozdni obliki, in kažejo stabilnost (stabilnost/nestabilnost) v okolju zaradi visoke negativne resonančne energije in inertnosti (inertnosti), kar je mogoče pojasniti z njihovo hidrofobnostjo in reduciranim stanjem. Ko aromatski obroč dodatno nadomestijo metilne (-CH3), karboksilne (-COOH), hidroksilne (-OH) ali sulfonatne (-HSO3) skupine, postane bolj stabilen, ima močnejšo afiniteto do makromolekul in se bioakumulira v bioloških sistemih (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Nekatere policiklične aromatske ogljikovodike z nizko molekulsko maso (LMWAH), kot sta naftalen in njegovi derivati ​​[metilnaftalen, naftojska kislina, naftalensulfonat in 1-naftil N-metilkarbamat (karbaril)], je ameriška Agencija za varstvo okolja uvrstila na seznam prednostnih organskih onesnaževal kot genotoksične, mutagene in/ali kancerogene (Cerniglia, 1984). Sproščanje tega razreda NM-PAH v okolje lahko povzroči bioakumulacijo teh spojin na vseh ravneh prehranjevalne verige, kar vpliva na zdravje ekosistemov (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
Viri in poti PAH v bioto potekajo predvsem prek migracij in interakcij med različnimi komponentami ekosistema, kot so tla, podtalnica, površinske vode, pridelki in ozračje (Arey in Atkinson, 2003). Slika 1 prikazuje interakcije in porazdelitev različnih PAH z nizko molekulsko maso v ekosistemih ter njihove poti do biote/izpostavljenosti ljudi. PAH se odlagajo na površinah zaradi onesnaženosti zraka in zaradi migracije (drifta) emisij vozil, industrijskih izpušnih plinov (uplinjanje premoga, zgorevanje in proizvodnja koksa) ter njihovega odlaganja. Industrijske dejavnosti, kot so proizvodnja sintetičnih tekstilij, barvil in barv; konzerviranje lesa; predelava gume; proizvodnja cementa; proizvodnja pesticidov; in kmetijska uporaba so glavni viri PAH v kopenskih in vodnih sistemih (Bamforth in Singleton, 2005; Wick et al., 2011). Študije so pokazale, da so tla v primestnih in urbanih območjih, v bližini avtocest in v velikih mestih bolj dovzetna za policiklične aromatske ogljikovodike (PAH) zaradi emisij iz elektrarn, ogrevanja stanovanjskih objektov, obremenitev zraka in cestnega prometa ter gradbenih dejavnosti (Suman et al., 2016). (2008) je pokazal, da so bile ravni PAH v tleh v bližini cest v New Orleansu v Louisiani v ZDA kar 7189 μg/kg, medtem ko so bile v odprtem prostoru le 2404 μg/kg. Podobno so bile na območjih v bližini lokacij uplinjanja premoga v več ameriških mestih zabeležene ravni PAH do 300 μg/kg (Kanaly in Harayama, 2000; Bamforth in Singleton, 2005). Poročali so, da tla iz različnih indijskih mest, kot so Delhi (Sharma et al., 2008), Agra (Dubey et al., 2014), Mumbaj (Kulkarni in Venkataraman, 2000) in Visakhapatnam (Kulkarni et al., 2014), vsebujejo visoke koncentracije PAH. Aromatske spojine se lažje adsorbirajo na delce tal, organske snovi in ​​glinene minerale, s čimer postanejo glavni ponori ogljika v ekosistemih (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). Glavni viri PAH v vodnih ekosistemih so padavine (mokre/suhe padavine in vodna para), mestni odtok, izpust odpadne vode, obnavljanje podtalnice itd. (Srogi, 2007). Ocenjuje se, da približno 80 % PAH v morskih ekosistemih izvira iz padavin, sedimentacije in izpustov odpadkov (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). Višje koncentracije PAH v površinski vodi ali izcednih vodah z odlagališč trdnih odpadkov sčasoma pronicajo v podtalnico, kar predstavlja veliko grožnjo javnemu zdravju, saj več kot 70 % prebivalstva v Južni in Jugovzhodni Aziji pije podtalnico (Duttagupta et al., 2019). Nedavna študija Duttagupta et al. (2020) o analizah rek (32) in podtalnice (235) iz Zahodne Bengalije v Indiji je pokazala, da je po ocenah 53 % mestnih prebivalcev in 44 % podeželskih prebivalcev (skupaj 20 milijonov prebivalcev) lahko izpostavljenih naftalenu (4,9–10,6 μg/L) in njegovim derivatom. Različni vzorci rabe zemljišč in povečano črpanje podtalnice veljajo za glavna dejavnika, ki nadzorujeta vertikalni transport (advekcijo) PAH z nizko molekulsko maso v podzemlju. Ugotovljeno je bilo, da PAH v porečjih in podzemnih sedimentih vplivajo na kmetijski odtok, izpuste komunalnih in industrijskih odpadnih voda ter izpuste trdnih odpadkov/smeti. Atmosferske padavine dodatno poslabšajo onesnaženje s PAH. Visoke koncentracije PAH in njihovih alkilnih derivatov (skupaj 51) so bile zabeležene v rekah/povodjih po vsem svetu, kot so reke Fraser, Louan, Denso, Missouri, Anacostia, Ebro in Delaware (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). V sedimentih porečja reke Ganges sta bila naftalen in fenantren najpomembnejša (zaznana v 70 % vzorcev) (Duttagupta et al., 2019). Poleg tega so študije pokazale, da lahko kloriranje pitne vode povzroči nastanek bolj strupenih oksigeniranih in kloriranih PAH (Manoli in Samara, 1999). PAH se kopičijo v žitih, sadju in zelenjavi zaradi absorpcije v rastline iz onesnaženih tal, podtalnice in padavin (Fismes et al., 2002). Številni vodni organizmi, kot so ribe, klapavice, školjke in kozice, so onesnaženi s PAH z uživanjem onesnažene hrane in morske vode, pa tudi prek tkiv in kože (Mackay in Fraser, 2000). Metode kuhanja/predelave, kot so pečenje na žaru, praženje, dimljenje, cvrtje, sušenje, pečenje v pečici in kuhanje na oglju, lahko prav tako povzročijo znatne količine PAH v hrani. To je v veliki meri odvisno od izbire materiala za dimljenje, vsebnosti fenolnih/aromatskih ogljikovodikov, postopka kuhanja, vrste grelnika, vsebnosti vlage, dovoda kisika in temperature zgorevanja (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Policiklični aromatski ogljikovodiki (PAH) so bili odkriti tudi v mleku v različnih koncentracijah (0,75–2,1 mg/L) (Girelli et al., 2014). Kopičenje teh PAH v hrani je odvisno tudi od fizikalno-kemijskih lastnosti hrane, medtem ko so njihovi toksični učinki povezani s fiziološkimi funkcijami, presnovno aktivnostjo, absorpcijo, porazdelitvijo in porazdelitvijo po telesu (Mechini et al., 2011).
Toksičnost in škodljivi učinki policikličnih aromatskih ogljikovodikov (PAH) so znani že dolgo časa (Cherniglia, 1984). Policiklični aromatski ogljikovodiki z nizko molekulsko maso (LMW-PAH) (dva do trije obroči) se lahko kovalentno vežejo na različne makromolekule, kot so DNK, RNK in beljakovine, in so kancerogeni (Santarelli et al., 2008). Zaradi svoje hidrofobne narave so ločeni z lipidnimi membranami. Pri ljudeh citokrom P450 monooksigenaze oksidirajo PAH v epokside, od katerih so nekateri zelo reaktivni (npr. baediol epoksid) in lahko povzročijo transformacijo normalnih celic v maligne (Marston et al., 2001). Poleg tega so produkti transformacije PAH, kot so kinoni, fenoli, epoksidi, dioli itd., bolj strupeni kot matične spojine. Nekateri PAH in njihovi presnovni intermediati lahko vplivajo na hormone in različne encime v presnovi, s čimer negativno vplivajo na rast, centralni živčni sistem, reproduktivni in imunski sistem (Swetha in Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). Poročali so, da kratkotrajna izpostavljenost PAH z nizko molekulsko maso povzroča okvarjeno delovanje pljuč in trombozo pri astmatikih ter povečuje tveganje za raka kože, pljuč, mehurja in prebavil (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). Študije na živalih so tudi pokazale, da ima lahko izpostavljenost PAH neželene učinke na reproduktivno delovanje in razvoj ter lahko povzroči katarakto, poškodbe ledvic in jeter ter zlatenico. Dokazano je, da različni produkti biotransformacije PAH, kot so dioli, epoksidi, kinoni in prosti radikali (kationi), tvorijo adukte DNK. Dokazano je, da stabilni adukti spreminjajo mehanizem podvajanja DNK, medtem ko nestabilni adukti lahko depurinirajo DNK (predvsem v adenin in včasih v gvanin); oba lahko povzročita napake, ki vodijo do mutacij (Schweigert et al. 2001). Poleg tega lahko kinoni (benzo-/pan-) tvorijo reaktivne kisikove spojine (ROS), kar povzroči smrtno škodo na DNK in drugih makromolekulah ter s tem vpliva na delovanje/sposobnost preživetja tkiv (Ewa in Danuta 2017). Poročali so, da kronična izpostavljenost nizkim koncentracijam pirena, bifenila in naftalena povzroča raka pri poskusnih živalih (Diggs et al. 2012). Zaradi njihove smrtonosne toksičnosti je čiščenje/odstranjevanje teh PAH s prizadetih/kontaminiranih mest prednostna naloga.
Za odstranjevanje PAH iz onesnaženih območij/okolj se uporabljajo različne fizikalne in kemične metode. Postopki, kot so sežiganje, dekloriranje, UV-oksidacija, fiksacija in ekstrakcija s topilom, imajo številne pomanjkljivosti, vključno z nastajanjem strupenih stranskih produktov, kompleksnostjo postopka, varnostnimi in regulativnimi vprašanji, nizko učinkovitostjo ter visokimi stroški. Vendar pa je mikrobna biorazgradnja (imenovana bioremediacija) obetaven alternativni pristop, ki vključuje uporabo mikroorganizmov v obliki čistih kultur ali kolonij. V primerjavi s fizikalnimi in kemičnimi metodami je ta postopek okolju prijazen, neinvaziven, stroškovno učinkovit in trajnosten. Bioremediacija se lahko izvaja na prizadetem mestu (in situ) ali na posebej pripravljenem mestu (ex situ) in zato velja za bolj trajnostno metodo sanacije kot tradicionalne fizikalne in kemične metode (Juhasz in Naidu, 2000; Andreoni in Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
Razumevanje mikrobnih presnovnih korakov, ki sodelujejo pri razgradnji aromatskih onesnaževal, ima ogromne znanstvene in ekonomske posledice za ekološko in okoljsko trajnost. Ocenjujejo, da je po vsem svetu v sedimentih in organskih spojinah (tj. nafti, zemeljskem plinu in premogu, tj. fosilnih gorivih) shranjenih 2,1 × 10^18 gramov ogljika (C), kar pomembno prispeva k svetovnemu ogljikovemu ciklu. Vendar pa hitra industrializacija, pridobivanje fosilnih goriv in človeške dejavnosti izčrpavajo te litosferske rezervoarje ogljika, pri čemer se letno v ozračje sprosti približno 5,5 × 10^15 g organskega ogljika (kot onesnaževal) (Gonzalez-Gaya et al., 2019). Večina tega organskega ogljika vstopi v kopenske in morske ekosisteme s sedimentacijo, transportom in odtokom. Poleg tega nova sintetična onesnaževala, pridobljena iz fosilnih goriv, ​​kot so plastika, mehčala in stabilizatorji plastike (ftalati in njihovi izomeri), resno onesnažujejo morske, talne in vodne ekosisteme ter njihov biotski svet, s čimer se poslabšujejo globalna podnebna tveganja. V Tihem oceanu med Severno Ameriko in jugovzhodno Azijo so se nabrale različne vrste mikroplastike, nanoplastike, plastičnih fragmentov in njihovih strupenih monomernih produktov, pridobljenih iz polietilen tereftalata (PET), ki tvorijo »veliko pacifiško smetišče« in škodujejo morskemu življenju (Newell et al., 2020). Znanstvene študije so dokazale, da takšnih onesnaževal/odpadkov ni mogoče odstraniti z nobeno fizikalno ali kemično metodo. V tem kontekstu so najbolj uporabni mikroorganizmi tisti, ki so sposobni oksidativno presnoviti onesnaževala v ogljikov dioksid, kemično energijo in druge nestrupene stranske produkte, ki sčasoma vstopijo v druge procese kroženja hranil (H, O, N, S, P, Fe itd.). Zato je razumevanje mikrobne ekofiziologije mineralizacije aromatskih onesnaževal in njenega okoljskega nadzora ključnega pomena za oceno mikrobnega ogljikovega cikla, neto ogljikovega proračuna in prihodnjih podnebnih tveganj. Glede na nujno potrebo po odstranitvi takšnih spojin iz okolja so se pojavile različne ekološke industrije, osredotočene na čiste tehnologije. Druga možnost je, da se valorizacija industrijskih odpadkov/odpadnih kemikalij, ki se kopičijo v ekosistemih (tj. pristop »od odpadkov do bogastva«), šteje za enega od stebrov krožnega gospodarstva in ciljev trajnostnega razvoja (Close et al., 2012). Zato je razumevanje presnovnih, encimskih in genetskih vidikov teh potencialnih kandidatov za razgradnjo izjemnega pomena za učinkovito odstranjevanje in bioremediacijo takšnih aromatskih onesnaževal.
Med številnimi aromatskimi onesnaževali posebno pozornost namenjamo nizkomolekularnim PAH, kot sta naftalen in substituirani naftaleni. Te spojine so glavne sestavine goriv, ​​pridobljenih iz nafte, tekstilnih barvil, potrošniških izdelkov, pesticidov (naftalina in repelentov proti insektom), mehčal in taninov, zato so razširjene v številnih ekosistemih (Preuss et al., 2003). Nedavna poročila poudarjajo kopičenje koncentracij naftalena v vodonosnih sedimentih, podtalnici in podpovršinskih tleh, vadoznih conah in rečnih strugah, kar kaže na njegovo bioakumulacijo v okolju (Duttagupta et al., 2019, 2020). Tabela 2 povzema fizikalno-kemijske lastnosti, uporabo in učinke naftalena in njegovih derivatov na zdravje. V primerjavi z drugimi visokomolekularnimi PAH so naftalen in njegovi derivati ​​manj hidrofobni, bolj topni v vodi in široko razširjeni v ekosistemih, zato se pogosto uporabljajo kot modelni substrati za preučevanje metabolizma, genetike in presnovne raznolikosti PAH. Veliko število mikroorganizmov lahko presnavlja naftalen in njegove derivate, na voljo pa so tudi obsežne informacije o njihovih presnovnih poteh, encimih in regulatornih značilnostih (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Poleg tega so naftalen in njegovi derivati ​​zaradi svoje visoke številčnosti in biološke uporabnosti označeni kot prototipne spojine za oceno onesnaženosti okolja. Ameriška agencija za varstvo okolja ocenjuje, da so povprečne ravni naftalena 5,19 μg na kubični meter iz cigaretnega dima, predvsem zaradi nepopolnega zgorevanja, in 7,8 do 46 μg iz stranskega dima, medtem ko je izpostavljenost kreozotu in naftalenu 100- do 10.000-krat višja (Preuss et al. 2003). Zlasti naftalen ima vrsto, regijo in spol specifično respiratorno toksičnost in rakotvornost. Mednarodna agencija za raziskave raka (IARC) je na podlagi študij na živalih naftalen uvrstila med "možne rakotvorne snovi za ljudi" (skupina 2B)1. Izpostavljenost substituiranim naftalenom, predvsem z vdihavanjem ali parenteralnim (oralnim) dajanjem, povzroča poškodbe pljučnega tkiva in povečuje pojavnost pljučnih tumorjev pri podganah in miših (Nacionalni toksikološki program 2). Akutni učinki vključujejo slabost, bruhanje, bolečine v trebuhu, drisko, glavobol, zmedenost, obilno potenje, vročino, tahikardijo itd. Po drugi strani pa je bilo ugotovljeno, da je širokospektralni insekticid karbaril (1-naftil N-metilkarbamat) strupen za vodne nevretenčarje, dvoživke, čebele in ljudi ter da zavira acetilholinesterazo, kar povzroča paralizo (Smulders et al., 2003; Bulen in Distel, 2011). Zato je razumevanje mehanizmov mikrobne razgradnje, genetske regulacije, encimskih in celičnih reakcij ključnega pomena za razvoj strategij bioremediacije v onesnaženih okoljih.
Tabela 2. Podrobne informacije o fizikalno-kemijskih lastnostih, uporabi, metodah identifikacije in povezanih boleznih naftalena in njegovih derivatov.
V onesnaženih nišah lahko hidrofobni in lipofilni aromatski onesnaževalci povzročijo različne celične učinke na okoljski mikrobiom (skupnost), kot so spremembe v fluidnosti membrane, prepustnosti membrane, otekanje lipidnega dvosloja, motnje prenosa energije (elektronska transportna veriga/protonska gibalna sila) in aktivnost membransko povezanih beljakovin (Sikkema et al., 1995). Poleg tega nekateri topni intermediati, kot so kateholi in kinoni, ustvarjajo reaktivne kisikove spojine (ROS) in tvorijo adukte z DNK in beljakovinami (Penning et al., 1999). Tako obilica takšnih spojin v ekosistemih izvaja selektiven pritisk na mikrobne združbe, da postanejo učinkoviti razgrajevalci na različnih fizioloških ravneh, vključno s privzemom/transportom, znotrajcelično transformacijo, asimilacijo/uporabo in kompartmentalizacijo.
Iskanje v projektu Ribosomal Database Project-II (RDP-II) je pokazalo, da je bilo iz gojišč ali obogatitvenih kultur, kontaminiranih z naftalenom ali njegovimi derivati, izoliranih skupno 926 bakterijskih vrst. Skupina Proteobacteria je imela največje število predstavnikov (n = 755), sledile so ji Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) in nerazvrščene bakterije (8) (slika 2). Predstavniki γ-Proteobacteria (Pseudomonadales in Xanthomonadales) so prevladovali v vseh gramnegativnih skupinah z visoko vsebnostjo G+C (54 %), medtem ko so bile Clostridiales in Bacillales (30 %) grampozitivne skupine z nizko vsebnostjo G+C. Poročali so, da lahko Pseudomonas (največje število, 338 vrst) razgradijo naftalen in njegove metilne derivate v različnih onesnaženih ekosistemih (premogov katran, nafta, surova nafta, blato, razlitja nafte, odpadna voda, organski odpadki in odlagališča) ter v nedotaknjenih ekosistemih (tla, reke, sedimenti in podtalnica) (slika 2). Poleg tega so študije obogatitve in metagenomska analiza nekaterih od teh regij pokazale, da imajo lahko nekultivirane vrste Legionella in Clostridium razgradno sposobnost, kar kaže na potrebo po gojenju teh bakterij za preučevanje novih poti in presnovne raznolikosti.
Slika 2. Taksonomska raznolikost in ekološka razširjenost bakterijskih predstavnikov v okoljih, onesnaženih z naftalenom in derivati ​​naftalena.
Med različnimi mikroorganizmi, ki razgrajujejo aromatske ogljikovodike, jih je večina sposobna razgraditi naftalen kot edini vir ogljika in energije. Zaporedje dogodkov, povezanih s presnovo naftalena, je bilo opisano za Pseudomonas sp. (sevi: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 in CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 in drugi sevi (ND6 in AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis in Zylstra, 2004; Sota et al., 2006; Presnovo sproži večkomponentna dioksigenaza [naftalen dioksigenaza (NDO), dioksigenaza, ki hidroksilira obroč], ki katalizira oksidacijo enega od aromatskih obročev naftalena z uporabo molekularnega kisika kot drugega substrata, pri čemer se naftalen pretvori v cis-naftalendiol (slika 3). Cis-dihidrodiol se s pomočjo dehidrogenaze pretvori v 1,2-dihidroksinaftalen. Encim, ki cepi obroč dioksigenaza, 1,2-dihidroksinaftalen dioksigenaza (12DHNDO), pretvori 1,2-dihidroksinaftalen v 2-hidroksikromen-2-karboksilno kislino. Encimska cis-trans izomerizacija proizvede trans-o-hidroksibenzilidenpiruvat, ki ga hidratazna aldolaza cepi v salicilni aldehid in piruvat. Organski kislinski piruvat je bila prva spojina C3, izpeljana iz naftalenskega ogljikovega ogrodja in usmerjena v centralno ogljikovo pot. Poleg tega NAD+-odvisna salicilaldehid dehidrogenaza pretvori salicilaldehid v salicilno kislino. Presnova v tej fazi se imenuje "zgornja pot" razgradnje naftalena. Ta pot je zelo pogosta pri večini bakterij, ki razgrajujejo naftalen. Vendar obstaja nekaj izjem; na primer, pri termofilni Bacillus hamburgii 2 razgradnjo naftalena sproži naftalen 2,3-dioksigenaza, da nastane 2,3-dihidroksinaftalen (Annweiler et al., 2000).
Slika 3. Poti razgradnje naftalena, metilnaftalena, naftojske kisline in karbarila. Obkrožene številke predstavljajo encime, odgovorne za zaporedno pretvorbo naftalena in njegovih derivatov v nadaljnje produkte. 1 – naftalen dioksigenaza (NDO); 2, cis-dihidrodiol dehidrogenaza; 3, 1,2-dihidroksinaftalen dioksigenaza; 4, izomeraza 2-hidroksikromen-2-karboksilne kisline; 5, trans-O-hidroksibenzilidenpiruvat hidrataza aldolaza; 6, salicilaldehid dehidrogenaza; 7, salicilat 1-hidroksilaza; 8, katehol 2,3-dioksigenaza (C23DO); 9, 2-hidroksimukonat semialdehid dehidrogenaza; 10, 2-oksopent-4-enoat hidrataza; 11, 4-hidroksi-2-oksopentanoat aldolaza; 12, acetaldehid dehidrogenaza; 13, katehol-1,2-dioksigenaza (C12DO); 14, mukonat cikloizomeraza; 15, mukonolakton delta-izomeraza; 16, β-ketoadipatenolakton hidrolaza; 17, β-ketoadipat sukcinil-CoA transferaza; 18, β-ketoadipat-CoA tiolaza; 19, sukcinil-CoA: acetil-CoA sukciniltransferaza; 20, salicilat 5-hidroksilaza; 21 – gentizat 1,2-dioksigenaza (GDO); 22, maleilpiruvat izomeraza; 23, fumarilpiruvat hidrolaza; 24, metilnaftalen hidroksilaza (NDO); 25, hidroksimetilnaftalen dehidrogenaza; 26, naftaldehid dehidrogenaza; 27, 3-formilsalicilna kislina oksidaza; 28, hidroksiizoftalat dekarboksilaza; 29, karbaril hidrolaza (CH); 30, 1-naftol-2-hidroksilaza.
Glede na organizem in njegovo genetsko sestavo se nastala salicilna kislina nadalje presnavlja bodisi po kateholni poti z uporabo salicilat 1-hidroksilaze (S1H) bodisi po gentizatni poti z uporabo salicilat 5-hidroksilaze (S5H) (slika 3). Ker je salicilna kislina glavni vmesni produkt v presnovi naftalena (zgornja pot), se koraki od salicilne kisline do vmesnega produkta TCA pogosto imenujejo spodnja pot, geni pa so organizirani v en sam operon. Pogosto je mogoče videti, da gene v operonu zgornje poti (nah) in operonu spodnje poti (sal) regulirajo skupni regulatorni dejavniki; na primer NahR in salicilna kislina delujeta kot induktorja, ki omogočata, da oba operona popolnoma presnovita naftalen (Phale et al., 2019, 2020).
Poleg tega se katehol ciklično cepi v 2-hidroksimukonat semialdehid po meta poti s katehol 2,3-dioksigenazo (C23DO) (Yen et al., 1988) in ga nadalje hidrolizira 2-hidroksimukonat semialdehid hidrolaza, da se tvori 2-hidroksipent-2,4-dienojska kislina. 2-hidroksipent-2,4-dienoat se nato s hidratazo (2-oksopent-4-enoat hidrataza) in aldolazo (4-hidroksi-2-oksopentanoat aldolaza) pretvori v piruvat in acetaldehid, nato pa vstopi v centralno ogljikovo pot (slika 3). Druga možnost je, da se katehol ciklično cepi v cis,cis-mukonat po orto poti s katehol 1,2-oksigenazo (C12DO). Mukonatna cikloizomeraza, mukonolakton izomeraza in β-ketoadipat-nolakton hidrolaza pretvarjajo cis,cis-mukonat v 3-oksoadipat, ki vstopi v centralno ogljikovo pot preko sukcinil-CoA in acetil-CoA (Nozaki et al., 1968) (slika 3).
V gentizatni (2,5-dihidroksibenzoatni) poti se aromatski obroč razcepi z gentizat 1,2-dioksigenazo (GDO), da se tvori maleilpiruvat. Ta produkt se lahko neposredno hidrolizira v piruvat in malat ali pa se izomerizira v fumarilpiruvat, ki se nato hidrolizira v piruvat in fumarat (Larkin in Day, 1986). Izbira alternativne poti je bila opažena tako pri gramnegativnih kot grampozitivnih bakterijah na biokemični in genetski ravni (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). Gramnegativne bakterije (Pseudomonas) raje uporabljajo salicilno kislino, ki je induktor presnove naftalena, in jo dekarboksilirajo v katehol z uporabo salicilat 1-hidroksilaze (Gibson in Subramanian, 1984). Po drugi strani pa pri grampozitivnih bakterijah (Rhodococcus) salicilat 5-hidroksilaza pretvori salicilno kislino v gentizinsko kislino, medtem ko salicilna kislina nima induktivnega učinka na transkripcijo naftalenskih genov (Grund et al., 1992) (slika 3).
Poročali so, da lahko vrste, kot so Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas in Mycobacterium, razgradijo monometilnaftalen ali dimetilnaftalen (Dean-Raymond in Bartha, 1975; Cane in Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). Med njimi je bila pot razgradnje 1-metilnaftalena in 2-metilnaftalena pri Pseudomonas sp. CSV86 jasno proučena na biokemični in encimski ravni (Mahajan et al., 1994). 1-metilnaftalen se presnavlja po dveh poteh. Najprej se aromatski obroč hidroksilira (nesubstituiran obroč metilnaftalena), da nastane cis-1,2-dihidroksi-1,2-dihidro-8-metilnaftalen, ki se nadalje oksidira v metil salicilat in metilkatehol, nato pa po cepitvi obroča vstopi v centralno ogljikovo pot (slika 3). Ta pot se imenuje »pot vira ogljika«. V drugi »poti razstrupljanja« se lahko metilna skupina hidroksilira z NDO, da se tvori 1-hidroksimetilnaftalen, ki se nadalje oksidira v 1-naftojsko kislino in se izloči v gojišče kot slepi produkt. Študije so pokazale, da sev CSV86 ne more rasti na 1- in 2-naftojski kislini kot edinem viru ogljika in energije, kar potrjuje njegovo pot razstrupljanja (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). V 2-metilnaftalenu se metilna skupina hidroksilira s hidroksilazo, da se tvori 2-hidroksimetilnaftalen. Poleg tega se nesubstituirani obroč naftalenskega obroča hidroksilira, da se tvori dihidrodiol, ki se v seriji encimsko kataliziranih reakcij oksidira v 4-hidroksimetilkatehol in vstopi v centralno ogljikovo pot preko poti cepitve meta-obroča. Podobno je bilo ugotovljeno, da S. paucimobilis 2322 uporablja NDO za hidroksilacijo 2-metilnaftalena, ki se nadalje oksidira v metil salicilat in metilkatehol (Dutta et al., 1998).
Naftojske kisline (substituirane/nesubstituirane) so stranski produkti razstrupljanja/biotransformacije, ki nastanejo med razgradnjo metilnaftalena, fenantrena in antracena ter se sproščajo v izrabljeno gojišče. Poročali so, da lahko talni izolat Stenotrophomonas maltophilia CSV89 presnavlja 1-naftojsko kislino kot vir ogljika (Phale et al., 1995). Presnova se začne z dihidroksilacijo aromatskega obroča, da nastane 1,2-dihidroksi-8-karboksinaftalen. Nastali diol se oksidira v katehol preko 2-hidroksi-3-karboksibenzilidenpiruvata, 3-formilsalicilne kisline, 2-hidroksiizoftalne kisline in salicilne kisline ter vstopi v centralno ogljikovo pot preko poti cepitve meta-obroča (slika 3).
Karbaril je pesticid naftil karbamata. Od zelene revolucije v Indiji v sedemdesetih letih prejšnjega stoletja je uporaba kemičnih gnojil in pesticidov povzročila povečanje emisij policikličnih aromatskih ogljikovodikov (PAH) iz kmetijskih točkovnih virov (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). Ocenjujejo, da se 55 % (85.722.000 hektarjev) vseh obdelovalnih površin v Indiji tretira s kemičnimi pesticidi. V zadnjih petih letih (2015–2020) je indijski kmetijski sektor letno porabil povprečno od 55.000 do 60.000 ton pesticidov (Oddelek za zadruge in dobrobit kmetov, Ministrstvo za kmetijstvo, Vlada Indije, avgust 2020). V severnih in osrednjih gangetskih nižinah (države z največjo populacijo in gostoto prebivalstva) je uporaba pesticidov na pridelkih razširjena, prevladujejo pa insekticidi. Karbaril (1-naftil-N-metilkarbamat) je širokospektralni, zmerno do zelo strupen karbamatni insekticid, ki se uporablja v indijskem kmetijstvu s povprečno količino 100–110 ton. Običajno se prodaja pod trgovskim imenom Sevin in se uporablja za zatiranje žuželk (listnih uši, ognjenih mravelj, bolh, pršic, pajkov in številnih drugih zunanjih škodljivcev), ki prizadenejo različne pridelke (koruza, soja, bombaž, sadje in zelenjava). Nekateri mikroorganizmi, kot so Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus in Arthrobacter, se lahko uporabljajo tudi za zatiranje drugih škodljivcev. Poročali so, da lahko RC100 razgradi karbaril (Larkin in Day, 1986; Chapalamadugu in Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha in Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). Pot razgradnje karbarila je bila obsežno preučena na biokemični, encimski in genetski ravni v talnih izolatih sevov Pseudomonas sp. C4, C5 in C6 (Swetha in Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (slika 3). Presnovna pot se začne s hidrolizo estrske vezi s karbaril hidrolazo (CH), da nastane 1-naftol, metilamin in ogljikov dioksid. 1-naftol se nato pretvori v 1,2-dihidroksinaftalen z 1-naftol hidroksilazo (1-NH), ki se nadalje presnavlja preko centralne ogljikove poti preko salicilata in gentizata. Poročali so, da nekatere bakterije, ki razgrajujejo karbaril, le-to presnavljajo v salicilno kislino s cepitvijo kateholnega orto obroča (Larkin in Day, 1986; Chapalamadugu in Chaudhry, 1991). Omeniti velja, da bakterije, ki razgrajujejo naftalen, salicilno kislino presnavljajo predvsem s kateholom, medtem ko bakterije, ki razgrajujejo karbaril, salicilno kislino raje presnavljajo po gentizatni poti.
Derivati ​​naftalensulfonske kisline/disulfonske kisline in naftilaminsulfonske kisline se lahko uporabljajo kot intermediati pri proizvodnji azo barvil, omočilnih sredstev, disperzantov itd. Čeprav imajo te spojine nizko toksičnost za ljudi, so ocene citotoksičnosti pokazale, da so smrtonosne za ribe, vodne bolhe in alge (Greim et al., 1994). Poročali so, da predstavniki rodu Pseudomonas (sevi A3, C22) sprožijo presnovo z dvojno hidroksilacijo aromatskega obroča, ki vsebuje skupino sulfonske kisline, da tvorijo dihidrodiol, ki se nadalje pretvori v 1,2-dihidroksinaftalen s spontano cepitvijo sulfitne skupine (Brilon et al., 1981). Nastali 1,2-dihidroksinaftalen se katabolizira po klasični naftalenski poti, tj. kateholni ali gentisatni poti (slika 4). Dokazano je, da lahko mešani bakterijski konzorciji s komplementarnimi kataboličnimi potmi popolnoma razgradijo aminonaftalensulfonsko kislino in hidroksinaftalensulfonsko kislino (Nortemann et al., 1986). Dokazano je, da en član konzorcija razžvepljuje aminonaftalensulfonsko kislino ali hidroksinaftalensulfonsko kislino z 1,2-dioksigenacijo, medtem ko se aminosalicilat ali hidroksisalicilat sprosti v gojišče kot slepi metabolit in ga nato prevzamejo drugi člani konzorcija. Naftalendisulfonska kislina je relativno polarna, vendar slabo biorazgradljiva in se zato lahko presnavlja po različnih poteh. Prva razžveplitev se pojavi med regioselektivno dihidroksilacijo aromatskega obroča in skupine sulfonske kisline; druga razžveplitev se pojavi med hidroksilacijo 5-sulfosalicilne kisline s salicilno kislino 5-hidroksilazo, da nastane gentizinska kislina, ki vstopi v centralno ogljikovo pot (Brilon et al., 1981) (slika 4). Encimi, odgovorni za razgradnjo naftalena, so odgovorni tudi za presnovo naftalen sulfonata (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
Slika 4. Presnovne poti za razgradnjo naftalen sulfonata. Številke znotraj krogov predstavljajo encime, odgovorne za presnovo naftil sulfonata, podobne/enake encimom, opisanim na sliki 3.
Nizkomolekularni PAH (LMW-PAH) so reducibilni, hidrofobni in slabo topni, zato niso dovzetni za naravno razgradnjo/razgradnjo. Vendar pa jih aerobni mikroorganizmi lahko oksidirajo z absorpcijo molekularnega kisika (O2). Ti encimi spadajo predvsem v razred oksidoreduktaz in lahko izvajajo različne reakcije, kot so hidroksilacija aromatskega obroča (mono- ali dihidroksilacija), dehidrogenacija in cepitev aromatskega obroča. Produkti, pridobljeni s temi reakcijami, so v višjem oksidacijskem stanju in se lažje presnavljajo po centralni ogljikovi poti (Phale et al., 2020). Poročali so, da so encimi v razgradni poti inducibilni. Aktivnost teh encimov je zelo nizka ali zanemarljiva, ko celice gojimo na preprostih virih ogljika, kot so glukoza ali organske kisline. Tabela 3 povzema različne encime (oksigenaze, hidrolaze, dehidrogenaze, oksidaze itd.), ki sodelujejo pri presnovi naftalena in njegovih derivatov.
Tabela 3. Biokemijske značilnosti encimov, odgovornih za razgradnjo naftalena in njegovih derivatov.
Radioizotopske študije (18O2) so pokazale, da je vgradnja molekularnega O2 v aromatske obroče s strani oksigenaz najpomembnejši korak pri aktiviranju nadaljnje biorazgradnje spojine (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). Vgradnjo enega atoma kisika (O) iz molekularnega kisika (O2) v substrat sprožijo endogene ali eksogene monooksigenaze (imenovane tudi hidroksilaze). Drug atom kisika se reducira v vodo. Eksogene monooksigenaze reducirajo flavin z NADH ali NADPH, medtem ko pri endomonooksigenazah flavin reducira substrat. Položaj hidroksilacije povzroči raznolikost v tvorbi produktov. Na primer, salicilat 1-hidroksilaza hidroksilira salicilno kislino na položaju C1 in tvori katehol. Po drugi strani pa večkomponentna salicilat 5-hidroksilaza (ki vsebuje podenote reduktaze, feredoksina in oksigenaze) hidroksilira salicilno kislino na položaju C5 in tvori gentizinsko kislino (Yamamoto et al., 1965).
Dioksigenaze v substrat vključijo dva atoma O2. Glede na nastale produkte jih delimo na dioksigenaze, ki hidroksilirajo obroč, in dioksigenaze, ki cepijo obroč. Dioksigenaze, ki hidroksilirajo obroč, pretvarjajo aromatske substrate v cis-dihidrodiole (npr. naftalen) in so razširjene med bakterijami. Do danes je bilo dokazano, da so organizmi, ki vsebujejo dioksigenaze, ki hidroksilirajo obroč, sposobni rasti na različnih virih aromatskega ogljika, ti encimi pa so razvrščeni kot NDO (naftalen), toluen dioksigenaza (TDO, toluen) in bifenil dioksigenaza (BPDO, bifenil). Tako NDO kot BPDO lahko katalizirata dvojno oksidacijo in hidroksilacijo stranskih verig različnih policikličnih aromatskih ogljikovodikov (toluen, nitrotoluen, ksilen, etilbenzen, naftalen, bifenil, fluoren, indol, metilnaftalen, naftalensulfonat, fenantren, antracen, acetofenon itd.) (Boyd in Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). NDO je večkomponentni sistem, ki ga sestavljajo oksidoreduktaza, feredoksin in komponenta oksigenaze, ki vsebuje aktivno mesto (Gibson in Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). Katalitično enoto NDO sestavljata velika α podenota in majhna β podenota, razporejeni v konfiguraciji α3β3. NDO spada v veliko družino oksigenaz, njegova α-podenota pa vsebuje Rieskejevo mesto [2Fe-2S] in mononuklearni nehemski železov ion, ki določa specifičnost substrata NDO (Parales et al., 1998). Običajno se v enem katalitičnem ciklu dva elektrona iz redukcije piridinskega nukleotida preneseta na ion Fe(II) v aktivnem mestu preko reduktaze, feredoksina in Rieskejevega mesta. Redukcijski ekvivalenti aktivirajo molekularni kisik, kar je predpogoj za dihidroksilacijo substrata (Ferraro et al., 2005). Do danes je bilo prečiščenih in podrobno karakteriziranih le nekaj NDO iz različnih sevov, genetski nadzor poti, vključenih v razgradnjo naftalena, pa je bil podrobno preučen (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). Dioksigenaze, ki cepijo obroč (encimi, ki cepijo endo- ali orto-obroč, in encimi, ki cepijo eksodiol- ali meta-obroč), delujejo na hidroksilirane aromatske spojine. Na primer, dioksigenaza, ki cepi orto-obroč, je katehol-1,2-dioksigenaza, medtem ko je dioksigenaza, ki cepi meta-obroč, katehol-2,3-dioksigenaza (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). Poleg različnih oksigenaz obstajajo tudi različne dehidrogenaze, ki so odgovorne za dehidrogenacijo aromatskih dihidrodiolov, alkoholov in aldehidov ter uporabljajo NAD+/NADP+ kot akceptorje elektronov, ki so nekateri pomembni encimi, vključeni v presnovo (Gibson in Subramanian, 1984; Shaw in Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Encimi, kot so hidrolaze (esteraze, amidaze), so drugi pomemben razred encimov, ki uporabljajo vodo za cepitev kovalentnih vezi in kažejo široko specifičnost za substrate. Karbaril hidrolaza in druge hidrolaze veljajo za komponente periplazme (transmembrane) pri gramnegativnih bakterijah (Kamini et al., 2018). Karbaril ima tako amidno kot estrsko vez; zato ga lahko hidrolizira esteraza ali amidaza, da se tvori 1-naftol. Poročali so, da karbaril v sevu Rhizobium rhizobium AC10023 in sevu Arthrobacter RC100 deluje kot esteraza oziroma amidaza. Karbaril v sevu Arthrobacter RC100 deluje tudi kot amidaza. Dokazano je, da RC100 hidrolizira štiri insekticide razreda N-metilkarbamata, kot so karbaril, metomil, mefenaminska kislina in XMC (Hayaatsu et al., 2001). Poročali so, da CH v Pseudomonas sp. C5pp lahko deluje na karbaril (100 % aktivnost) in 1-naftil acetat (36 % aktivnost), ne pa tudi na 1-naftilacetamid, kar kaže, da gre za esterazo (Trivedi et al., 2016).
Biokemijske študije, vzorci regulacije encimov in genetske analize so pokazale, da geni za razgradnjo naftalena sestavljata dve inducibilni regulatorni enoti ali "operonom": nah ("pot navzgor", ki pretvarja naftalen v salicilno kislino) in sal ("pot navzdol", ki pretvarja salicilno kislino v centralno ogljikovo pot preko katehola). Salicilna kislina in njeni analogi lahko delujejo kot induktorji (Shamsuzzaman in Barnsley, 1974). V prisotnosti glukoze ali organskih kislin je operon potlačen. Slika 5 prikazuje celotno genetsko organizacijo razgradnje naftalena (v obliki operona). Opisanih je bilo več imenovanih variant/oblik gena nah (ndo/pah/dox), za katere je bilo ugotovljeno, da imajo visoko homologijo zaporedja (90 %) med vsemi vrstami Pseudomonas (Abbasian et al., 2016). Geni poti navzgor po naftalenu so bili na splošno razporejeni v konsenznem vrstnem redu, kot je prikazano na sliki 5A. Poročali so tudi o drugem genu, nahQ, ki je bil vključen v presnovo naftalena in se je običajno nahajal med nahC in nahE, vendar njegova dejanska funkcija še ni bila pojasnjena. Podobno je bil gen nahY, odgovoren za naftalen-občutljivo kemotaksijo, pri nekaterih članih najden na distalnem koncu nah operona. Pri Ralstonia sp. je bilo ugotovljeno, da se gen U2, ki kodira glutation S-transferazo (gsh), nahaja med nahAa in nahAb, vendar ni vplival na značilnosti izkoriščanja naftalena (Zylstra et al., 1997).
Slika 5. Genetska organizacija in raznolikost, opažena med razgradnjo naftalena med bakterijskimi vrstami; (A) Zgornja naftalenska pot, presnova naftalena v salicilno kislino; (B) Spodnja naftalenska pot, salicilna kislina preko katehola do centralne ogljikove poti; (C) salicilna kislina preko gentizata do centralne ogljikove poti.
»Spodnja pot« (sal operon) je običajno sestavljena iz nahGTHINLMOKJ in pretvarja salicilat v piruvat in acetaldehid preko poti cepitve katehol metaringa. Ugotovljeno je bilo, da je gen nahG (ki kodira salicilat hidroksilazo) ohranjen na proksimalnem koncu operona (slika 5B). V primerjavi z drugimi sevi, ki razgrajujejo naftalen, sta pri P. putida CSV86 nah in sal operona tandemska in zelo tesno povezana (približno 7,5 kb). Pri nekaterih gramnegativnih bakterijah, kot so Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 in P. putida AK5, se naftalen presnavlja kot centralni ogljikov presnovek preko gentizatne poti (v obliki sgp/nag operona). Genska kaseta je običajno predstavljena v obliki nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, kjer se nagR (ki kodira regulator tipa LysR) nahaja na zgornjem koncu (slika 5C).
Karbaril vstopi v centralni ogljikov cikel preko presnove 1-naftola, 1,2-dihidroksinaftalena, salicilne kisline in gentizinske kisline (slika 3). Na podlagi genetskih in presnovnih študij je bilo predlagano, da se ta pot razdeli na »gornjo« (pretvorba karbarila v salicilno kislino), »srednjo« (pretvorba salicilne kisline v gentizinsko kislino) in »nizvodno« (pretvorba gentizinske kisline v intermediate centralne ogljikove poti) (Singh et al., 2013). Genomska analiza C5pp (superkontig A, 76,3 kb) je pokazala, da je gen mcbACBDEF vključen v pretvorbo karbarila v salicilno kislino, sledi mcbIJKL v pretvorbo salicilne kisline v gentizinsko kislino in mcbOQP v pretvorbo gentizinske kisline v osrednje ogljikove intermediate (fumarat in piruvat, Trivedi et al., 2016) (slika 6).
Poročali so, da lahko encime, ki sodelujejo pri razgradnji aromatskih ogljikovodikov (vključno z naftalenom in salicilno kislino), inducirajo ustrezne spojine, preprosti viri ogljika, kot so glukoza ali organske kisline, pa jih zavirajo (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Med različnimi presnovnimi potmi naftalena in njegovih derivatov so bile do neke mere preučene regulatorne značilnosti naftalena in karbarila. Pri naftalenu gene tako v gorvodni kot v dolvodni poti regulira NahR, trans-aktivirajoči pozitivni regulator tipa LysR. Potreben je za indukcijo gena nah s salicilno kislino in njegovo posledično visoko stopnjo izražanja (Yen in Gunsalus, 1982). Poleg tega so študije pokazale, da sta integrativni gostiteljski faktor (IHF) in XylR (transkripcijski regulator, odvisen od sigma 54) prav tako ključna za transkripcijsko aktivacijo genov v presnovi naftalena (Ramos et al., 1997). Študije so pokazale, da se encimi poti odpiranja meta-obroča katehola, in sicer katehol 2,3-dioksigenaza, inducirajo v prisotnosti naftalena in/ali salicilne kisline (Basu et al., 2006). Študije so pokazale, da se encimi poti odpiranja orto-obroča katehola, in sicer katehol 1,2-dioksigenaza, inducirajo v prisotnosti benzojske kisline in cis,cis-mukonata (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
V sevu C5pp pet genov, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR in mcbS, kodira regulatorje, ki pripadajo družini transkripcijskih regulatorjev LysR/TetR, odgovornih za nadzor razgradnje karbarila. Ugotovljeno je bilo, da je homologni gen mcbG najtesneje povezan z regulatorjem tipa LysR, PhnS (58 % identiteta aminokislin), ki sodeluje pri presnovi fenantrena pri Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). Ugotovljeno je bilo, da je gen mcbH vključen v vmesno pot (pretvorba salicilne kisline v gentizinsko kislino) in pripada transkripcijskemu regulatorju tipa LysR, NagR/DntR/NahR, pri Pseudomonas in Burkholderia. Poročali so, da člani te družine prepoznajo salicilno kislino kot specifično efektorsko molekulo za indukcijo genov razgradnje. Po drugi strani pa so bili v spodnji poti (metaboliti gentizat-centralne ogljikove poti) identificirani trije geni, mcbN, mcbR in mcbS, ki pripadajo transkripcijskim regulatorjem tipa LysR in TetR.
Pri prokariontih so horizontalni procesi prenosa genov (pridobivanje, izmenjava ali prenos) prek plazmidov, transpozonov, profagov, genomskih otokov in integrativnih konjugativnih elementov (ICE) glavni vzroki plastičnosti v bakterijskih genomih, kar vodi do pridobitve ali izgube specifičnih funkcij/lastnosti. Bakterijam omogoča hitro prilagajanje različnim okoljskim pogojem, kar gostitelju zagotavlja potencialne prilagoditvene presnovne prednosti, kot je razgradnja aromatskih spojin. Presnovne spremembe se pogosto dosežejo s finim uglaševanjem razgradnih operonov, njihovih regulatornih mehanizmov in specifičnosti encimov, kar olajša razgradnjo širšega spektra aromatskih spojin (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). Ugotovljeno je bilo, da se genske kasete za razgradnjo naftalena nahajajo na različnih mobilnih elementih, kot so plazmidi (konjugativni in nekonjugativni), transpozoni, genomi, ICE in kombinacije različnih bakterijskih vrst (slika 5). Pri Pseudomonas G7 sta nah in sal operona plazmida NAH7 prepisana v isti orientaciji in sta del okvarjenega transpozona, ki za mobilizacijo potrebuje transpozazo Tn4653 (Sota et al., 2006). Pri sevu Pseudomonas NCIB9816-4 je bil gen najden na konjugativnem plazmidu pDTG1 kot dva operona (približno 15 kb narazen), ki sta bila prepisana v nasprotnih smereh (Dennis in Zylstra, 2004). Pri sevu Pseudomonas putida AK5 nekonjugativni plazmid pAK5 kodira encim, odgovoren za razgradnjo naftalena preko gentizatne poti (Izmalkova et al., 2013). Pri sevu Pseudomonas PMD-1 se nah operon nahaja na kromosomu, medtem ko se sal operon nahaja na konjugativnem plazmidu pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). Vendar pa se pri Pseudomonas stutzeri AN10 vsi geni za razgradnjo naftalena (operoni nah in sal) nahajajo na kromosomu in se domnevno rekrutirajo s transpozicijskimi, rekombinacijskimi in prerazporeditvenimi dogodki (Bosch et al., 2000). Pri Pseudomonas sp. CSV86 se operoni nah in sal nahajajo v genomu v obliki ICE (ICECSV86). Struktura je zaščitena s tRNAGly, ki ji sledijo neposredne ponovitve, ki kažejo na mesta rekombinacije/pritrditve (attR in attL), in fagu podobna integraza, ki se nahaja na obeh koncih tRNAGly, zato je strukturno podobna elementu ICEclc (ICEclcB13 pri Pseudomonas knackmusii za razgradnjo klorokatehola). Poročali so, da se geni na ICE lahko prenesejo s konjugacijo z izjemno nizko frekvenco prenosa (10-8), s čimer se lastnosti razgradnje prenesejo na prejemnika (Basu in Phale, 2008; Phale et al., 2019).
Večina genov, odgovornih za razgradnjo karbarila, se nahaja na plazmidih. Arthrobacter sp. RC100 vsebuje tri plazmide (pRC1, pRC2 in pRC300), od katerih dva konjugacijska plazmida, pRC1 in pRC2, kodirata encime, ki pretvarjajo karbaril v gentizat. Po drugi strani pa se encimi, ki sodelujejo pri pretvorbi gentizata v centralne ogljikove metabolite, nahajajo na kromosomu (Hayaatsu et al., 1999). Bakterije rodu Rhizobium. Sev AC100, ki se uporablja za pretvorbo karbarila v 1-naftol, vsebuje plazmid pAC200, ki nosi gen cehA, ki kodira CH, kot del transpozona Tnceh, obdanega z zaporedji, podobnimi insercijskim elementom (istA in istB) (Hashimoto et al., 2002). V sevu Sphingomonas CF06 naj bi bil gen za razgradnjo karbarila prisoten v petih plazmidih: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 in pCF05. Homologija DNK teh plazmidov je visoka, kar kaže na obstoj podvajanja gena (Feng et al., 1997). V simbiontu, ki razgrajuje karbaril in ga sestavljata dve vrsti Pseudomonas, sev 50581 vsebuje konjugativni plazmid pCD1 (50 kb), ki kodira gen za karbaril hidrolazo mcd, medtem ko konjugativni plazmid v sevu 50552 kodira encim, ki razgrajuje 1-naftol (Chapalamadugu in Chaudhry, 1991). V sevu Achromobacter WM111 se gen za furadan hidrolazo mcd nahaja na 100 kb velikem plazmidu (pPDL11). Dokazano je, da je ta gen prisoten na različnih plazmidih (100, 105, 115 ali 124 kb) v različnih bakterijah iz različnih geografskih regij (Parekh et al., 1995). Pri Pseudomonas sp. C5pp se vsi geni, odgovorni za razgradnjo karbarila, nahajajo v genomu, ki obsega 76,3 kb zaporedja (Trivedi et al., 2016). Analiza genoma (6,15 Mb) je pokazala prisotnost 42 MGE in 36 GEI, od katerih se je 17 MGE nahajalo v superkontigu A (76,3 kb) s povprečno asimetrično vsebnostjo G+C (54–60 mol %), kar kaže na možne horizontalne prenose genov (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1 kaže podobno razporeditev genov, ki razgrajujejo karbaril, vendar se ti geni nahajajo na plazmidu (Zhu et al., 2019).
Poleg presnovne učinkovitosti na biokemični in genomski ravni mikroorganizmi kažejo tudi druge lastnosti ali odzive, kot so kemotaksija, lastnosti modifikacije celične površine, kompartmentalizacija, prednostna izraba, proizvodnja biosurfaktantov itd., ki jim pomagajo učinkoviteje presnavljati aromatske onesnaževala v onesnaženih okoljih (slika 7).
Slika 7. Različne strategije celičnega odziva idealnih bakterij, ki razgrajujejo aromatske ogljikovodike, za učinkovito biorazgradnjo tujih onesnaževal.
Kemotaktični odzivi veljajo za dejavnike, ki pospešujejo razgradnjo organskih onesnaževal v heterogeno onesnaženih ekosistemih. (2002) so pokazali, da je kemotaksija Pseudomonas sp. G7 na naftalen povečala hitrost razgradnje naftalena v vodnih sistemih. Divji tip seva G7 je razgradil naftalen veliko hitreje kot mutirani sev s pomanjkanjem kemotaksije. Ugotovljeno je bilo, da je protein NahY (538 aminokislin z membransko topologijo) sočasno prepisan z geni metacepitvene poti na plazmidu NAH7 in tako kot kemotaktični pretvorniki se zdi, da ta protein deluje kot kemoreceptor za razgradnjo naftalena (Grimm in Harwood 1997). Druga študija Hansela in sodelavcev (2009) je pokazala, da je protein kemotaktičen, vendar je njegova hitrost razgradnje visoka. (2011) so pokazali kemotaktični odziv Pseudomonas (P. putida) na plinasti naftalen, pri čemer je difuzija v plinski fazi povzročila stalen pretok naftalena v celice, kar je nadzorovalo kemotaktični odziv celic. Raziskovalci so to kemotaktično vedenje izkoristili za inženiring mikrobov, ki bi povečali hitrost razgradnje. Študije so pokazale, da kemosenzorične poti uravnavajo tudi druge celične funkcije, kot so delitev celic, regulacija celičnega cikla in tvorba biofilma, s čimer pomagajo nadzorovati hitrost razgradnje. Vendar pa izkoriščanje te lastnosti (kemotaksije) za učinkovito razgradnjo ovira več ozkih grl. Glavne ovire so: (a) različni paralogni receptorji prepoznajo iste spojine/ligande; (b) obstoj alternativnih receptorjev, tj. energijski tropizem; (c) pomembne razlike v zaporedju v senzoričnih domenah iste družine receptorjev; in (d) pomanjkanje informacij o glavnih bakterijskih senzoričnih beljakovinah (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Včasih biorazgradnja aromatskih ogljikovodikov povzroči več metabolitov/intermediatov, ki so lahko kemotaktični za eno skupino bakterij, za druge pa odbojni, kar še dodatno otežuje proces. Za identifikacijo interakcij ligandov (aromatskih ogljikovodikov) s kemičnimi receptorji smo konstruirali hibridne senzorske proteine ​​(PcaY, McfR in NahY) z združitvijo senzorskih in signalnih domen Pseudomonas putida in Escherichia coli, ki ciljajo na receptorje za aromatske kisline, intermediate TCA oziroma naftalen (Luu et al., 2019).
Pod vplivom naftalena in drugih policikličnih aromatskih ogljikovodikov (PAH) se struktura bakterijske membrane in celovitost mikroorganizmov bistveno spremenita. Študije so pokazale, da naftalen ovira interakcijo acilne verige prek hidrofobnih interakcij, s čimer poveča nabrekanje in fluidnost membrane (Sikkema et al., 1995). Da bi preprečile ta škodljiv učinek, bakterije uravnavajo fluidnost membrane s spreminjanjem razmerja in sestave maščobnih kislin med izo/anteizo razvejanimi maščobnimi kislinami in izomerizacijo cis-nenasičenih maščobnih kislin v ustrezne trans-izomere (Heipieper in de Bont, 1994). Pri Pseudomonas stutzeri, ki je gojen ob obdelavi z naftalenom, se je razmerje med nasičenimi in nenasičenimi maščobnimi kislinami povečalo z 1,1 na 2,1, medtem ko se je pri Pseudomonas JS150 to razmerje povečalo s 7,5 na 12,0 (Mrozik et al., 2004). Pri gojenju na naftalenu so celice Achromobacter KAs 3–5 pokazale agregacijo celic okoli kristalov naftalena in zmanjšanje naboja celic na površini (z -22,5 na -2,5 mV), kar sta spremljali citoplazmatska kondenzacija in vakuolizacija, kar kaže na spremembe v celični strukturi in lastnostih celične površine (Mohapatra et al., 2019). Čeprav so celične/površinske spremembe neposredno povezane z boljšim vnosom aromatskih onesnaževal, ustrezne strategije bioinženiringa niso bile temeljito optimizirane. Manipulacija oblike celic se redko uporablja za optimizacijo bioloških procesov (Volke in Nikel, 2018). Izbris genov, ki vplivajo na delitev celic, povzroči spremembe v celični morfologiji. Izbris genov, ki vplivajo na delitev celic, povzroči spremembe v celični morfologiji. Pri Bacillus subtilis se je pokazalo, da je protein celičnega septuma SepF vključen v tvorbo septuma in je potreben za nadaljnje korake celične delitve, vendar ni esencialni gen. Izbris genov, ki kodirajo peptidne glikanske hidrolaze pri bakteriji Bacillus subtilis, je povzročil podaljševanje celic, povečano specifično hitrost rasti in izboljšano zmogljivost proizvodnje encimov (Cui et al., 2018).
Za doseganje učinkovite razgradnje sevov Pseudomonas C5pp in C7 je bila predlagana kompartmentalizacija poti razgradnje karbarila (Kamini et al., 2018). Predlagano je, da se karbaril transportira v periplazemski prostor skozi septum zunanje membrane in/ali skozi difuzibilne porine. CH je periplazemski encim, ki katalizira hidrolizo karbarila v 1-naftol, ki je bolj stabilen, bolj hidrofoben in bolj toksičen. CH je lokaliziran v periplazmi in ima nizko afiniteto za karbaril, s čimer nadzoruje nastajanje 1-naftola, s čimer preprečuje njegovo kopičenje v celicah in zmanjšuje njegovo toksičnost za celice (Kamini et al., 2018). Nastali 1-naftol se s particioniranjem in/ali difuzijo transportira v citoplazmo, nato pa ga visokoafinitetni encim 1NH hidroksilira v 1,2-dihidroksinaftalen za nadaljnjo presnovo v centralni ogljikovi poti.
Čeprav imajo mikroorganizmi genetske in presnovne sposobnosti za razgradnjo ksenobiotičnih virov ogljika, je hierarhična struktura njihove izrabe (tj. prednostna uporaba preprostih pred kompleksnimi viri ogljika) glavna ovira za biorazgradnjo. Prisotnost in uporaba preprostih virov ogljika zavira gene, ki kodirajo encime, ki razgrajujejo kompleksne/neprednostne vire ogljika, kot so PAH. Dobro preučen primer je, da se glukoza, ko se Escherichia coli sočasno hrani z glukozo in laktozo, uporablja učinkoviteje kot laktoza (Jacob in Monod, 1965). Poročali so, da Pseudomonas razgrajuje različne PAH in ksenobiotične spojine kot vire ogljika. Hierarhija izrabe virov ogljika pri Pseudomonas je organske kisline > glukoza > aromatske spojine (Hylemon in Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Vendar obstaja izjema. Zanimivo je, da Pseudomonas sp. CSV86 ima edinstveno hierarhično strukturo, ki prednostno uporablja aromatske ogljikovodike (benzojsko kislino, naftalen itd.) namesto glukoze in sočasno presnavlja aromatske ogljikovodike z organskimi kislinami (Basu et al., 2006). Pri tej bakteriji geni za razgradnjo in transport aromatskih ogljikovodikov niso znižani niti v prisotnosti drugega vira ogljika, kot sta glukoza ali organske kisline. Pri gojenju v gojišču z glukozo in aromatskimi ogljikovodiki je bilo opaženo, da so bili geni za transport in presnovo glukoze znižani, aromatski ogljikovodiki so bili uporabljeni v prvi logaritemski fazi, glukoza pa v drugi logaritemski fazi (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). Po drugi strani pa prisotnost organskih kislin ni vplivala na izražanje presnove aromatskih ogljikovodikov, zato se pričakuje, da bo ta bakterija kandidatni sev za študije biorazgradnje (Phale et al., 2020).
Dobro je znano, da lahko biotransformacija ogljikovodikov povzroči oksidativni stres in povečano regulacijo antioksidativnih encimov v mikroorganizmih. Neučinkovita biorazgradnja naftalena tako v celicah v stacionarni fazi kot v prisotnosti strupenih spojin vodi do nastanka reaktivnih kisikovih spojin (ROS) (Kang et al. 2006). Ker encimi, ki razgrajujejo naftalen, vsebujejo železo-žveplove grozde, se pod oksidativnim stresom železo v hemu in železo-žveplovih beljakovinah oksidira, kar vodi do inaktivacije beljakovin. Ferredoksin-NADP+ reduktaza (Fpr) skupaj s superoksid dismutazo (SOD) posreduje reverzibilno redoks reakcijo med NADP+/NADPH in dvema molekulama feredoksina ali flavodoksina, s čimer se odstranijo ROS in obnovi železo-žveplov center pod oksidativnim stresom (Li et al. 2006). Poročali so, da lahko tako Fpr kot SodA (SOD) pri Pseudomonas povzroči oksidativni stres, povečano aktivnost SOD in katalaze pa so opazili pri štirih sevih Pseudomonas (O1, W1, As1 in G1) med rastjo v pogojih dodanega naftalena (Kang et al., 2006). Študije so pokazale, da lahko dodatek antioksidantov, kot sta askorbinska kislina ali železo (Fe2+), poveča hitrost rasti naftalena. Ko je Rhodococcus erythropolis rasel v naftalenskem mediju, se je povečala transkripcija genov citokroma P450, povezanih z oksidativnim stresom, vključno s sodA (Fe/Mn superoksid dismutaza), sodC (Cu/Zn superoksid dismutaza) in recA (Sazykin et al., 2019). Primerjalna kvantitativna proteomska analiza celic Pseudomonas, gojenih v naftalenu, je pokazala, da je povečana regulacija različnih beljakovin, povezanih z odzivom na oksidativni stres, strategija obvladovanja stresa (Herbst et al., 2013).
Poročali so, da mikroorganizmi pod delovanjem hidrofobnih virov ogljika proizvajajo biosurfaktante. Te površinsko aktivne snovi so amfifilne površinsko aktivne spojine, ki lahko tvorijo agregate na vmesnikih olje-voda ali zrak-voda. To spodbuja psevdo-solubilizacijo in olajša adsorpcijo aromatskih ogljikovodikov, kar ima za posledico učinkovito biorazgradnjo (Rahman et al., 2002). Zaradi teh lastnosti se biosurfaktanti pogosto uporabljajo v različnih panogah. Dodajanje kemičnih površinsko aktivnih snovi ali biosurfaktantov bakterijskim kulturam lahko poveča učinkovitost in hitrost razgradnje ogljikovodikov. Med biosurfaktanti so bili ramnolipidi, ki jih proizvaja Pseudomonas aeruginosa, obsežno preučeni in okarakterizirani (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Poleg tega druge vrste biosurfaktantov vključujejo lipopeptide (mucine iz Pseudomonas fluorescens), emulgator 378 (iz Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg in Ron, 1999), trehalozne disaharide lipide iz Rhodococcus (Ramdahl, 1985), lihenin iz Bacillus (Saraswathy in Hallberg, 2002) in surfaktant iz Bacillus subtilis (Siegmund in Wagner, 1991) in Bacillus amyloliquefaciens (Zhi et al., 2017). Dokazano je, da ti močni surfaktanti zmanjšajo površinsko napetost s 72 din/cm na manj kot 30 din/cm, kar omogoča boljšo absorpcijo ogljikovodikov. Poročali so, da lahko Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia in druge bakterijske vrste proizvajajo različne biosurfaktante na osnovi ramnolipidov in glikolipidov, če jih gojimo v naftalenskih in metilnaftalenskih medijih (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 lahko proizvaja zunajcelični biosurfaktant Biosur-Pm, če ga gojimo na aromatskih spojinah, kot je naftojska kislina (Phale et al., 1995). Kinetika nastajanja Biosur-Pm je pokazala, da je njegova sinteza proces, odvisen od rasti in pH. Ugotovljeno je bilo, da je bila količina Biosur-Pm, ki so ga proizvedle celice pri nevtralnem pH, večja kot pri pH 8,5. Celice, gojene pri pH 8,5, so bile bolj hidrofobne in so imele večjo afiniteto za aromatske in alifatske spojine kot celice, gojene pri pH 7,0. Pri Rhodococcus spp. N6, višje razmerje med ogljikom in dušikom (C:N) in omejitev železa so optimalni pogoji za proizvodnjo zunajceličnih biosurfaktantov (Mutalik et al., 2008). Poskušali so izboljšati biosintezo biosurfaktantov (surfaktinov) z optimizacijo sevov in fermentacije. Vendar je titer surfaktanta v gojišču nizek (1,0 g/L), kar predstavlja izziv za proizvodnjo v velikem obsegu (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Zato so bile za izboljšanje njegove biosinteze uporabljene metode genskega inženiringa. Vendar pa je njegova inženirska modifikacija težka zaradi velike velikosti operona (∼25 kb) in kompleksne biosintetske regulacije sistema zaznavanja kvoruma (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Pri bakterijah Bacillus je bilo izvedenih več gensko-inženirskih modifikacij, katerih glavni cilj je bil povečati proizvodnjo surfaktina z zamenjavo promotorja (operon srfA), prekomerno izražanjem proteina za izvoz surfaktina YerP ter regulatornih faktorjev ComX in PhrC (Jiao et al., 2017). Vendar so te metode genskega inženiringa dosegle le eno ali nekaj genskih modifikacij in še niso dosegle komercialne proizvodnje. Zato je potrebno nadaljnje preučevanje metod optimizacije, ki temeljijo na znanju.
Študije biorazgradnje PAH se večinoma izvajajo v standardnih laboratorijskih pogojih. Vendar pa se je na onesnaženih mestih ali v onesnaženem okolju pokazalo, da številni abiotski in biotski dejavniki (temperatura, pH, kisik, razpoložljivost hranil, biološka uporabnost substrata, drugi ksenobiotiki, zaviranje končnih produktov itd.) spreminjajo in vplivajo na razgradno sposobnost mikroorganizmov.
Temperatura ima pomemben vpliv na biorazgradnjo PAH. Z naraščanjem temperature se koncentracija raztopljenega kisika zmanjšuje, kar vpliva na presnovo aerobnih mikroorganizmov, saj potrebujejo molekularni kisik kot enega od substratov za oksigenaze, ki izvajajo reakcije hidroksilacije ali cepitve obroča. Pogosto se ugotavlja, da povišana temperatura pretvori matične PAH v bolj strupene spojine, s čimer zavira biorazgradnjo (Muller et al., 1998).
Ugotovljeno je bilo, da imajo številna območja, onesnažena s PAH, ekstremne vrednosti pH, kot so na primer območja, onesnažena z odtoki kislih rudnikov (pH 1–4), in območja uplinjanja zemeljskega plina/premoga, onesnažena z alkalnimi izcedki (pH 8–12). Ti pogoji lahko resno vplivajo na proces biorazgradnje. Zato je pred uporabo mikroorganizmov za bioremediaci priporočljivo prilagoditi pH z dodajanjem ustreznih kemikalij (z zmernim do zelo nizkim oksidacijsko-redukcijskim potencialom), kot sta amonijev sulfat ali amonijev nitrat za alkalna tla ali apnjenje s kalcijevim karbonatom ali magnezijevim karbonatom za kisla območja (Bowlen et al. 1995; Gupta in Sar 2020).
Oskrba prizadetega območja s kisikom je dejavnik, ki omejuje hitrost biorazgradnje PAH. Zaradi redoks pogojev okolja procesi bioremediacije in situ običajno zahtevajo vnos kisika iz zunanjih virov (oranje, prepihovanje z zrakom in dodajanje kemikalij) (Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al. (1996) so pokazali, da lahko dodajanje magnezijevega peroksida (spojine, ki sprošča kisik) v onesnažen vodonosnik učinkovito bioremediaira spojine BTEX. Druga študija je raziskovala razgradnjo fenola in BTEX in situ v onesnaženem vodonosniku z vbrizgavanjem natrijevega nitrata in gradnjo ekstrakcijskih vrtin za doseganje učinkovite bioremediacije (Bewley in Webb, 2001).