Prisotnost *Trenutni naslov: Köln 50931, Nemčija, Raziskave grozda odličnosti v Kölnu o celičnem stresnem odzivu pri boleznih, povezanih s staranjem (CECAD).
Nevrodegeneracija mitohondrijskih bolezni velja za ireverzibilno, ker je metabolična plastičnost nevronov omejena, vendar je vpliv mitohondrijske disfunkcije na celično avtonomijo nevronskega metabolizma v telesu slabo razumljen. Tukaj predstavljamo celično specifičen proteom Purkinjejevih nevronov s progresivno pomanjkljivostjo OXPHOS, ki jo povzroča motena dinamika mitohondrijske fuzije. Ugotovili smo, da je mitohondrijska disfunkcija sprožila globoko spremembo na področju proteomike, kar je na koncu privedlo do zaporedne aktivacije natančnih presnovnih programov pred celično smrtjo. Nepričakovano smo ugotovili očitno indukcijo piruvat karboksilaze (PCx) in drugih encimov proti staranju, ki dopolnjujejo intermediate cikla TCA. Zaviranje PCx je poslabšalo oksidativni stres in nevrodegeneracijo, kar kaže, da ima ateroskleroza zaščitni učinek pri nevronih, ki nimajo OXPHOS. Obnova mitohondrijske fuzije v terminalno degeneriranih nevronih popolnoma obrne te presnovne značilnosti in s tem prepreči celično smrt. Naše ugotovitve identificirajo prej neznane poti, ki dajejo odpornost mitohondrijski disfunkciji, in kažejo, da je nevrodegeneracijo mogoče obrniti tudi v poznih fazah bolezni.
Osrednjo vlogo mitohondrijev pri vzdrževanju nevronskega energijskega metabolizma poudarjajo obsežni nevrološki simptomi, povezani s človeškimi mitohondrijskimi boleznimi. Večino teh bolezni povzročajo genske mutacije, ki uravnavajo izražanje mitohondrijskih genov (1, 2) ali uničenje genov, povezano z mitohondrijsko dinamiko, kar posredno vpliva na stabilnost mitohondrijske DNK (mtDNK) (3, 4). Delo na živalskih modelih je pokazalo, da se kot odziv na mitohondrijsko disfunkcijo v okoliških tkivih lahko aktivirajo konzervativne presnovne poti (5-7), kar zagotavlja pomembne informacije za poglobljeno razumevanje patogeneze teh kompleksnih bolezni. V ostrem nasprotju s tem je naše razumevanje presnovnih sprememb specifičnih tipov celic, ki jih povzroča splošna odpoved proizvodnje adenozin trifosfata (ATP) v možganih, temeljnega pomena (8), kar poudarja potrebo po identifikaciji terapevtskih tarč, ki jih je mogoče uporabiti za preprečevanje ali preprečevanje bolezni. Preprečevanje nevrodegeneracije (9). Pomanjkanje informacij je posledica dejstva, da se za živčne celice na splošno šteje, da imajo zelo omejeno presnovno fleksibilnost v primerjavi s tipi celic okoliških tkiv (10). Glede na to, da te celice igrajo osrednjo vlogo pri usklajevanju oskrbe nevronov s presnovki za spodbujanje sinaptičnega prenosa in odzivanje na poškodbe in bolezenska stanja, je sposobnost prilagajanja celičnega metabolizma zahtevnim pogojem možganskega tkiva skoraj omejena na glialne celice (11–14). Poleg tega inherentna celična heterogenost možganskega tkiva v veliki meri ovira preučevanje presnovnih sprememb, ki se pojavljajo v specifičnih nevronskih podskupinah. Posledično je o natančnih celičnih in presnovnih posledicah mitohondrijske disfunkcije v nevronih znanega le malo.
Da bi razumeli presnovne posledice mitohondrijske disfunkcije, smo izolirali Purkinjejeve nevrone (PN) v različnih fazah nevrodegeneracije, ki jo povzroča uničenje fuzije zunanje mitohondrijske membrane (Mfn2). Čeprav so mutacije Mfn2 pri ljudeh povezane z obliko dedne motorične senzorične nevropatije, znane kot Charcot-Marie-Tooth tip 2A (15), je pogojno uničenje Mfn2 pri miših dobro znana metoda indukcije oksidacijske fosforilacije (OXPHOS) disfunkcije. Različne nevronske podtipe (16–19) in nastali nevrodegenerativni fenotip spremljajo progresivni nevrološki simptomi, kot so motnje gibanja (18, 19) ali cerebelarna ataksija (16). Z uporabo kombinacije kvantitativne proteomike (LFQ) brez označevanja, metabolomike, slikovnih in viroloških metod smo pokazali, da progresivna nevrodegeneracija močno inducira piruvat karboksilazo (PCx) in druge dejavnike, ki sodelujejo pri arteriosklerozi PN in vivo. Izražanje encimov. Da bi preverili ustreznost te ugotovitve, smo posebej znižali izražanje PCx v nepovezanih nevronih (PN) s pomanjkanjem Mfn2 in ugotovili, da je ta operacija poslabšala oksidativni stres in pospešila nevrodegeneracijo, kar dokazuje, da azoospermija povzroča celično smrt. Presnovna prilagodljivost. Huda ekspresija MFN2 lahko popolnoma reši terminalno degenerativno PN s hudim pomanjkanjem OXPHOS, masivno porabo mitohondrijske DNK in očitno prekinjenim mitohondrijskim omrežjem, kar dodatno poudarja, da si lahko ta oblika nevrodegeneracije opomore celo v napredovali fazi bolezni pred celično smrtjo.
Za vizualizacijo mitohondrijev v nepovezanih nevronih (PN) z izločitvijo Mfn2 smo uporabili mišji sev, ki omogoča, da Cre-odvisni mitohondriji ciljajo na izražanje rumenega fluorescentnega proteina (YFP) (mtYFP) (20) Cre, in in vivo preverili morfologijo mitohondrijev. Ugotovili smo, da uničenje gena Mfn2 v PN vodi do postopne delitve mitohondrijske mreže (slika S1A), najzgodnejša sprememba pa je bila ugotovljena pri 3 tednih starosti. Nasprotno pa se je znatna degeneracija plasti celic PN, kar dokazuje izguba imunskega barvanja s kalbindinom, začela šele pri 12 tednih starosti (slika 1, A in B). Časovna neusklajenost med najzgodnejšimi spremembami v morfologiji mitohondrijev in vidnim začetkom nevronske smrti nas je spodbudila k raziskovanju presnovnih sprememb, ki jih sproži mitohondrijska disfunkcija pred celično smrtjo. Razvili smo strategijo, ki temelji na fluorescenčno aktiviranem sortiranju celic (FACS), za izolacijo PN, ki izražajo YFP (YFP+) (slika 1C), in pri kontrolnih miših (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: :L7-cre), v nadaljevanju CTRL (slika S1B). Optimizacija strategije odpiranja na podlagi relativne intenzivnosti signala YFP nam omogoča, da prečistimo telo YFP+ (YFPhigh) PN od ne-PN (YFPneg) (slika S1B) ali domnevnih fluorescentnih aksonskih/dendritičnih fragmentov (YFPlow; slika S1D, levo), kar je bilo potrjeno s konfokalnim mikroskopom (slika S1D, desno). Da bi preverili identiteto razvrščene populacije, smo izvedli LFQ proteomiko in nato analizo glavnih komponent ter ugotovili, da obstaja jasna ločitev med celicami YFPhigh in YFPneg (slika S1C). Celice YFPhigh so pokazale neto obogatitev znanih markerjev PN (tj. Calb1, Pcp2, Grid2 in Itpr3) (21, 22), vendar ne obogatitve z beljakovinami, ki se običajno izražajo v nevronih ali drugih tipih celic (slika 1D). Primerjava med vzorci v razvrščenih celicah YFPhigh, zbranih v neodvisnih poskusih, je pokazala korelacijski koeficient > 0,9, kar kaže na dobro ponovljivost med biološkimi ponovitvami (slika S1E). Skratka, ti podatki so potrdili naš načrt za akutno in specifično izolacijo izvedljivih PN. Ker uporabljeni gonilni sistem L7-cre inducira mozaično rekombinacijo v prvem tednu po porodu (23), smo začeli izločati miši iz CTRL in pogojno (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) zbirati nevrone. Po končani rekombinaciji se to imenuje Mfn2cKO pri starosti 4 tednov. Kot končno točko smo izbrali starost 8 tednov, ko je bila plast PN nedotaknjena kljub očitni fragmentaciji mitohondrijev (slika 1B in slika S1A). Skupno smo kvantificirali 3013 beljakovin, od katerih jih je približno 22 % temeljilo na anotacijah MitoCarta 2.0, ki so temeljile na mitohondrijskem proteomu kot mitohondrijih (slika 1E) (slika 1E) (24). Analiza diferencialne genske ekspresije, opravljena v 8. tednu, je pokazala, da je imelo le 10,5 % vseh beljakovin pomembne spremembe (slika 1F in slika S1F), od katerih je bilo 195 beljakovin zmanjšano in 120 beljakovin povečano (slika 1F). Omeniti velja, da »analiza inovativnih poti« tega nabora podatkov kaže, da diferencialno izraženi geni večinoma pripadajo omejenemu naboru specifičnih presnovnih poti (slika 1G). Zanimivo je, da čeprav znižana regulacija poti, povezanih z OXPHOS in kalcijevo signalizacijo, potrjuje indukcijo mitohondrijske disfunkcije v nepovezanih neuroneptikih s pomanjkanjem fuzije, so druge kategorije, ki vključujejo predvsem presnovo aminokislin, znatno povečane, kar je v skladu z metabolizmom, ki se pojavlja v mitohondrijskih neuroneptikih. Preoblikovanje je dosledno.
(A) Reprezentativne konfokalne fotografije cerebelarnih odsekov miši CTRL in Mfn2cKO, ki kažejo progresivno izgubo PN (kalbindin, sivo); jedra so bila kontrastno obarvana z DAPI. (B) Kvantifikacija (A) (enosmerna analiza variance, ***P<0,001; n = 4 do 6 krogov od treh miši). (C) Eksperimentalni potek dela. (D) Porazdelitev označevalcev, specifičnih za Purkinje (zgoraj) in druge tipe celic (na sredini), na toplotnem zemljevidu. (E) Vennov diagram, ki prikazuje število mitohondrijskih beljakovin, identificiranih v razvrščeni PN. (F) Vulkanski diagram diferencialno izraženih beljakovin v nevronih Mfn2cKO pri 8 tednih (mejna vrednost pomembnosti 1,3). (G) Analiza poti ustvarjalnosti prikazuje pet najpomembnejših poti povečane (rdeče) in zmanjšane (modre) regulacije v PN Mfn2cKO, razvrščeni kot 8 tednov. Prikazana je povprečna raven izražanja vsake zaznane beljakovine. Toplotni zemljevid v sivinah: prilagojena vrednost P. ns, ni pomembno.
Proteomski podatki so pokazali, da se je izražanje beljakovin v kompleksih I, III in IV postopoma zmanjševalo. Kompleksi I, III in IV so vsi vsebovali esencialne podenote, kodirane z mtDNA, medtem ko kompleks II, ki je bil kodiran le v jedru, ostal v bistvu nespremenjen (slika 2A in slika S2A). V skladu z rezultati proteomike je imunohistokemija prerezov cerebelarnega tkiva pokazala, da se je raven podenote MTCO1 (podenota 1 mitohondrijske citokrom C oksidaze) kompleksa IV v PN postopoma zmanjševala (slika 2B). Podenota Mtatp8, kodirana z mtDNA, se je znatno zmanjšala (slika S2A), medtem ko je raven podenote ATP sintaze, kodirane v jedru, v stanju dinamičnega ravnovesja ostala nespremenjena, kar je skladno z znanim stabilnim kompleksom podsklopa ATP sintaze F1, ko je izražanje mtDNA stabilno. Nastanek je dosleden. Prekinitev (7). Vrednotenje ravni mtDNA v razvrščenih PN Mfn2cKO z verižno reakcijo s polimerazo v realnem času (qPCR) je potrdilo postopno zmanjševanje števila kopij mtDNA. V primerjavi s kontrolno skupino se je pri 8 tednih starosti ohranilo le približno 20 % ravni mtDNK (slika 2C). V skladu s temi rezultati je bilo za odkrivanje DNK uporabljeno konfokalno mikroskopsko barvanje Mfn2cKO PN, ki je pokazalo časovno odvisno porabo mitohondrijskih nukleotidov (slika 2D). Ugotovili smo, da so bili le nekateri kandidati, vključeni v razgradnjo mitohondrijskih beljakovin in odziv na stres, povečano izraženi, vključno z Lonp1, Afg3l2 in Clpx ter faktorji sestavljanja kompleksa OXPHOS. Ni bilo zaznanih pomembnih sprememb v ravneh beljakovin, vključenih v apoptozo (slika S2B). Podobno smo ugotovili, da so se mitohondrijski in endoplazemski retikulumski kanali, ki sodelujejo pri transportu kalcija, le manjše spremenili (slika S2C). Poleg tega pri ocenjevanju beljakovin, povezanih z avtofagijo, niso ugotovili pomembnih sprememb, kar je skladno z vidno indukcijo avtofagosomov, opaženo in vivo z imunohistokemijo in elektronsko mikroskopijo (slika S3). Vendar pa progresivno disfunkcijo OXPHOS pri PN spremljajo očitne ultrastrukturne mitohondrijske spremembe. V celičnih telesih in dendritičnih drevesih Mfn2cKO PN, starih 5 in 8 tednov, so vidni mitohondrijski skupki, struktura notranje membrane pa je doživela globoke spremembe (slika S4, A in B). V skladu s temi ultrastrukturnimi spremembami in znatnim zmanjšanjem mtDNA je analiza akutnih cerebelarnih rezin s tetrametilrodamin metil estrom (TMRM) pokazala, da se je mitohondrijski membranski potencial v Mfn2cKO PN znatno zmanjšal (slika S4C).
(A) Časovna analiza ravni izražanja kompleksa OXPHOS. Upoštevajte samo beljakovine s P < 0,05 pri 8 tednih (dvosmerna ANOVA). Pikčasta črta: Brez prilagoditve v primerjavi s CTRL. (B) Levo: Primer cerebelarnega odseka, označenega s protitelesom proti MTCO1 (merilo, 20 μm). Območje, ki ga zasedajo telesca Purkinjejevih celic, je prekrito z rumeno barvo. Desno: Kvantifikacija ravni MTCO1 (enosmerna analiza variance; n = 7 do 20 analiziranih celic iz treh miši). (C) Analiza qPCR števila kopij mtDNA v razvrščeni PN (enosmerna analiza variance; n = 3 do 7 miši). (D) Levo: Primer cerebelarnega odseka, označenega s protitelesom proti DNA (merilo, 20 μm). Območje, ki ga zasedajo telesca Purkinjejevih celic, je prekrito z rumeno barvo. Desno: Kvantifikacija lezij mtDNA (enosmerna analiza variance; n = 5 do 9 celic iz treh miši). (E) Primer akutnega cerebelarnega prereza, ki prikazuje mitoYFP + Purkinjejeve celice (puščica) v posnetku celotnih celic s patch clamp testom. (F) Kvantifikacija IV krivulje. (G) Reprezentativni posnetki injiciranja depolarizacijskega toka v Purkinjejeve celice CTRL in Mfn2cKO. Zgornja sled: Prvi impulz, ki je sprožil AP. Spodnja sled: Največja frekvenca AP. (H) Kvantifikacija postsinaptičnih spontanih vnosov (sPSP). Reprezentativna sled snemanja in njeno razmerje povečave sta prikazana v (I). Enosmerna analiza variance je analizirala n = 5 do 20 celic treh miši. Podatki so izraženi kot povprečje ± SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Reprezentativne sledi spontane AP, posnete z uporabo perforiranega patch clamp testa. Zgornja sled: Največja frekvenca AP. Spodnja sled: povečava posamezne AP. (K) Kvantificirajte povprečno in največjo frekvenco AP v skladu z (J). Mann-Whitneyjev test; analiziranih je bilo n = 5 celic štirih miši. Podatki so izraženi kot povprečje ± SEM; ni pomembno.
Pri 8 tednov starih Mfn2cKO PN so odkrili očitne poškodbe OXPHOS, kar kaže na to, da je fiziološka funkcija nevronov močno nenormalna. Zato smo analizirali pasivne električne značilnosti nevronov s pomanjkanjem OXPHOS pri 4 do 5 tednih in 7 do 8 tednih z izvajanjem posnetkov s patch clamp celotnih celic v akutnih cerebelarnih rezinah (slika 2E). Nepričakovano sta bila povprečni mirovalni membranski potencial in vhodna upornost nevronov Mfn2cKO podobna kot pri kontrolni skupini, čeprav so bile med celicami subtilne razlike (tabela 1). Podobno pri 4 do 5 tednih starosti niso bile ugotovljene pomembne spremembe v razmerju med tokom in napetostjo (IV krivulja) (slika 2F). Vendar pa noben nevron Mfn2cKO, star 7 do 8 tednov, ni preživel IV režima (korak hiperpolarizacije), kar kaže na to, da je v tej pozni fazi jasna občutljivost na hiperpolarizacijski potencial. V nasprotju s tem so pri nevronih Mfn2cKO depolarizirajoči tokovi, ki povzročajo ponavljajoče se razelektritve akcijskega potenciala (AP), dobro prenašani, kar kaže, da se njihovi splošni vzorci razelektritev ne razlikujejo bistveno od vzorcev 8 tednov starih kontrolnih nevronov (tabela 1 in slika 2G). Podobno sta bili pogostost in amplituda spontanih postsinaptičnih tokov (sPSC) primerljivi s tistimi v kontrolni skupini, pogostost dogodkov pa se je povečala s 4 tednov na 5 tednov na 7 tednov na 8 tednov s podobnim povečanjem (slika 2, H in I). Obdobje sinaptičnega zorenja v PN (25). Podobni rezultati so bili pridobljeni po perforiranih obližih PN. Ta konfiguracija preprečuje morebitno kompenzacijo celičnih ATP defektov, kot se lahko zgodi pri snemanju s clamp obližem celih celic. Zlasti nista bila prizadeta membranski potencial v mirovanju in frekvenca spontanega proženja nevronov Mfn2cKO (slika 2, J in K). Skratka, ti rezultati kažejo, da se PN z očitno disfunkcijo OXPHOS dobro spopadajo z visokofrekvenčnimi vzorci praznjenja, kar kaže na obstoj kompenzacijskega mehanizma, ki jim omogoča ohranjanje skoraj normalnih elektrofizioloških odzivov.
Podatki so izraženi kot povprečje ± SEM (enosmerna analiza variance, Holm-Sidakov test večkratne primerjave; *P<0,05). Številka enote je označena v oklepajih.
Odločili smo se raziskati, ali katera koli kategorija v proteomskem naboru podatkov (slika 1G) vključuje poti, ki lahko preprečijo hudo pomanjkanje OXPHOS, s čimer pojasnimo, zakaj lahko prizadeta PN ohrani skoraj normalno elektrofiziologijo (slika 2, E do K). Proteomska analiza je pokazala, da so bili encimi, ki sodelujejo pri katabolizmu aminokislin z razvejano verigo (BCAA), znatno povečani (slika 3A in slika S5A), končni produkt acetil-CoA (CoA) ali sukcinil CoA pa lahko dopolni trikarboksilate v ciklu arteriosklerozne kisline (TCA). Ugotovili smo, da se je povečala vsebnost BCAA transaminaze 1 (BCAT1) in BCAT2. Katalizirata prvi korak katabolizma BCAA z tvorbo glutamata iz α-ketoglutarata (26). Vse podenote, ki sestavljajo kompleks razvejane ketokislinske dehidrogenaze (BCKD), so povečano izražene (kompleks katalizira nadaljnjo in ireverzibilno dekarboksilacijo nastalega ogljikovega ogrodja BCAA) (slika 3A in slika S5A). Vendar pa v sortiranih PN niso bile ugotovljene očitne spremembe same BCAA, kar je lahko posledica povečanega celičnega privzema teh esencialnih aminokislin ali uporabe drugih virov (glukoze ali mlečne kisline) za dopolnitev cikla TCA (slika S5B). PN brez OXPHOS so pri starosti 8 tednov prav tako pokazale povečano aktivnost razgradnje in transaminacije glutamina, kar se lahko odraža v povečani regulaciji mitohondrijskih encimov glutaminaze (GLS) in glutamin piruvat transaminaze 2 (GPT2) (slika 3, A in C). Omeniti velja, da je povečana regulacija GLS omejena na spojeno izoformo glutaminaze C (GLS-GAC) (sprememba Mfn2cKO/CTRL je približno 4,5-kratna, P = 0,05), njena specifična povečana regulacija v rakavih tkivih pa lahko podpira mitohondrijsko bioenergijo. (27)
(A) Toplotni zemljevid prikazuje kratno spremembo ravni beljakovin za določeno pot po 8 tednih. (B) Primer cerebelarne rezine, označene s protitelesom proti PCx (merilo, 20 μm). Rumena puščica kaže na telo Purkinjejeve celice. (C) Analiza časovnega poteka izražanja beljakovin, opredeljena kot pomemben kandidat za aterosklerozo (večkratni t-test, *FDR <5%; n = 3-5 miši). (D) Zgoraj: Shematski diagram, ki prikazuje različne načine vnosa označenega ogljika, ki ga vsebuje sledilnik [1-13C]piruvat (tj. prek PDH ali transarterijske poti). Spodaj: Diagram violine prikazuje odstotek enkrat označenega ogljika (M1), pretvorjenega v asparaginsko kislino, citronsko kislino in jabolčno kislino po označevanju akutnih cerebelarnih rezin z [1-13C]piruvatom (parni t-test; ** P <0,01). (E) Celovita analiza časovnega poteka navedene poti. Upoštevajte le beljakovine s P <0,05 po 8 tednih. Črtkana črta: brez prilagoditvene vrednosti (dvosmerna analiza variance; * P < 0,05; *** P < 0,001). Podatki so izraženi kot povprečje ± SEM.
V naši analizi je katabolizem BCAA postal ena ključnih poti povečane regulacije. To dejstvo močno nakazuje, da se lahko volumen prezračevanja, ki vstopa v cikel TCA, spremeni pri PN brez OXPHOS. To lahko predstavlja glavno obliko nevronskega presnovnega preoblikovanja, ki lahko neposredno vpliva na nevronsko fiziologijo in preživetje med vzdrževanjem hude disfunkcije OXPHOS. V skladu s to hipotezo smo ugotovili, da je glavni antiaterosklerotični encim PCx povečano reguliran (Mfn2cKO/CTRL se spremeni približno 1,5-krat; slika 3A), kar katalizira pretvorbo piruvata v oksaloacetat (28), za katerega se domneva, da je v možganskem tkivu. Ekspresija je omejena na astrocite (29, 30). V skladu z rezultati proteomike je konfokalna mikroskopija pokazala, da je bila ekspresija PCx specifično in znatno povečana pri PN s pomanjkanjem OXPHOS, medtem ko je bila reaktivnost PCx večinoma omejena na sosednje Bergmannove glialne celice kontrolne skupine (slika 3B). Za funkcionalno testiranje opažene povečane regulacije PCx smo akutne cerebelarne rezine obdelali z označevalcem [1-13C]piruvata. Ko je piruvat dehidrogenaza (PDH) oksidirala piruvat, je njegova izotopska oznaka izginila, vendar se vključi v intermediate cikla TCA, ko se piruvat presnavlja z žilnimi reakcijami (slika 3D). V podporo našim proteomskim podatkom smo v asparaginski kislini rezin Mfn2cKO opazili veliko število označevalcev iz tega označevalca, medtem ko sta citronska in jabolčna kislina prav tako imeli zmeren trend, čeprav ne pomemben (slika 3D).
V dopaminskih nevronih miši MitoPark z mitohondrijsko disfunkcijo, ki jo povzročajo dopaminski nevroni, ki specifično uničujejo gen mitohondrijskega transkripcijskega faktorja A (Tfam) (slika S6B), je bila tudi ekspresija PCx znatno povečana (31), kar kaže na acetonsko kislinsko arteriosklerozo. Pojav bolezni je reguliran med disfunkcijo nevronskih OXPHOS v telesu. Omeniti velja, da je bilo ugotovljeno, da so edinstveni encimi (32-34), ki se lahko izražajo v nevronih, ki so lahko povezani z arteriosklerozo, znatno povečani v neuronih, ki nimajo OXPHOS, kot so propionil-CoA karboksilaza (PCC-A), malonil-CoA, ki pretvarja propionil-CoA v sukcinil-CoA, in mitohondrijski jabolčni encim 3 (ME3), katerega glavna vloga je pridobivanje piruvata iz malata (slika 3, A in C) (33, 35). Poleg tega smo ugotovili znatno povečanje encima Pdk3, ki fosforilira in s tem inaktivira PDH (36), medtem ko nismo zaznali nobenih sprememb v encimu Pdp1, ki aktivira PDH, ali v samem encimskem kompleksu PDH (slika 3A). Dosledno je bila pri PN Mern2cKO povečana fosforilacija podenote α1 (PDHE1α) komponente piruvat dehidrogenaze E1 kompleksa PDH v Ser293 (za katero je znano, da zavira encimsko aktivnost PDH) (slika S6C). Piruvat nima žilnega dostopa.
Končno smo ugotovili, da so superpot biosinteze serina in glicina, sorodni mitohondrijski folatni (1C) cikel in biosinteza prolina (slika 1G in slika S5C) med aktivacijskim procesom znatno povečane, kot kažejo poročila. Okoliška tkiva so aktivirana z mitohondrijsko disfunkcijo (5-7). Konfokalna analiza, ki podpira te proteomske podatke, je pokazala, da so bile pri PN z manjkajočim OXPHOS rezine malih možganov 8 tednov starih miši izpostavljene serin hidroksimetiltransferazi 2 (SHMT2), ključnemu encimu mitohondrijskega folatnega cikla. Pomemben imunski odziv (slika S5D). V 13 akutnih rezinah malih možganov, inkubiranih s CU-glukozo, so poskusi metabolnega sledenja dodatno potrdili povečano regulacijo biosinteze serina in prolina, kar kaže na povečanje pretoka ogljikovih izooblik v serin in prolin (slika S5E). Ker so reakcije, ki jih spodbujata GLS in GPT2, odgovorne za sintezo glutamata iz glutamina in transaminacijo med glutamatom in α-ketoglutaratom, njihova povečana regulacija kaže, da imajo nevroni s pomanjkanjem OXPHOS povečano povpraševanje po glutamatu. To je lahko namenjeno ohranjanju povečane biosinteze prolina (slika S5C). V nasprotju s temi spremembami je proteomska analiza cerebelarnih astrocitov pri miših Mfn2cKO, specifičnih za PN, pokazala, da se te poti (vključno z vsemi antiperoksidazami) niso bistveno spremenile v izražanju, kar dokazuje, da je ta presnovna preusmeritev selektivna za degradirano PN (slika S6, D do G).
Skratka, te analize so razkrile bistveno različne vzorce časovne aktivacije specifičnih presnovnih poti pri nevronskih nevronih. Čeprav lahko nenormalna mitohondrijska funkcija nevronov vodi do zgodnje ateroskleroze in preoblikovanja 1C (slika 3E in slika S5C) ter celo do predvidljivih sprememb v izražanju kompleksov I in IV, so spremembe v de novo sintezi serina šele očitne v poznih fazah. Disfunkcija OXPHOS (slika 3E in slika S5C). Te ugotovitve opredeljujejo zaporedni proces, v katerem se s stresom povzročeni mitohondrijski (cikel 1C) in citoplazemski (biosinteza serina) odzivata sinergistično s povečanjem ateroskleroze v ciklu TCA, da preoblikujeta presnovo nevronov.
8 tednov stare PN s pomanjkanjem OXPHOS lahko ohranijo visokofrekvenčno vzbujevalno aktivnost in se znatno presnovijo, da bi kompenzirale mitohondrijsko disfunkcijo. To odkritje odpira zanimivo možnost, da bi te celice lahko tudi v tem trenutku prejele terapevtski poseg za odložitev ali preprečevanje nevrodegeneracije. To možnost smo rešili z dvema neodvisnima posegoma. Pri prvi metodi smo zasnovali vektor, odvisen od Cre, adeno-povezanega virusa (AAV), tako da se lahko MFN2 selektivno izraža v PN s pomanjkanjem OXPHOS in vivo (slika S7A). AAV, ki kodira MFN2, in fluorescenčni reporterski gen mCherry (Mfn2-AAV) sta bila preverjena v primarnih nevronskih kulturah in vitro, kar je povzročilo, da se MFN2 izraža na način, odvisen od Cre, in rešilo mitohondrijsko morfologijo, s čimer je preprečilo nevromutacijo v nevronih Mfn2cKO (slika S7, B, D in E). Nato smo izvedli in vivo poskuse za stereotaktično vnos 8 tednov starega Mfn2-AAV v cerebelarni korteks miši Mfn2cKO in kontrolnih miši ter analizirali 12 tednov stare miši (slika 4A). Zdravljene miši Mfn2cKO so poginile (slika 1, A in B) (16). Virusna transdukcija in vivo je povzročila selektivno izražanje PN v nekaterih cerebelarnih krogih (slika S7, G in H). Injekcija kontrolnega AAV, ki izraža samo mCherry (Ctrl-AAV), ni imela pomembnega vpliva na stopnjo nevrodegeneracije pri živalih Mfn2cKO. Nasprotno pa je analiza Mfn2cKO, transduciranih z Mfn2-AAV, pokazala pomemben zaščitni učinek plasti PN celic (slika 4, B in C). Zlasti se zdi, da je gostota nevronov skoraj nerazločljiva od kontrolnih živali (slika 4, B in C ter slika S7, H in I). Izražanje MFN1, ne pa MFN2, je enako učinkovito pri reševanju nevronske smrti (slika 4C in slika S7, C in F), kar kaže, da lahko izražanje ektopičnega MFN1 učinkovito nadomesti pomanjkanje MFN2. Nadaljnja analiza na ravni posamezne PN je pokazala, da je Mfn2-AAV v veliki meri rešil ultrastrukturo mitohondrijev, normaliziral ravni mtDNA in obrnil visoko izražanje markerja proti angiogenezi PCx ​​(slika 4, C do E). Vizualni pregled rešenih miši Mfn2cKO v stanju mirovanja je pokazal, da so se njihova drža in motorični simptomi (gibanje S1 do S3) izboljšali. Skratka, ti poskusi kažejo, da je odložena ponovna uvedba MFN2 v PN s hudim pomanjkanjem OXPHOS zadostna za obrnitev porabe mtDNA in sprožitev ateroskleroze, s čimer se prepreči degeneracija aksonov in nevronska smrt in vivo.
(A) Shema, ki prikazuje eksperimentalni urnik za injiciranje AAV, ki kodira MFN2, ko je aktivirana navedena presnovna pot. (B) Reprezentativne konfokalne slike 12 tednov starih rezin malih možganov, transduciranih pri 8 tednih pri miših Mfn2cKO in označenih s protitelesom proti kalbindinu. Desno: Skaliranje aksonskih vlaken. Lestvica aksonskega zooma je 450 in 75 μm. (C) Levo: Kvantifikacija gostote Purkinjejevih celic v transdukcijski zanki AAV (AAV+) (enosmerna analiza variance; n = 3 miši). Desno: analiza fokusa mtDNA v transducirani PN v 12. tednu (neparni t-test; n = 6 celic iz treh miši). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Reprezentativne transmisijske elektronske mikrografije PN rezin malih možganov Mfn2cKO, transduciranih z navedenimi virusnimi vektorji. Rožnata maska ​​prikazuje površino, ki jo zasedajo dendriti, rumen pikčasti kvadrat pa prikazuje povečavo na desni; n predstavlja jedro. Merilna vrstica, 1 μm. (E) prikazuje primer obarvanja PCx v PN, transducirani pri 12 tednih. Merilna vrstica, 20 μm. OE, prekomerna ekspresija; FC, kratna sprememba.
Končno smo raziskali pomen preživetja celic, ki ga povzroča peroksidaza, pri PN, ki so doživele disfunkcijo OXPHOS. Ustvarili smo mCherry, ki kodira AAV-shRNA (RNA s kratkimi lasnicami), specifično usmerjeno na mišjo PCx mRNA (AAV-shPCx), in injicirali virus ali njegovo kodirano kontrolo (AAV-scr) v mali možgani miši Mfn2cKO. Injekcija je bila izvedena v četrtem tednu starosti (slika 5A), da bi dosegli učinkovito zmanjšanje izražanja PCx v obdobju, ko se je izražanje PCx povečalo (slika 3C) in je bila plast PN celic še vedno nedotaknjena (slika 1A). Omeniti velja, da zmanjšanje izražanja PCx (slika S8A) povzroči znatno pospešitev smrti PN, ki je omejena na okuženi obroč (slika 5, B in C). Da bi razumeli mehanizem presnovnih učinkov, ki jih povzroča povečana regulacija PCx, smo preučevali redoks status PN po sočasni ekspresiji PCx in AAV-posredovanega optičnega biosenzorja Grx1-roGFP2 (slika S8, B do D), da bi ocenili relativno spremembo redoks potenciala peptida (38). Nato smo izvedli dvofotonsko fluorescenčno slikovno mikroskopijo (FLIM) v akutnih možganskih rezinah 7 tednov starih Mfn2cKO ali kontrolnih sorojencev, da bi odkrili morebitne spremembe v citoplazemskem redoks statusu po preverjanju pogojev FLIM (slika S8, E do G). Analiza je pokazala znatno povečanje oksidacijskega stanja posameznih Mfn2cKO PN brez ekspresije PCx, kar se razlikuje od kontrolnih nevronov ali Mfn2cKO PN, ki izražajo samo kodirano shRNA (slika 5, D in E). Ko je bila ekspresija PCx zmanjšana, se je odstotek Mfn2cKO PN, ki kažejo visoko oksidirano stanje, povečal za več kot trikrat (slika 5E), kar kaže, da je povečana regulacija PCx ohranila redoks kapaciteto degeneriranih nevronov.
(A) Shema, ki prikazuje eksperimentalni urnik za injiciranje AAV, ki kodira shPCx, ko je aktivirana navedena presnovna pot. (B) Reprezentativne konfokalne fotografije 8 tednov starih cerebelarnih prerezov pri miših Mfn2cKO, transduciranih in označenih s protitelesom proti kalcinevrinu pri 4 tednih. Merilna lestvica, 450 μm. (C) Kvantifikacija gostote Purkinjejevih celic v zankah, transduciranih z AAV (enosmerna analiza variance; n = 3 do 4 miši). Podatki so izraženi kot povprečje ± SEM; ***P < 0,001. (D) Reprezentativna slika FLIM prikazuje povprečno življenjsko dobo 7 tednov stare PN, ki izraža glutationski redoks senzor Grx1-roGFP2, v določenih eksperimentalnih pogojih. Razmerje LUT (look-up table): časovni interval preživetja (v pikosekundah). Merilna lestvica, 25 μm. (E) Histogram prikazuje porazdelitev vrednosti življenjske dobe Grx1-roGFP2 iz (D) (n=158 do 368 celic pri dveh miših pod vsakim pogojem). Tortni diagram nad vsakim histogramom: prikazuje število celic z bistveno daljšimi (rdeča, oksidirana) ali krajšimi (modra, zmanjšana) vrednostmi življenjske dobe, ki presegajo 1 SD povprečne vrednosti življenjske dobe v CTRL-AAV-scr. (F) Predlagani model prikazuje zaščitni učinek povečane regulacije nevronske PCx.
Skratka, podatki, ki jih tukaj predstavljamo, kažejo, da lahko ponovna ekspresija MFN2 popolnoma reši napredovalo PN s hudim pomanjkanjem OXPHOS, hudim izčrpavanjem mtDNA in izjemno nenormalno ista-podobno morfologijo, s čimer se zagotovi stalen napredek tudi pri napredovalih boleznih. Nevrodegeneracija zagotavlja reverzibilen dokaz o fazi pred celično smrtjo. To stopnjo presnovne fleksibilnosti dodatno poudarja sposobnost nevronov, da povzročijo aterosklerozo (ponovno ožičenje cikla TCA), ki zavira ekspresijo PCx v PN brez OXPHOS in pospešuje celično smrt, s čimer igra zaščitno vlogo (slika 5F).
V tej študiji smo predložili dokaze, da se nevroni odzivajo na disfunkcijo OXPHOS tako, da postopoma konvergirajo v aterosklerozo cikla TCA preko diferencialne aktivacijske poti, ki jo aktivirajo presnovni programi. Proteomsko analizo smo potrdili s številnimi komplementarnimi metodami in razkrili, da imajo nevroni, ko so izpostavljeni hudi mitohondrijski disfunkciji, prej neznano obliko presnovne elastičnosti. Na naše presenečenje celoten proces ponovnega ožičenja ne pomeni nujno terminalnega presnovnega stanja, ki postopoma in nepovratno spremlja nevrodegeneracijo, vendar naši podatki kažejo, da lahko predstavlja vzdrževalni nevron že v fazi pred celično smrtjo. Mehanizem funkcionalne kompenzacije. Ta ugotovitev kaže, da imajo nevroni v telesu precejšnjo stopnjo presnovne plastičnosti. To dejstvo dokazuje, da lahko kasnejša ponovna uvedba MFN2 obrne izražanje ključnih presnovnih markerjev in prepreči degeneracijo PN. Nasprotno, zavira aterosklerozo in pospešuje živce. transseksualci.
Ena najbolj fascinantnih ugotovitev v naši raziskavi je, da lahko PN, ki jim primanjkuje OXPHOS, spremenijo metabolizem cikla TCA z zvišanjem ravni encimov, ki specifično spodbujajo arteriosklerozo. Presnovna preureditev je pogosta značilnost rakavih celic, od katerih se nekatere zanašajo na glutamin kot dopolnitev intermediatov cikla TCA za proizvodnjo redukcijskih ekvivalentov, ki poganjajo dihalno verigo in vzdržujejo proizvodnjo predhodnikov biosinteze lipidov in nukleotidov (39, 40). Nedavna študija je pokazala, da je v perifernih tkivih, ki doživljajo disfunkcijo OXPHOS, ponovna povezava med presnovo glutamina/glutamata prav tako pomembna značilnost (5, 41), kjer je smer vstopa glutamina v cikel TCA odvisna od resnosti poškodbe OXPHOS (41). Vendar pa primanjkuje jasnih dokazov o kakršni koli podobnosti nevronske presnovne plastičnosti v telesu in njenem morebitnem pomenu v kontekstu bolezni. V nedavni študiji in vitro je bilo dokazano, da primarni kortikalni nevroni mobilizirajo zaloge glutamata za nevrotransmisijo, s čimer spodbujajo oksidativni metabolizem in aterosklerozo v pogojih presnovnega stresa (42). Omeniti velja, da naj bi pod farmakološko inhibicijo encima sukcinat dehidrogenaze v ciklu TCA karboksilacija piruvata ohranjala sintezo oksaloacetata v gojenih cerebelarnih granularnih nevronih (34). Vendar pa ima fiziološki pomen teh mehanizmov za možgansko tkivo (kjer naj bi bila ateroskleroza večinoma omejena na astrocite) še vedno pomemben fiziološki pomen (43). V tem primeru naši podatki kažejo, da se lahko PN, ki jih v telesu poškoduje OXPHOS, preklopijo na razgradnjo BCAA in karboksilacijo piruvata, ki sta dva glavna vira dopolnjevanja intermediatov TCA. Čeprav je bil poleg vloge glutamata in GABA pri nevrotransmisiji (44) predlagan domnevni prispevek katabolizma BCAA k presnovi energije v nevronih, še vedno ni dokazov za te mehanizme in vivo. Zato je enostavno domnevati, da lahko disfunkcionalni PN samodejno kompenzirajo porabo intermediatov TCA, ki jo povzroča proces asimilacije, s povečanjem ateroskleroze. Zlasti je lahko potrebna povečana regulacija PCx za vzdrževanje povečane potrebe po asparaginski kislini, kar je predlagano v proliferirajočih celicah z mitohondrijsko disfunkcijo (45). Vendar pa naša metabolomska analiza ni pokazala nobenih pomembnih sprememb v ravni asparaginske kisline v stanju dinamičnega ravnovesja v nepovezanih nevronih Mfn2cKO (slika S6A), kar verjetno odraža različno presnovno izkoriščanje asparaginske kisline med proliferirajočimi celicami in postmitotičnimi nevroni. Čeprav natančen mehanizem povečane regulacije PCx v disfunkcionalnih nevronih in vivo še ni opredeljen, smo pokazali, da ima ta prezgodnji odziv pomembno vlogo pri ohranjanju redoks stanja nevronov, kar je bilo dokazano v poskusih FLIM na rezinah malih možganov. Zlasti preprečevanje povečane regulacije PCx s strani nepovezanih nevronov lahko vodi v bolj oksidirano stanje in pospeši celično smrt. Aktivacija razgradnje BCAA in karboksilacija piruvata nista načina za karakterizacijo perifernih tkiv mitohondrijske disfunkcije (7). Zato se zdi, da sta prednostna značilnost nevronov s pomanjkanjem OXPHOS, četudi ne edina značilnost, ki je pomembna za nevrodegeneracijo. .
Cerebelarna bolezen je heterogena vrsta nevrodegenerativne bolezni, ki se običajno kaže kot ataksija in pogosto poškoduje PN (46). Ta populacija nevronov je še posebej ranljiva za mitohondrijsko disfunkcijo, ker je njihova selektivna degeneracija pri miših zadostna za reprodukcijo številnih motoričnih simptomov, ki so značilni za človeško spinocerebelarno ataksijo (16, 47, 48). Glede na poročila je transgeni mišji model z mutiranim genom povezan s človeško spinocerebelarno ataksijo in ima mitohondrijsko disfunkcijo (49, 50), kar poudarja pomen preučevanja posledic pomanjkanja OXPHOS pri PNPH. Zato je še posebej primerno učinkovito izolirati in preučevati to edinstveno populacijo nevronov. Glede na to, da so PN zelo občutljive na pritisk in predstavljajo majhen delež celotne populacije cerebelarnih celic, je za številne študije, ki temeljijo na omikah, selektivna ločitev le-teh kot celih celic še vedno zahteven vidik. Čeprav je skoraj nemogoče doseči popolno odsotnost kontaminacije drugih vrst celic (zlasti odraslih tkiv), smo kombinirali učinkovit korak disociacije s FACS, da bi dobili zadostno število živih nevronov za nadaljnjo proteomsko analizo in dosegli precej visoko pokritost beljakovin (približno 3000 beljakovin) v primerjavi z obstoječim naborom podatkov o celotnem malem mozgu (51). Z ohranjanjem viabilnosti celih celic nam metoda, ki jo ponujamo tukaj, omogoča ne le preverjanje sprememb v presnovnih poteh v mitohondrijih, temveč tudi preverjanje sprememb v njihovih citoplazemskih dvojnikih, kar dopolnjuje uporabo mitohondrijskih membranskih oznak za obogatitev celičnega tipa. Nova metoda za število mitohondrijev v kompleksnih tkivih (52, 53). Metoda, ki jo opisujemo, ni povezana le s preučevanjem Purkinjejevih celic, temveč jo je mogoče enostavno uporabiti za katero koli vrsto celic za obravnavo presnovnih sprememb v obolelih možganih, vključno z drugimi modeli mitohondrijske disfunkcije.
Končno smo med tem procesom presnove presnove odkrili terapevtsko okno, ki lahko popolnoma obrne ključne znake celičnega stresa in prepreči degeneracijo nevronov. Zato lahko razumevanje funkcionalnih posledic tukaj opisanega ponovnega ožičenja zagotovi temeljne vpoglede v možne načine zdravljenja za ohranjanje nevronske sposobnosti preživetja med mitohondrijsko disfunkcijo. Za popolno razkritje uporabnosti tega načela pri drugih nevroloških boleznih so potrebne nadaljnje raziskave, namenjene analizi sprememb v energijskem metabolizmu v drugih vrstah možganskih celic.
Miši MitoPark so bile opisane že prej (31). Miši C57BL/6N z loxP, ki obdajajo gene Mfn2, so bile opisane že prej (18) in križane z mišmi L7-Cre (23). Nastale dvojno heterozigotne potomce so nato križali s homozigotnimi mišmi Mfn2loxP/Mfn2loxP, da bi ustvarili Purkinjejeve specifične izpade genov za Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). V podskupini parjenja je bil alel Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) uveden z dodatnimi križanji (20). Vsi postopki na živalih so bili izvedeni v skladu z evropskimi, nacionalnimi in institucionalnimi smernicami ter odobreni s strani LandesamtfürNatur iz Umwelta in Verbraucherschutza v Severnem Porenju-Vestfaliji v Nemčiji. Delo na živalih sledi tudi smernicam Evropske federacije združenj za laboratorijske živali.
Po anesteziji izpaha vratne hrbtenice nosečnice je bil mišji zarodek izoliran (E13). Korteks je bil seciran v Hanksovi uravnoteženi solni raztopini (HBSS), dopolnjeni z 10 mM Hepesa, in prenesen na Dulbeccov modificiran Eagleov medij, ki je vseboval papain (20 U/ml) in cistein (1μg/ml). Tkivo je bilo inkubirano v DMEM (mediju za gojenje), ki je vseboval papain (20 U/ml) in encimsko razgradnjo (1μg/ml). Tkivo je bilo nato 20 minut inkubirano v DMEM (mediju za gojenje), dopolnjenem z 10 % fetalnim govejim serumom, pri 37 °C, nato pa mehansko zmleto v DMEM (mediju za gojenje), dopolnjenem z 10 % fetalnim govejim serumom. Celice so bile zasejane na steklena krovna stekelca, prevlečena s polilizinom, v gostoti 2 × 10⁶ na 6 cm posodo za gojenje ali v gostoti 0,5 × 10⁶ celic/cm² za slikovno analizo. Po 4 urah je bil medij nadomeščen z nevrobazalnim medijem brez seruma, ki je vseboval 1 % dodatka B27 in 0,5 mM GlutaMax. Nevroni so bili nato ves čas poskusa vzdrževani pri 37 °C in 5 % CO2 ter hranjeni enkrat na teden. Za indukcijo rekombinacije in vitro so bili drugi dan in vitro za zdravljenje nevronov uporabljeni 3 μl (24-vdolbinska plošča za gojenje) ali 0,5 μl (24-vdolbinska plošča) naslednjega vektorja virusa AAV9: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, kataloška številka 105530-AAV9) in AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, kataloška številka 105545-AAV9).
Mišji komplementarni DNK Mfn1 in Mfn2 (pridobljeni iz plazmida Addgene št. 23212 oziroma 23213) sta na C-terminusu označeni z zaporedjem V5 (GKPIPNPLLGLDST) in sta v bralnem okviru preko zaporedja T2A spojeni z mCherry. Grx1-roGFP2 je darilo podjetja Heidelberg TP Dick DFKZ (Nemški center za raziskovanje krebsforschungszentrum). Z zamenjavo kasete tdTomato z uporabo običajnih metod kloniranja je bila kaseta subklonirana v ogrodje pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (referenčna številka Addgene 28306), da so nastali vektorji pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 in pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Podobna strategija je bila uporabljena za generiranje kontrolnega vektorja pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Za generiranje konstrukta AAV-shPCx je potreben plazmidni vektor AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA]-CMV-mCherry-U6-mPcx-[shRNA#1]), ki vsebuje zaporedje DNA, ki kodira shRNA, usmerjeno proti mišjemu PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Pod nadzorom promotorja U6 se uporablja mCherry pod nadzorom promotorja CMV. Proizvodnja pomožnih vektorjev AAV je bila izvedena v skladu z navodili proizvajalca (Cell Biolabs). Skratka, uporabite prenosni plazmid, ki nosi kodirajoči gen mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) za začasno transfekcijo celic 293AAV - T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ali Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), kot tudi kodirajoči kapsidni protein AAV1 in pomožni protein. Pakirni plazmidni plazmid je bil uporabljen z metodo s kalcijevim fosfatom. Surovi virusni supernatant smo dobili s cikli zamrzovanja in odmrzovanja v kopeli s suhim ledom/etanolom in lizirali celice v fosfatno pufrirani fiziološki raztopini (PBS). Vektor AAV smo očistili z diskontinuirno ultracentrifugacijo z jodiksanolnim gradientom (24 ur pri 32.000 vrt/min in 4 °C) in koncentrirali z uporabo centrifugalnega filtra Amicon ultra-15. Genomski titer AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9 × 1013 kopij genoma (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 × 1012 GC/ml) in AAV1-CAG-FLEX smo izmerili, kot je bilo opisano prej (54), s kvantitativno PCR v realnem času (qPCR)-MFN1-V5 (1,9 × 1013 GC/ml) in AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 1012 GC/ml).
Primarni nevroni so bili postrgani v ledeno mrzlem 1x PBS, peletirani in nato homogenizirani v liznem pufru 0,5 % Triton X-100 / 0,5 % natrijevega deoksiholata/PBS, ki je vseboval fosfatazo in zaviralec proteaze (Roche). Kvantifikacija beljakovin je bila izvedena z uporabo testa z bicinhoninsko kislino (Thermo Fisher Scientific). Beljakovine so bile nato ločene z elektroforezo v SDS-poliakrilamidnem gelu in nato pobrane na membrano iz poliviniliden fluorida (GE Healthcare). Blokirajte nespecifična mesta in inkubirajte s primarnim protitelesom (za podrobnosti glejte tabelo S1) v 5 % mleku v TBST (Tris-puferirana fiziološka raztopina s Tween), koraki pranja in sekundarno protitelo v inkubatorju TBST. Inkubirajte s primarnim protitelesom čez noč pri +4 °C. Po pranju nanesite sekundarno protitelo 2 uri pri sobni temperaturi. Nato je bila z inkubacijo istega blota s protitelesom proti β-aktinu potrjena ista obremenitev. Detekcija s pretvorbo v kemiluminiscenco in okrepitvijo kemiluminiscence (GE Healthcare).
Nevroni, ki so bili predhodno zasejani na krovna stekelca, so bili fiksirani s 4 % paraformaldehidom (PFA)/PBS ob določenem času pri sobni temperaturi 10 minut. Krovna stekelca so bila najprej permeirana z 0,1 % Triton X-100/PBS 5 minut pri sobni temperaturi in nato v blokirnem pufru [3 % goveji serumski albumin (BSA)/PBS]. Drugi dan so bila krovna stekelca oprana z blokirnim pufrom in inkubirana z ustreznim sekundarnim protitelesom, konjugiranim s fluoroforjem, 2 uri pri sobni temperaturi; na koncu so bili vzorci temeljito oprani v PBS s 4',6-diamidino-2-fenilindolom (DAPI), kontrastno obarvani in nato fiksirani na mikroskopsko stekelce z Aqua-Poly/Mount.
Miši (samci in samice) so bile anestezirane z intraperitonealno injekcijo ketamina (130 mg/kg) in ksilazina (10 mg/kg) ter subkutano aplicirane z analgetikom karprofena (5 mg/kg). Nato so bile nameščene v stereotaksični instrument (Kopf), opremljen s toplo blazinico. Lobanjo so odkrili in z zobozdravstvenim svedrom stanjšali del cerebelarne skorje, ki ustreza mis kosti (od lambda: rep 1,8, lateralno 1, kar ustreza režnjema IV in V). Z ukrivljeno iglo brizge so previdno ustvarili majhno luknjo v lobanji, da se ne bi prekinilo spodnje žilje. Nato so tanko narisano stekleno kapilaro počasi vstavili v mikroluknjo (od -1,3 do -1 na ventralni strani dura mater) in z ročnimi brizgami (Narishige) so v mikroinjektor (Narishige) večkrat pri nizkem tlaku v časovnem oknu 10 do 20 minut vbrizgali 200 do 300 nl AAV. Po infuziji kapilaro namestimo še za 10 minut, da se virus popolnoma razširi. Po odstranitvi kapilar kožo skrbno zašijemo, da zmanjšamo vnetje rane in omogočimo živali okrevanje. Živali so po operaciji več dni zdravili z analgetiki (kaspofen), med tem časom pa so skrbno spremljali njihovo fizično stanje, nato pa so jih ob navedenem času evtanazirali. Vsi postopki so bili izvedeni v skladu z evropskimi, nacionalnimi in institucionalnimi smernicami ter so jih odobrili s strani LandesamtfürNatur of Umwelt end Verbraucherschutz, Severno Porenje-Vestfalija, Nemčija.
Živali so bile anestezirane s ketaminom (100 mg/kg) in ksilazinom (10 mg/kg), srce pa je bilo najprej perfuzirano z 0,1 M PBS, nato pa s 4 % PFA v PBS. Tkivo je bilo secirano in fiksirano v 4 % PFA/PBS čez noč pri 4 °C. Za pripravo sagitalnih rezin (debeline 50 μm) iz fiksiranih možganov v PBS je bil uporabljen vibracijski nož (Leica Microsystems GmbH, Dunaj, Avstrija). Če ni drugače navedeno, je bilo barvanje prosto plavajočih rezin izvedeno, kot je opisano zgoraj (13), pri sobni temperaturi in mešanju. Skratka, najprej so bile pridobljene rezine permeabilizirane z 0,5 % Triton X-100/PBS 15 minut pri sobni temperaturi; za nekatere epitope (Pcx in Shmt2) pa so rezine namesto tega koraka segrevali 25 minut v tris-EDTA pufru pri 80 °C (pH 9). Nato so bile sekcije inkubirane s primarnim protitelesom (glej tabelo S1) v blokirnem pufru (3 % BSA/PBS) pri 4 °C čez noč ob mešanju. Naslednji dan so bile sekcije oprane z blokirnim pufrom in inkubirane z ustreznim s fluoroforjem konjugiranim sekundarnim protitelesom 2 uri pri sobni temperaturi; na koncu so bile sekcije temeljito oprane v PBS, kontrastno obarvane z DAPI in nato fiksirane z AquaPolymount na mikroskopskem stekelcu.
Za slikanje vzorca je bil uporabljen laserski vrstični konfokalni mikroskop (TCS SP8-X ali TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems), opremljen z belim laserjem in 405 diodnim ultravijoličnim laserjem. Z vzbujanjem fluoroforja in zbiranjem signala s hibridnim detektorjem (HyDs) je bila uporabljena programska oprema LAS-X za zbiranje zloženih slik, ki ustrezajo Nyquistovemu vzorčenju v zaporednem načinu: za nekvantitativne plošče gre za zelo dinamične signale (na primer v somatskih celicah in dendritih) (mtYFP). Za zaznavanje števila PN v načinu BrightR se uporabi sinhronizacija od 0,3 do 6 ns za zmanjšanje ozadja.
Slikanje razvrščenih celic v realnem času. Po sortiranju v mediju Neurobasal-A, ki je vseboval 1 % dodatka B27 in 0,5 mM GlutaMax, so bile celice takoj zasejane na steklena stekelca, prevlečena s poli-l-lizinom (μ-Slide8 Well, Ibidi, kataloška številka 80826), nato pa so bile 1 uro vzdrževane pri 37 °C in 5 % CO2, da so se celice usedle. Slikanje v realnem času je bilo izvedeno na laserskem skenirnem konfokalnem mikroskopu Leica SP8, opremljenem z belim laserjem, HyD, oljnim objektivom z numerično aperturo 63 × [1,4,4 (NA)] in grelno ploščo.
Miš so hitro anestezirali z ogljikovim dioksidom in ji odvzeli glavo, možgane pa so hitro odstranili iz lobanje in jih razrezali na 200 μm debele (za poskus označevanja z 13C) ali 275 μm debele (za poskuse z dvema fotonoma) sagitalne rezine, napolnjene z naslednjimi materiali: Sladoled (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Nemčija) je napolnjen z naslednjimi snovmi: 125 mM ledeno mrzla, z ogljikom nasičena (95 % O2 in 5 % CO2) umetna cerebrospinalna tekočina (ACSF) z nizko vsebnostjo Ca2 + NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrijev fosfatni pufer, 25 mM NaHCO3, 25 mM glukoza, 0,5 mM CaCl2 in 3,5 mM MgCl2 (osmotski tlak od 310 do 330 mmol). Pridobljene možganske rezine prenesite v predinkubacijsko komoro, ki vsebuje medij z višjim Ca2+ ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrijevega fosfatnega pufra, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoze, 1,0 mM CaCl2 in 2,0 mM MgCl2) s pH 7,4 in 310 do 320 mmol).
Med postopkom slikanja so bile rezine premaknjene v namensko sobo za slikanje, poskus pa je bil izveden pod neprekinjeno perfuzijo ACSF pri konstantni temperaturi od 32 °C do 33 °C. Za slikanje rezin je bil uporabljen večfotonski laserski vrstični mikroskop (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems), opremljen z objektivom Leica 25x (NA 0,95, voda), in Ti:safirni laser (Chameleon Vision II, Coherent). Modul FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM Grx1-roGFP2. Spremembe citoplazemskega redoks stanja PN so bile izmerjene z dvofotonskim FLIM v sagitalnih možganskih rezinah, kjer je biosenzor Grx1-roGFP2 ciljal na PN. V plasti PN je polje zajemanja izbrano približno 50 do 80 μm pod površino rezine, da se zagotovi prisotnost žive PN (torej odsotnost krogličaste strukture ali nevronskih morfoloških sprememb vzdolž dendritov) ter dvojno pozitivni senzor roGFP2 in AAV, ki kodirata shRNA PCx ali njeno kontrolno zaporedje (vsak so-izraža mCherry). Z 2-kratnim digitalnim zoomom [valovna dolžina vzbujanja: 890 nm; 512 nm 512 slikovnih pik] se zberejo posamezne slike z 2-kratnim digitalnim zoomom [valovna dolžina vzbujanja: 890 nm; 512 nm 512 slikovnih pik]. Detekcija: notranji HyD, skupina filtrov fluorescein izotiocianata (FITC)] in povprečenje slike v 2 do 3 minutah se uporabi, da se zagotovi, da se zbere dovolj fotonov (skupaj 1000 fotonov) za prilagajanje krivulje. Občutljivost sonde Grx1-roGFP2 in preverjanje pogojev FLIM sta bila izvedena s spremljanjem vrednosti življenjske dobe roGFP2 ob dodajanju eksogenega 10 mM H2O2 v perfuzijski ACSF (za maksimiranje oksidacije, kar ima za posledico podaljšanje življenjske dobe) in nato dodajanju 2 mM ditiotreitola (zmanjšanje stopnje redukcije, kar ima za posledico skrajšanje življenjske dobe) (slika S8, D do G). Za analizo pridobljenih rezultatov smo uporabili programsko opremo FLIMfit 5.1.1, prilagodili eno samo eksponentno krivuljo upadanja celotne slike izmerjeni IRF (funkcija odziva instrumenta), χ2 pa je približno 1. Za izračun življenjske dobe posameznega PN smo ročno narisali masko okoli živčnega telesa, za kvantifikacijo pa smo uporabili povprečno življenjsko dobo v vsaki maski.
Analiza mitohondrijskega potenciala. Po 30-minutni inkubaciji akutnega odseka s 100 nM TMRM, ki je bil neposredno dodan v perfuzirani ACSF, so bile spremembe mitohondrijskega potenciala PN izmerjene z dvofotonskim mikroskopom. Slikanje s TMRM je bilo izvedeno z vzbujanjem sonde pri 920 nm in uporabo notranjega HyD (tetrametilrodamin izotiocianat: 585/40 nm) za zbiranje signalov; z uporabo iste valovne dolžine vzbujanja, vendar z uporabo drugačnega notranjega HyD (FITC: 525/50) za slikanje mtYFP. Za oceno mitohondrijskega potenciala na ravni posamezne celice uporabite vtičnik Image Calculator programa ImageJ. Skratka, enačba vtičnika: signal = min (mtYFP, TMRM) se uporablja za identifikacijo mitohondrijske regije, ki prikazuje signal TMRM v Purkinjejevem somalskem sindromu na konfokalni sliki z enim slojem ustreznega kanala. Nato se površina slikovnih pik v nastali maski kvantificira in nato normalizira na ustrezni pragovi enojne slike mtYFP kanala, da se dobi mitohondrijski delež, ki prikazuje mitohondrijski potencial.
Slika je bila dekonvoluirana s programsko opremo Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Za skenirane slike ploščic je bila montaža posamezne ploščice narejena z algoritmom za samodejno šivanje, ki ga zagotavlja programska oprema LAS-X. Po kalibraciji slike je bila za nadaljnjo obdelavo slike ter enakomerno prilagoditev svetlosti in kontrasta uporabljena programa ImageJ in Adobe Photoshop. Za grafično pripravo je bil uporabljen program Adobe Illustrator.
Analiza fokusa mtDNA. Število lezij mtDNA je bilo kvantificirano na cerebelarnih rezinah, označenih s protitelesi proti DNK, s konfokalnim mikroskopom. Vsako ciljno območje je bilo ustvarjeno za celično telo in jedro vsake celice, ustrezno območje pa je bilo izračunano z uporabo vtičnika Multi Measure (programska oprema ImageJ). Od površine celičnega telesa odštejemo površino jedra, da dobimo površino citoplazme. Nazadnje je bil uporabljen vtičnik Analyze Particles (programska oprema ImageJ) za samodejno kvantifikacijo točk citoplazmatske DNK, ki kažejo na mtDNA na pragovni sliki, dobljeni rezultati pa so bili normalizirani na povprečje PN miši CTRL. Rezultati so izraženi kot povprečno število nukleozidov na celico.
Analiza izražanja beljakovin. Za oceno izražanja beljakovin v PN na ravni posamezne celice uporabite vtičnik Image Calculator programa ImageJ. Skratka, na enoslojni konfokalni sliki ustreznega kanala se z enačbo: signal = min (mtYFP, protitelo) identificira mitohondrijska regija, ki kaže imunoreaktivnost na določeno protitelo v Purkinovi bolezni. Nato se površina slikovnih pik v nastali maski kvantificira in normalizira na ustrezni prag enoslojne slike kanala mtYFP, da se dobi mitohondrijski delež prikazane beljakovine.
Analiza gostote Purkinjejevih celic. Za oceno gostote Purkinjejevih celic je bil uporabljen vtičnik Cell Counter programa ImageJ, tako da se je število preštetih Purkinjejevih celic delilo z dolžino cerebelarnega obroča, ki ga zasedajo preštete celice.
Priprava in odvzem vzorcev. Možgani kontrolne skupine in miši Mfn2cKO so bili fiksirani v 2 % PFA/2,5 % glutaraldehidu v 0,1 M fosfatnem pufru (PB), nato pa so bili pripravljeni koronalni rezi z uporabo migetalk (Leica Mikrosysteme GmbH, Dunaj, Avstrija) (debelina 50 do 60 μm). Nato so bili fiksirani v PB pufru v 1 % tetraoksidu in 1,5 % kalijevem ferocianidu pri sobni temperaturi 1 uro. Rezine so bile trikrat oprane z destilirano vodo in nato 20 minut obarvani s 70 % etanolom, ki je vseboval 1 % uranil acetata. Rezine so bile nato dehidrirane v stopenjskem alkoholu in vdelane v epoksi smolo Durcupan ACM (Araldite casting resin M) (Electron Microscopy Sciences, kataloška številka 14040) med s silicijem prevlečenimi steklenimi ploščicami in na koncu pri 60 °C polimerizirane v pečici 48 ur. Izbrano je bilo območje cerebelarne skorje in na njem so bili narezani 50 nm ultratanki rezi na mikroskopu Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Dunaj, Avstrija) ter odvzeti na bakreni mreži z režami velikosti 2 × 1 mm, prevlečeni s polistirensko folijo. Rezine so bile 10 minut obarvane z raztopino 4 % uranil acetata v H2O, večkrat sprane s H2O, nato 10 minut z Reynoldsovim svinčevim citratom v H2O in nato večkrat sprane s H2O. Mikroskopije so bile posnete s transmisijskim elektronskim mikroskopom Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA) z uporabo digitalne kamere TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, ZDA). Nemčija).
Pri miših, okuženih z AAV, so bili možgani ločeni in narezani na 1 mm debel sagitalni rez, mali možgani pa so bili pregledani s fluorescentnim mikroskopom, da bi identificirali obroč, okužen z AAV (torej tisti, ki izraža mCherry). Uporabljeni so bili le poskusi, pri katerih je injekcija AAV povzročila zelo visoko učinkovitost transdukcije plasti Purkinjejevih celic (tj. skoraj celotne plasti) v vsaj dveh zaporednih cerebelarnih obročih. Zanka, transducirana z AAV, je bila mikrodisekirana za nočno postfiksacijo (4 % PFA in 2,5 % glutaraldehida v 0,1 M kokoatnem pufru) in nadalje obdelana. Za vgradnjo EPON je bilo fiksirano tkivo oprano z 0,1 M natrijevim kokoatnim pufrom (Applichem) in inkubirano z 2 % OsO4 (os, Science Services; Caco) v 0,1 M natrijevem kokoatnem pufru (Applichem) 4 ure, nato pa oprano 2 uri. Postopek ponovite 3-krat z 0,1 M kokamidnim pufrom. Nato je bila vsaka raztopina etanola inkubirana 15 minut pri 4 °C z naraščajočim nizom etanola, da se tkivo dehidrira. Tkivo je bilo preneseno v propilen oksid in inkubirano čez noč v EPON-u (Sigma-Aldrich) pri 4 °C. Tkivo je bilo za 2 uri postavljeno v svež EPON pri sobni temperaturi, nato pa vgrajeno za 72 ur pri 62 °C. Z ultramikrotomom (Leica Microsystems, UC6) in diamantnim nožem (Diatome, Biel, Švica) so bile narezane 70 nm ultra tanke rezine, ki so bile nato 15 minut pri 37 °C obarvane z 1,5 % uranil acetatom in nato 4 minute z raztopino svinčevega citrata. Elektronske mikrografije so bile posnete s transmisijskim elektronskim mikroskopom JEM-2100 Plus (JEOL), opremljenim s kamero Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) in programsko opremo DigitalMicrograph (Gatan). Za analizo so bile elektronske mikrografije posnete s 5000× ali 10.000× digitalnim zoomom.
Morfološka analiza mitohondrijev. Za vse analize so bili obrisi posameznih mitohondrijev ročno orisani na digitalnih slikah z uporabo programske opreme ImageJ. Analizirani so bili različni morfološki parametri. Gostota mitohondrijev je izražena kot odstotek, ki ga dobimo tako, da skupno površino mitohondrijev vsake celice delimo s površino citoplazme (površina citoplazme = površina celice - površina celičnega jedra) × 100. Okroglost mitohondrijev se izračuna s formulo [4π∙(površina/obseg 2)]. Analizirana je bila morfologija mitohondrijev in razdeljena v dve kategoriji ("cevasti" in "mehurni") glede na njihove glavne oblike.
Analiza števila in gostote avtofagosomov/lizosomov. Za ročno orisanje kontur vsakega avtofagosoma/lizosoma na digitalni sliki uporabite programsko opremo ImageJ. Površina avtofagosomov/lizosomov je izražena kot odstotek, izračunan tako, da se skupna površina strukture avtofagosomov/lizosomov vsake celice deli s površino citoplazme (površina citoplazme = površina celice - površina jedra) × 100. Gostota avtofagosomov/lizosomov se izračuna tako, da se skupno število deli s številom struktur avtofagosomov/lizosomov na celico (glede na površino citoplazme) (površina citoplazme = površina celice - površina jedra).
Označevanje za akutno sekcioniranje in pripravo vzorcev. Za poskuse, ki zahtevajo označevanje z glukozo, prenesite akutne možganske rezine v predinkubacijsko komoro, ki vsebuje nasičen ogljik (95 % O2 in 5 % CO2), visokokalorični solni fluid Ca2+ (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrijev fosfatni pufer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoze, 1,0 mM CaCl2 in 2,0 mM MgCl2, pH nastavljen na 7,4 in od 310 do 320 mOsm), v katerem je glukoza substituirana z glukozo 13C6- (Eurisotop, kataloška številka CLM-1396). Za poskuse, ki zahtevajo označevanje s piruvatom, prenesite akutne možganske rezine v višjo koncentracijo Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrijev fosfatni pufer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoze, 1,0 mM CaCl2 in dodajte 2,0 mM MgCl2, prilagodite pH na 7,4 in od 310 do 320 mOsm) in dodajte 1 mM 1-[1-13C]piruvata (Eurisotop, kataloška številka CLM-1082). Rezine inkubirajte 90 minut pri 37 °C. Na koncu poskusa so bile rezine hitro oprane z vodno raztopino (pH 7,4), ki je vsebovala 75 mM amonijevega karbonata, in nato homogenizirane v acetonitrilu (ACN):metanolu:vodi v razmerju 40:40:20 (v:v:v). Po 30-minutni inkubaciji rezin na ledu so vzorce centrifugirali 10 minut pri 21.000 g pri 4 °C, bistri supernatant pa so posušili v koncentratorju SpeedVac. Nastali posušeni metabolitni pelet je bil do analize shranjen pri -80 °C.
Analiza aminokislin, označenih s 13C, s tekočinsko kromatografijo in masno spektrometrijo. Za analizo s tekočinsko kromatografijo in masno spektrometrijo (LC-MS) smo pelet metabolita resuspendirali v 75 μl vode kakovosti LC-MS (Honeywell). Po centrifugiranju pri 21.000 g 5 minut pri 4 °C smo 20 μl očiščenega supernatanta uporabili za analizo pretoka aminokislin, preostanek ekstrakta pa smo takoj uporabili za analizo anionov (glej spodaj). Analiza aminokislin je bila izvedena z uporabo prej opisanega protokola za derivatizacijo benzoil klorida (55, 56). V prvem koraku smo 20 μl ekstrakta metabolita dodali 10 μl 100 mM natrijevega karbonata (Sigma-Aldrich), nato pa smo 10 μl 2 % benzoil klorida (Sigma-Aldrich) dodali ACN kakovosti LC. Vzorec smo na kratko premešali v vrtincu in nato centrifugirali pri 21.000 g 5 minut pri 20 °C. Očiščeni supernatant prenesite v 2 ml vialo za avtosampler s stožčastim steklenim vložkom (volumen 200 μl). Vzorce analizirajte z ultra visokozmogljivim sistemom LC Acquity iClass (Waters), ki je bil povezan z visokoločljivostnim natančnim masnim spektrometrom Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Za analizo vbrizgajte 2 μl derivatiziranega vzorca v visoko trdnostno kolono silicijevega dioksida T3 (Waters) velikosti 100 × 1,0 mm, ki vsebuje delce velikosti 1,8 μm. Pretok je 100 μl/min, puferski sistem pa sestavljata pufer A (10 mM amonijev format in 0,15 % mravljinčna kislina v vodi) in pufer B (ACN). Gradient je naslednji: 0 % B pri 0 minutah; 0 % B. 0 do 15 % B pri 0 do 0,1 minuti; 15 do 17 % B pri 0,1 do 0,5 minuti; B pri 17 do 55 % pri 0,5 do 14 minutah; B pri 55 do 70 % pri 14 do 14,5 minutah; pri 14,5 do 70 do 100 % B pri 18 minutah; 100 % B pri 18 do 19 minutah; 100 do 0 % B pri 19 do 19,1 minutah; 0 % B pri 19,1 do 28 minutah (55, 56). Masni spektrometer QE-HF deluje v načinu pozitivne ionizacije z masnim razponom m/z (razmerje masa/naboj) od 50 do 750. Uporabljena ločljivost je 60.000, dosežena ionska tarča s krmiljenjem ojačanja (AGC) pa je 3 × 106, najdaljši ionski čas pa je 100 milisekund. Ogrevani vir elektropršilne ionizacije (ESI) deluje pri napetosti pršenja 3,5 kV, kapilarni temperaturi 250 °C, pretoku zraka v plašču 60 AU (poljubnih enot) in pomožnem pretoku zraka 20 AU. 250 °C. Leča S je nastavljena na 60 AU.
Analiza organskih kislin, označenih z 13C, z anionsko kromatografijo-MS. Preostala oborina metabolita (55 μl) je bila analizirana z uporabo sistema ionske kromatografije Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific), povezanega z masnim spektrometrom QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Skratka, 5 μl ekstrakta metabolita je bilo vbrizganih v kolono Dionex IonPac AS11-HC, opremljeno s HPLC (2 mm × 250 mm, velikost delcev 4 μm, Thermo Fisher Scientific) v načinu delne zanke s polnilnim razmerjem 1. ) Predkolona Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific). Temperatura kolone se vzdržuje pri 30 °C, avtosampler pa je nastavljen na 6 °C. Za ustvarjanje gradienta kalijevega hidroksida skozi generator eluenta se uporabi kartuša s kalijevim hidroksidom, priložena deionizirani vodi. Ločevanje metabolitov s pretokom 380 μl/min, z uporabo naslednjega gradienta: 0 do 3 minute, 10 mM KOH; 3 do 12 minut, 10 do 50 mM KOH; 12 do 19 minut, 50 do 100 mM KOH; 19 do 21 minut, 100 mM KOH; 21 do 21,5 minut, 100 do 10 mM KOH. Kolono smo ponovno uravnotežili z 10 mM KOH 8,5 minut.
Eluirani metaboliti se po koloni združijo s tokom izopropanola s pretokom 150 μl/min in nato usmerijo v masni spektrometer z visoko ločljivostjo, ki deluje v načinu negativne ionizacije. MS spremlja masni razpon od m/z 50 do 750 z ločljivostjo 60.000. AGC je nastavljen na 1 × 106, najdaljši ionski čas pa je 100 ms. Ogrevani vir ESI je deloval pri napetosti pršenja 3,5 kV. Druge nastavitve ionskega vira so naslednje: temperatura kapilare 275 °C; pretok plina v plašču 60 AU; pretok pomožnega plina 20 AU pri 300 °C in nastavitev leče S na 60 AU.
Analiza podatkov metabolitov, označenih z 13C. Za analizo podatkov razmerja izotopov uporabite programsko opremo TraceFinder (različica 4.2, Thermo Fisher Scientific). Identiteta vsake spojine je bila preverjena z zanesljivo referenčno spojino in neodvisno analizirana. Za izvedbo analize obogatitve izotopov je bila površina ekstrahiranega ionskega kromatograma (XIC) vsakega izotopa 13C (Mn) ekstrahirana iz [M + H] +, kjer je n število ogljika ciljne spojine, ki se uporablja za analizo aminokislin, ali [MH] + za analizo anionov. Masna natančnost XIC je manjša od petih delcev na milijon, natančnost RT pa je 0,05 minute. Analiza obogatitve se izvede z izračunom razmerja vsakega zaznanega izotopa do vsote vseh izotopov ustrezne spojine. Ta razmerja so podana kot odstotne vrednosti za vsak izotop, rezultati pa so izraženi kot molarni odstotek obogatitve (MPE), kot je opisano že prej (42).
Zamrznjeni nevronski pelet smo homogenizirali v ledeno mrzlem 80 % metanolu (v/v), mešali v vrtincu in inkubirali pri -20 °C 30 minut. Vzorec smo ponovno mešali v vrtincu in mešali pri +4 °C 30 minut. Vzorec smo centrifugirali pri 21.000 g 5 minut pri 4 °C, nato pa smo nastali supernatant zbrali in posušili s koncentratorjem SpeedVac pri 25 °C za nadaljnjo analizo. Kot je opisano zgoraj, smo izvedli LC-MS analizo aminokislin razvrščenih celic. Z uporabo programa TraceFinder (različica 4.2, Thermo Fisher Scientific) smo izvedli analizo podatkov z uporabo monoizotopske mase vsake spojine. Kvantilna normalizacija podatkov o metabolitih je bila izvedena z uporabo programskega paketa preprocessCore (57).
Priprava rezin. Miš so hitro anestezirali z ogljikovim dioksidom in ji odvzeli glavo, možgane so hitro odstranili iz lobanje in z vibrirajočim nožem, napolnjenim z ledom (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Nemčija), razrezali na sagitalne rezine velikosti 300 do 375 μm. Hladno uplinjanje ogljika (95 % O2 in 5 % CO2). Nizek Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrijev fosfatni pufer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoza, 1,0 mM CaCl2 in 6,0 mM MgCl2. pH nastavite na 7,4 in 310 do 330 mOsm). Pridobljene možganske rezine prenesite v komoro, ki vsebuje višjo koncentracijo Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natrijevega fosfatnega pufra, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoze, 4,0 mM CaCl2 in 3,5 mM MgCl2) pH 7,4 in 310 do 320 mOsm). Rezine shranite 20 do 30 minut, da jih lahko pred snemanjem obnovite.
snemanje. Za vse posnetke je bila uporabljena mikroskopska mizica, opremljena s fiksno snemalno komoro in 20-kratno povečavo za imerzijo v vodo (Scientifica). Domnevne Purkinjejeve celice so bile identificirane po (i) velikosti telesa, (ii) anatomski lokaciji malih možganov in (iii) izražanju fluorescentnega reporterskega gena mtYFP. Patch pipeta z upornostjo konice od 5 do 11 megaohmov je bila izvlečena z borosilikatno stekleno kapilaro (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Nemčija) in horizontalno pipeto Instruments (P-1000, Sutter), Novato, Kalifornija. Vsi posnetki so bili izvedeni z ojačevalnikom ELC-03XS npi patch clamp (npi electronic GmbH, Tam, Nemčija), ki ga je krmilila programska oprema Signal (različica 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Združeno kraljestvo). Poskus je bil posnet s frekvenco vzorčenja 12,5 kHz. Signal se filtrira z dvema kratkopasovnima Besselovima filtroma z mejnima frekvencama 1,3 oziroma 10 kHz. Kapacitivnost membrane in pipete se kompenzira s kompenzacijskim vezjem z uporabo ojačevalnika. Vsi poskusi so bili izvedeni pod nadzorom kamere Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Nemčija), ki jo je upravljala programska oprema Hokawo (različica 2.8, Hamamatsu, Gerden, Nemčija).
Rutinska konfiguracija in analiza celih celic. Tik pred snemanjem napolnite pipeto z notranjo raztopino, ki vsebuje naslednje snovi: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM kalijev glukonat, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM gvanozin trifosfat (GTP) (Na) in 10,0 mM kreatinin fosfat, pH je bil nastavljen na 7,25, osmotski tlak pa je bil 290 mOsm (saharoza). Takoj po uporabi sile 0 pA za pretrg membrane je bil izmerjen mirujoči membranski potencial. Vhodna upornost se meri z uporabo hiperpolariziranih tokov -40, -30, -20 in -10 pA. Izmerite velikost napetostnega odziva in z Ohmovim zakonom izračunajte vhodno upornost. Spontana aktivnost je bila 5 minut zabeležena v napetostnih kleščah, sPSC pa je bil identificiran in izmerjen v programu Igor Pro (različica 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, ZDA) z uporabo polavtomatskega skripta za prepoznavanje. IV krivulja in tok v ustaljenem stanju se merita tako, da se baterija vpne pri različnih potencialih (začenši od -110 mV) in napetost se povečuje v korakih po 5 mV. Proizvodnja AP je bila preizkušena z uporabo depolarizacijskega toka. Celico vpnite pri -70 mV med uporabo impulza depolarizacijskega toka. Prilagodite velikost koraka vsake snemalne enote posebej (od 10 do 60 pA). Izračunajte najvišjo frekvenco AP tako, da ročno preštejete impulzne konice, ki povzročijo najvišjo frekvenco AP. Prag AP se analizira z uporabo drugega odvoda depolarizacijskega impulza, ki prvi sproži enega ali več AP.
Konfiguracija in analiza perforiranega obliža. Izvedite snemanje perforiranega obliža z uporabo standardnih protokolov. Uporabite pipeto brez ATP in GTP, ki ne vsebuje naslednjih sestavin: 128 mM glukonata K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA in 2 mM MgCl2, in uravnajte pH na 7,2 (z uporabo KOH). ATP in GTP sta izpuščena iz znotrajcelične raztopine, da se prepreči nenadzorovana prepustnost celične membrane. Pipeta z obližem je napolnjena z notranjo raztopino, ki vsebuje amfotericin (približno 200 do 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich), da dobite zapis perforiranega obliža. Amfotericin je bil raztopljen v dimetil sulfoksidu (končna koncentracija: 0,1 do 0,3 %; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Uporabljena koncentracija DMSO ni imela pomembnega vpliva na preučevane nevrone. Med postopkom prebijanja se je upornost kanala (Ra) neprekinjeno spremljala, poskus pa se je začel po stabilizaciji amplitude Ra in AP (20–40 minut). Spontana aktivnost se meri v napetostnih in/ali tokovnih kleščah 2 do 5 minut. Analiza podatkov je bila izvedena z uporabo programov Igor Pro (različica 7.05.2, WaveMetrics, ZDA), Excel (različica 2010, Microsoft Corporation, Redmond, ZDA) in GraphPad Prism (različica 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, Kalifornija). Za identifikacijo spontanih AP se uporablja vtičnik IgorPro NeuroMatic v3.0c. AP se samodejno identificirajo z uporabo danega praga, ki se individualno prilagodi za vsak zapis. Z uporabo intervala konic se določi frekvenca konic z največjo trenutno frekvenco konic in povprečno frekvenco konic.
Izolacija PN. S prilagoditvijo predhodno objavljenemu protokolu so bili PN očiščeni iz mišjega cerebeluma v določeni fazi (58). Skratka, mali možgani so bili secirani in zdrobljeni v ledeno hladnem disociacijskem mediju [brez HBSS Ca2+ in Mg2+, dopolnjenem z 20 mM glukoze, penicilina (50 U/ml) in streptomicina (0,05 mg/ml)], nato pa je bil medij prebavljen v papainu [HBSS, dopolnjen z 1-cistein·HCl (1 mg/ml), papainom (16 U/ml) in deoksiribonukleazo I (DNaza I; 0,1 mg/ml)]. Obdelujejo 30 minut pri 30 °C. Najprej tkiva sperite v mediju HBSS, ki vsebuje jajčno sluz (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) in DNazo (0,1 mg/ml) pri sobni temperaturi, da preprečite encimsko razgradnjo, nato pa v mediju HBSS, ki vsebuje 20 mM glukoze. Nežno mletje v HBSS, penicilina (50 U/ml), streptomicina (0,05 mg/ml) in DNaze (0,1 mg/ml) sprosti posamezne celice. Nastalo celično suspenzijo filtrirajte skozi 70 μm celično cedilo, nato pa celice zdrobite s centrifugiranjem (1110 vrt/min, 5 minut, 4 °C) in resuspendirajte v sortirnem mediju [HBSS, dopolnjen z 20 mM glukozo, 20 % fetalnim govejim serumom, penicilinom (50 U/ml) in streptomicinom (0,05 mg/ml)]; ocenite viabilnost celic s propidijevim jodidom in prilagodite gostoto celic na 1 × 106 do 2 × 106 celic/ml. Pred pretočno citometrijo smo suspenzijo filtrirali skozi 50 μm celično cedilo.
Pretočni citometer. Sortiranje celic je bilo izvedeno pri 4 °C z uporabo naprave FACSAria III (BD Biosciences) in programske opreme FACSDiva (BD Biosciences, različica 8.0.1). Celična suspenzija je bila sortirana z uporabo šobe 100 μm pod tlakom 20 psi s hitrostjo ~2800 dogodkov/s. Ker tradicionalni kriteriji za ločevanje (velikost celic, bimodalna diskriminacija in značilnosti sipanja) ne morejo zagotoviti pravilne izolacije PN od drugih vrst celic, je strategija ločevanja določena na podlagi neposredne primerjave intenzivnosti YFP in avtofluorescence pri miših mitoYFP+ ​​​​in kontrolnih miših mitoYFP −. YFP se vzbuja z obsevanjem vzorca z lasersko linijo 488 nm, signal pa se zazna z uporabo pasovno prepustnega filtra 530/30 nm. Pri miših mitoYFP+ ​​​​se za razlikovanje fragmentov nevronskih teles in aksonov uporablja tudi relativna moč reporterskega gena Rosa26-mitoYFP. 7-AAD se vzbuja z rumenim laserjem z valovno dolžino 561 nm in detektira s pasovno prepustnim filtrom 675/20 nm, da se izključijo odmrle celice. Da bi hkrati ločili astrocite, je bila celična suspenzija obarvana z ACSA-2-APC, nato je bil vzorec obsevan z lasersko linijo 640 nm in za detekcijo signala je bil uporabljen pasovno prepustni filter 660/20 nm.
Zbrane celice so bile peletirane s centrifugiranjem (1110 vrt/min, 5 minut, 4 °C) in shranjene pri -80 °C do uporabe. Miši Mfn2cKO in njihovi mladiči iz legla so bili razvrščeni isti dan, da se čim bolj zmanjša variabilnost postopka. Predstavitev in analiza podatkov FACS sta bili izvedeni z uporabo programske opreme FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, ZDA).
Kot je bilo že omenjeno (59), se za izolacijo DNK iz razvrščenih nevronov za kasnejšo kvantifikacijo mtDNK uporablja PCR v realnem času. Linearnost in prag občutljivosti sta bili najprej preizkušeni z izvajanjem qPCR na različnem številu celic. Skratka, zberemo 300 PN v liznem pufru, ki je sestavljen iz 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5 % Tween 20 in proteinaze K (200 ng/ml), in inkubiramo pri 55 °C 120 minut. Celice smo nadalje inkubirali pri 95 °C 10 minut, da smo zagotovili popolno inaktivacijo proteinaze K. Z uporabo sonde TaqMan (Thermo Fisher), specifične za mt-Nd1, smo mtDNK izmerili s semikvantitativno PCR v sistemu 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific). Science, kataloška številka Mm04225274_s1), geni mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, kataloška številka AIVI3E8) in 18S (Thermo Fisher Scientific, kataloška številka Hs99999901_s1).
Priprava vzorca proteoma. Z 10-minutnim segrevanjem raztopine pri 95 °C in sonikacijo v liznem pufru [6 M gvanidin klorid, 10 mM tris(2-karboksietil)fosfin hidroklorid, 10 mM kloroacetamid in 100 mM tris-Lyse zamrznjeni nevronski pelet v HCl]. Na Bioruptorju (Diagenode) 10 minut (30 sekund pulza / 30 sekund premora). Vzorec smo razredčili v razmerju 1:10 v 20 mM tris-HCl (pH 8,0), zmešali s 300 ng tripsina zlata (Promega) in inkubirali čez noč pri 37 °C, da smo dosegli popolno prebavo. Drugi dan smo vzorec centrifugirali pri 20.000 g 20 minut. Supernatant smo razredčili z 0,1 % mravljinčno kislino in raztopino razsolili z doma izdelanimi konicami StageTips. Vzorec smo posušili v instrumentu SpeedVac (Eppendorf koncentrator plus 5305) pri 45 °C, nato pa smo peptid suspendirali v 0,1 % mravljinčni kislini. Vse vzorce je hkrati pripravila ista oseba. Za analizo vzorcev astrocitov smo 4 μg razsoljenih peptidov označili s tandemsko masno oznako (TMT10plex, kataloška številka 90110, Thermo Fisher Scientific) z razmerjem peptida in reagenta TMT 1:20. Za označevanje s TMT smo 0,8 mg reagenta TMT resuspendirali v 70 μl brezvodnega ACN, posušeni peptid pa smo rekonstituirali v 9 μl 0,1 M TEAB (trietilamonijevega bikarbonata), ki smo mu dodali 7 μl reagenta TMT v ACN. Koncentracija je bila 43,75 %. Po 60 minutah inkubacije smo reakcijo ustavili z 2 μl 5 % hidroksilamina. Označene peptide smo zbrali, posušili, resuspendirali v 200 μl 0,1 % mravljinčne kisline (FA), razdelili na dva dela in nato razsolili z uporabo doma izdelanih konic StageTips. Z uporabo ultra visokozmogljivega tekočinskega kromatografa UltiMate 3000 (ultra visokozmogljiv tekočinski kromatograf UltiMate 3000) smo eno od obeh polovic frakcionirali na 1 mm x 150 mm kromatografski koloni Acquity, napolnjeni z delci C18 velikosti 130 Å1,7 μm (Waters, kataloška št. SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific. Peptide smo ločili s pretokom 30 μl/min, ločili od 1 % do 50 % pufra B 85 minut s postopnim gradientom 96 minut, od 50 % do 95 % pufra B 3 minute, nato 8 minut za 95 % pufer B; Pufer A je 5 % ACN in 10 mM amonijevega bikarbonata (ABC), pufer B pa 80 % ACN in 10 mM ABC. Frakcije zbirajte vsake 3 minute in jih združite v dve skupini (1 + 17, 2 + 18 itd.) ter jih posušite v vakuumski centrifugi.
Analiza LC-MS/MS. Za masno spektrometrijo so bili peptidi (številka r119.aq) ločeni na analitični koloni PicoFrit s premerom 25 cm in notranjim premerom 75 μm (nova objektivna leča, kataloška številka PF7508250), opremljeni z 1,9 μm medijem ReproSil-Pur 120 C18-AQ (Dr. Maisch, mat), uporabite EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Nemčija). Kolona je bila vzdrževana pri 50 °C. Pufra A in B sta 0,1 % mravljinčna kislina v vodi oziroma 0,1 % mravljinčna kislina v 80 % ACN. Peptide smo ločili od 6 % do 31 % pufra B 65 minut in od 31 % do 50 % pufra B 5 minut z gradientom 200 nl/min. Eluirane peptide smo analizirali na masnem spektrometru Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Meritev m/z predhodnika peptida se izvaja z ločljivostjo 120.000 v območju od 350 do 1500 m/z. Z uporabo 27 % normalizirane energije trka se za cepitev z visokoenergijsko disociacijo C pasti (HCD) izbere najmočnejši predhodnik z nabojnim stanjem od 2 do 6. Čas cikla je nastavljen na 1 s. Vrednost m/z peptidnega fragmenta je bila izmerjena v ionski pasti z uporabo najmanjše tarče AGC 5 × 104 in najdaljšega časa vbrizgavanja 86 ms. Po fragmentaciji je bil predhodnik za 45 sekund uvrščen na seznam dinamičnih izključitev. Peptidi, označeni s TMT, so bili ločeni na 50 cm, 75 μm koloni Acclaim PepMap (Thermo Fisher Scientific, kataloška številka 164942), migracijski spektri pa so bili analizirani na masnem spektrometru Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific), opremljenem z opremo za visokopoljske asimetrične valovne ione (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific), ki deluje pri dveh kompenzacijskih napetostih -50 in -70 V. Za merjenje signala ionskih poročil TMT se uporablja MS3, izbran na podlagi sinhronizacijskega predhodnika. Ločevanje peptidov je bilo izvedeno na EASY-nLC 1200 z uporabo 90-odstotne linearne gradientne elucije s koncentracijo pufra od 6 % do 31 %; pufer A je bil 0,1 % FA, pufer B pa 0,1 % FA in 80 % ACN. Analitska kolona deluje pri 50 °C. Za razdelitev izvirne datoteke glede na kompenzacijsko napetost FAIMS uporabite FreeStyle (različica 1.6, Thermo Fisher Scientific).
Identifikacija in kvantifikacija beljakovin. Z uporabo integriranega iskalnika Andromeda so bili originalni podatki analizirani z uporabo programa MaxQuant različice 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Poleg zaporedij Cre rekombinaze in YFP, pridobljenih iz Aequorea victoria, so bili v spektrih peptidnih fragmentov poiskani kanonično zaporedje in zaporedje izoform mišjega referenčnega proteoma (ID proteoma UP000000589, preneseno z UniProt maja 2017). Oksidacija metionina in acetilacija N-terminala beljakovin sta bili nastavljeni kot spremenljivi modifikaciji; metilacija cistein karbamoila je bila nastavljena kot fiksna modifikacija. Parametri prebave so nastavljeni na »specifičnost« in »tripsin/P«. Najmanjše število peptidov in razor peptidov, uporabljenih za identifikacijo beljakovin, je 1; najmanjše število edinstvenih peptidov je 0. V pogojih ujemanja peptidnih zemljevidov je bila stopnja identifikacije beljakovin 0,01. Omogočena je možnost »Drugi peptid«. Za prenos uspešnih identifikacij med različnimi originalnimi datotekami uporabite možnost »ujemanje med poskusi«. Za kvantifikacijo brez označevanja (LFQ) uporabite minimalno razmerje LFQ 1 (60). Intenzivnost LFQ se filtrira za vsaj dve veljavni vrednosti v vsaj eni skupini genotipov v vsaki časovni točki in ekstrapolira iz normalne porazdelitve s širino 0,3 in navzdol za 1,8. Za analizo rezultatov LFQ uporabite računalniško platformo Perseus (https://maxquant.net/perseus/) in R (https://r-project.org/). Za analizo diferencialne ekspresije je bil uporabljen dvosmerni zmerni t-test iz programskega paketa limma (61). Raziskovalna analiza podatkov je bila izvedena z uporabo ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally in pheatmap. Podatki proteomike na osnovi TMT so bili analizirani z uporabo MaxQuant različice 1.6.10.43. Poiščite surove proteomske podatke v UniProtovi podatkovni bazi o človeški proteomiki, ki je bila prenesena septembra 2018. Analiza vključuje korekcijski faktor čistosti izotopov, ki ga je zagotovil proizvajalec. Za analizo diferencialnih izrazov uporabite limmo v R. Izvirni podatki, rezultati iskanja v zbirki podatkov ter potek dela in rezultati analize podatkov so shranjeni v zavezništvu ProteomeXchange prek partnerskega repozitorija PRIDE z identifikatorjem nabora podatkov PXD019690.
Funkcionalne opombe bogatijo analizo. Za določitev bogastva izrazov funkcionalnih opomb v naboru podatkov po 8 tednih je bilo uporabljeno orodje Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) (slika 1). Skratka, kvantitativni seznam beljakovin, pridobljen z analizo podatkov LC-MS/MS (tandemska masna spektrometrija), je bil uporabljen z naslednjimi kriteriji filtriranja: Kot vrsta in ozadje je izbran Mus musculus, kategorija pa prikazuje vrednost P, prilagojeno po Benjaminiju za obogatitev 0,05 ali manj, ki se šteje za pomembno. Za ta graf je prikazanih pet najvišjih presežnih kategorij v vsaki skupini na podlagi prilagojene vrednosti P. Z uporabo večkratnega t-testa, z uporabo dvostopenjskega linearnega programa povečanja po Benjaminiju, Kriegerju in Yekutieliju (Q = 5 %), je bila izvedena analiza izražanja beljakovin v časovnem poteku na pomembnih kandidatih, identificiranih v vsaki kategoriji, in vsaka vrstica je bila analizirana ločeno. Ni treba sprejeti doslednega standardnega odklona.
Da bi primerjali rezultate te študije z objavljenimi podatkovnimi bazami in ustvarili Vennov diagram na sliki 1, smo združili kvantitativni seznam beljakovin z opombami MitoCarta 2.0 (24). Za ustvarjanje diagrama smo uporabili spletno orodje Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/).
Za podrobne informacije o statističnih postopkih, uporabljenih za proteomsko analizo, glejte ustrezni razdelek Materiali in metode. Za vse druge poskuse so podrobne informacije na voljo v ustrezni legendi. Če ni drugače navedeno, so vsi podatki izraženi kot povprečje ± SEM, vse statistične analize pa so bile izvedene s programsko opremo GraphPad Prism 8.1.2.
Za dodatno gradivo k temu članku glejte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
To je članek z odprtim dostopom, distribuiran pod pogoji licence Creative Commons Priznanje avtorstva-Nekomercialno, ki dovoljuje uporabo, distribucijo in reprodukcijo v katerem koli mediju, če končna uporaba ni namenjena komercialnemu dobičku in če je predpostavka, da je izvirno delo pravilno. Referenca.
Opomba: Prosimo vas, da navedete svoj e-poštni naslov le zato, da oseba, ki jo priporočite strani, ve, da želite, da vidi e-pošto in da ne gre za neželeno pošto. E-poštnih naslovov ne bomo zbirali.
To vprašanje se uporablja za preverjanje, ali ste obiskovalec, in za preprečevanje samodejnega pošiljanja neželene pošte.
Avtorji: E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomska analiza disfunkcionalnih nevronov je pokazala, da se aktivirajo presnovni programi za preprečevanje nevrodegeneracije.
Avtorji: E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomska analiza disfunkcionalnih nevronov je pokazala, da se aktivirajo presnovni programi za preprečevanje nevrodegeneracije.
©2020 Ameriško združenje za napredek znanosti. vse pravice pridržane. AAAS je partner HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef in COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.