Hvala, ker ste obiskali Nature.com. Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS. Za najboljše rezultate priporočamo, da uporabite novejšo različico brskalnika (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju). Medtem, da bi zagotovili stalno podporo, spletno mesto prikazujemo brez stilov ali JavaScripta.
Propionska kislina (PPA) se uporablja za preučevanje vloge mitohondrijske disfunkcije pri nevrorazvojnih motnjah, kot je motnja avtističnega spektra. Znano je, da PPA moti mitohondrijsko biogenezo, metabolizem in promet. Vendar pa učinki PPA na mitohondrijsko dinamiko, fisijo in fuzijo ostajajo problematični zaradi kompleksne časovne narave teh mehanizmov. Tukaj uporabljamo komplementarne kvantitativne slikovne tehnike za raziskovanje, kako PPA vpliva na mitohondrijsko ultrastrukturo, morfologijo in dinamiko v nevronom podobnih celicah SH-SY5Y. PPA (5 mM) je povzročil znatno zmanjšanje mitohondrijske površine (p < 0,01), premera in obsega Fereta (p < 0,05) ter površine 2 (p < 0,01). Analiza lokatorja mitohondrijskih dogodkov je pokazala znatno povečanje (p < 0,05) dogodkov fisije in fuzije, s čimer se ohranja integriteta mitohondrijske mreže v stresnih pogojih. Poleg tega se je izražanje mRNA cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) in OPA1 (p < 0,05) znatno zmanjšalo. 01). To ponazarja preoblikovanje mitohondrijske morfologije, biogeneze in dinamike za ohranitev funkcije v stresnih pogojih. Naši podatki ponujajo nov vpogled v učinke PPA na mitohondrijsko dinamiko in poudarjajo uporabnost slikovnih tehnik za preučevanje kompleksnih regulatornih mehanizmov, vključenih v mitohondrijske stresne odzive.
Mitohondriji so sestavni udeleženci v različnih celičnih funkcijah, ki presegajo njihovo tipično vlogo pri proizvodnji energije in biosintezi. Mitohondrijski metabolizem je ključni regulator kalcijeve signalizacije, presnovne in redoks homeostaze, vnetne signalizacije, epigenetskih modifikacij, celične proliferacije, diferenciacije in programirane celične smrti1. Zlasti mitohondrijski metabolizem je ključnega pomena za razvoj, preživetje in delovanje nevronov in je v veliki meri vpleten v različne manifestacije nevropatologije2,3,4.
V zadnjem desetletju se je metabolni status izkazal kot osrednji regulator nevrogeneze, diferenciacije, zorenja in plastičnosti5,6. V zadnjem času sta mitohondrijska morfologija in dinamika postali še posebej pomembni komponenti mitozo, dinamičnega procesa, ki ohranja bazen zdravih mitohondrijev znotraj celic. Mitohondrijsko dinamiko uravnavajo kompleksne medsebojno odvisne poti, od mitohondrijske biogeneze in bioenergetike do mitohondrijske fisije, fuzije, transporta in očistka7,8. Motnje katerega koli od teh integrativnih mehanizmov poslabšajo vzdrževanje zdravih mitohondrijskih omrežij in imajo globoke funkcionalne posledice za nevrološki razvoj9,10. Dejansko je disregulacija mitohondrijske dinamike opažena pri številnih psihiatričnih, nevrodegenerativnih in nevrorazvojnih motnjah, vključno z motnjami avtističnega spektra (MAS)11,12.
Avtizam je heterogena nevrološka razvojna motnja s kompleksno genetsko in epigenetsko arhitekturo. Dednost avtizma je nesporna, vendar osnovna molekularna etiologija ostaja slabo razumljena. Kopičenje podatkov iz predkliničnih modelov, kliničnih študij in molekularnih naborov podatkov z več omikalijami zagotavlja vse več dokazov o mitohondrijski disfunkciji pri avtizmu13,14. Predhodno smo izvedli presejalni test metilacije DNK v celotnem genomu pri kohorti bolnikov z avtizmom in identificirali diferencialno metilirane gene, združene vzdolž mitohondrijskih presnovnih poti15. Kasneje smo poročali o diferencialni metilaciji centralnih regulatorjev mitohondrijske biogeneze in dinamike, kar je bilo povezano s povečanim številom kopij mtDNA in spremenjenim presnovnim profilom urina pri avtizmu16. Naši podatki zagotavljajo vse več dokazov, da imata mitohondrijska dinamika in homeostaza osrednjo vlogo v patofiziologiji avtizma. Zato je izboljšanje mehanističnega razumevanja odnosa med mitohondrijsko dinamiko, morfologijo in funkcijo ključni cilj tekočih raziskav nevroloških bolezni, za katere je značilna sekundarna mitohondrijska disfunkcija.
Molekularne tehnike se pogosto uporabljajo za preučevanje vloge specifičnih genov v mitohondrijskih stresnih odzivih. Vendar pa je ta pristop lahko omejen zaradi večplastne in časovne narave mehanizmov mitotičnega nadzora. Poleg tega je diferencialna ekspresija mitohondrijskih genov posredni pokazatelj funkcionalnih sprememb, še posebej ker se običajno analizira le omejeno število genov. Zato so bile predlagane bolj neposredne metode za preučevanje mitohondrijske funkcije in bioenergetike17. Mitohondrijska morfologija je tesno povezana z mitohondrijsko dinamiko. Oblika, povezljivost in struktura mitohondrijev so ključne za proizvodnjo energije ter preživetje mitohondrijev in celic5,18. Poleg tega se različne komponente mitoze osredotočajo na spremembe v mitohondrijski morfologiji, kar lahko služi kot uporabne končne točke mitohondrijske disfunkcije in zagotavlja osnovo za nadaljnje mehanistične študije.
Mitohondrijsko morfologijo je mogoče neposredno opazovati s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM), kar omogoča podrobno preučevanje celične ultrastrukture. TEM neposredno vizualizira morfologijo, obliko in strukturo mitohondrijskih krist pri ločljivosti posameznih mitohondrijev, namesto da bi se zanašal izključno na transkripcijo genov, izražanje beljakovin ali mitohondrijske funkcionalne parametre v celičnih populacijah17,19,20. Poleg tega TEM olajša preučevanje interakcij med mitohondriji in drugimi organeli, kot sta endoplazemski retikulum in avtofagosomi, ki igrajo ključno vlogo pri mitohondrijski funkciji in homeostazi21,22. Zaradi tega je TEM dobro izhodišče za preučevanje mitohondrijske disfunkcije, preden se osredotočimo na specifične poti ali gene. Ker mitohondrijska funkcija postaja vse bolj pomembna za nevropatologijo, obstaja jasna potreba po neposrednem in kvantitativnem preučevanju mitohondrijske morfologije in dinamike v in vitro nevronskih modelih.
V tem članku preučujemo mitohondrijsko dinamiko v nevronskem modelu mitohondrijske disfunkcije pri motnjah avtističnega spektra. Predhodno smo poročali o diferencialni metilaciji propionil-CoA karboksilaze beta (PCCB) v ASD15, podenoti mitohondrijskega encima propionil-CoA karboksilaze PCC. Znano je, da disregulacija PCC povzroča toksično kopičenje propionilnih derivatov, vključno s propionsko kislino (PPA)23,24,25. Dokazano je, da PPA moti nevronski metabolizem in spreminja vedenje in vivo ter je uveljavljen živalski model za preučevanje nevrorazvojnih mehanizmov, vključenih v ASD26,27,28. Poleg tega je bilo poročano, da PPA moti mitohondrijski membranski potencial, biogenezo in dihanje in vitro ter se pogosto uporablja za modeliranje mitohondrijske disfunkcije v nevronih29,30. Vendar pa vpliv mitohondrijske disfunkcije, ki jo povzroča PPA, na morfologijo in dinamiko mitohondrijev ostaja slabo razumljen.
Ta študija uporablja komplementarne slikovne tehnike za kvantificiranje učinkov PPA na mitohondrijsko morfologijo, dinamiko in delovanje v celicah SH-SY5Y. Najprej smo razvili metodo TEM za vizualizacijo sprememb v mitohondrijski morfologiji in ultrastrukturi17,31,32. Glede na dinamično naravo mitohondrijev33 smo uporabili tudi analizo lokalizatorja mitohondrijskih dogodkov (MEL) za kvantificiranje sprememb v ravnovesju med dogodki fisije in fuzije, števila in volumna mitohondrijev pod stresom PPA. Nazadnje smo preučili, ali sta mitohondrijska morfologija in dinamika povezani s spremembami v izražanju genov, ki sodelujejo pri biogenezi, fisiji in fuziji. Skupaj naši podatki ponazarjajo izziv pojasnjevanja kompleksnosti mehanizmov, ki uravnavajo mitohondrijsko dinamiko. Poudarjamo uporabnost TEM pri preučevanju mitohondrijske morfologije kot merljive konvergentne končne točke mitoze v celicah SH-SY5Y. Poleg tega poudarjamo, da podatki TEM zagotavljajo najbogatejše informacije v kombinaciji s slikovnimi tehnikami, ki zajamejo tudi dinamične dogodke kot odziv na presnovni stres. Nadaljnja karakterizacija molekularnih regulatornih mehanizmov, ki podpirajo mitozo nevronskih celic, lahko zagotovi pomemben vpogled v mitohondrijsko komponento živčnega sistema in nevrodegenerativne bolezni.
Za indukcijo mitohondrijskega stresa so bile celice SH-SY5Y obdelane s PPA z uporabo 3 mM in 5 mM natrijevega propionata (NaP). Pred TEM so bili vzorci podvrženi kriogeni pripravi vzorcev z visokotlačnim zamrzovanjem in zamrzovanjem (slika 1a). Razvili smo avtomatiziran cevovod za analizo mitohondrijskih slik za merjenje osmih morfoloških parametrov mitohondrijskih populacij v treh bioloških ponovitvah. Ugotovili smo, da je obdelava s PPA bistveno spremenila štiri parametre: površino 2, površino, obseg in Feretov premer (slika 1b–e). Površina 2 se je bistveno zmanjšala tako pri obdelavi s 3 mM kot 5 mM PPA (p = 0,0183 oziroma p = 0,002) (slika 1b), medtem ko so se površina (p = 0,003), obseg (p = 0,0106) in Feretov premer vsi bistveno zmanjšali. V skupini, zdravljeni s 5 mM, je prišlo do znatnega zmanjšanja (p = 0,0172) v primerjavi s kontrolno skupino (slika 1c–e). Znatno zmanjšanje površine in obsega je pokazalo, da imajo celice, obdelane s 5 mM PPA, manjše, bolj zaobljene mitohondrije in da so ti mitohondriji manj podolgovati kot tisti v kontrolnih celicah. To je skladno tudi z znatnim zmanjšanjem Feretovega premera, neodvisnega parametra, ki kaže na zmanjšanje največje razdalje med robovi delcev. Opazili so spremembe v ultrastrukturi krist: kriste so postale manj izrazite pod vplivom stresa PPA (slika 1a, plošča B). Vendar pa vse slike niso jasno odražale ultrastrukture krist, zato kvantitativna analiza teh sprememb ni bila izvedena. Ti podatki TEM lahko odražajo tri možne scenarije: (1) PPA poveča cepitev ali zavira fuzijo, zaradi česar se obstoječi mitohondriji zmanjšajo; (2) povečana biogeneza ustvari nove, manjše mitohondrije ali (3) hkrati sproži oba mehanizma. Čeprav teh stanj ni mogoče razločiti s TEM, pomembne morfološke spremembe kažejo na spremembe v mitohondrijski homeostazi in dinamiki pod stresom PPA. Nato smo raziskali dodatne parametre, da bi dodatno opredelili to dinamiko in potencialne mehanizme, ki so pod njo.
Propionska kislina (PPA) preoblikuje morfologijo mitohondrijev. (a) Reprezentativne slike transmisijske elektronske mikroskopije (TEM), ki kažejo, da se velikost mitohondrijev zmanjšuje in mitohondriji postajajo manjši in bolj zaobljeni z naraščajočo obdelavo s PPA; 0 mM (neobdelano), 3 mM oziroma 5 mM. Rdeče puščice označujejo mitohondrije. (b–e) Celice SH-SY5Y, obdelane s PPA 24 ur, so bile pripravljene za TEM in rezultati so bili analizirani z uporabo Fiji/ImageJ. Štirje od osmih parametrov so pokazali pomembne razlike med kontrolnimi (neobdelanimi, 0 mM PPA) in obdelanimi (3 mM in 5 mM PPA) celicami. (b) Regija 2, (c) Površina, (d) Obseg, (e) Feretov premer. Za določitev pomembnih razlik (p < 0,05) sta bila uporabljena enosmerna analiza variance (kontrola proti obdelavi) in Dunnettov test večkratne primerjave. Podatkovne točke predstavljajo povprečno vrednost mitohondrijev za vsako posamezno celico, stolpci napak pa predstavljajo povprečje ± SEM. Prikazani podatki predstavljajo n = 3, vsaj 24 celic na ponovitev; analiziranih je bilo skupno 266 slik; * označuje p < 0,05, ** označuje p < 0,01.
Za nadaljnjo opredelitev odziva mitohondrijske dinamike na PPA smo mitohondrije obarvali s tetrametilrodamin etil estrom (TMRE) in uporabili časovno zakasnitveno mikroskopijo in MEL analizo za lokalizacijo in kvantifikacijo mitohondrijev po 24 urah pri 3 in 5 mM PPA. Obdelava dogodkov fisije in fuzije. (Slika 2a). Po MEL analizi smo mitohondrije nadalje analizirali za kvantifikacijo števila mitohondrijskih struktur in njihovega povprečnega volumna. Opazili smo majhno, a pomembno povečanje števila dogodkov fisije, ki so se pojavili pri 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] v primerjavi s cepitvijo [5,6 ± 0,3 (p < 0,05)] in fuzijo [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] ter fuzijo [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] [0,05)] [0,05)] [0,05)], pri 5 mM pa se je število dogodkov znatno povečalo v primerjavi s kontrolo (slika 3b). Število mitohondrijev se je znatno povečalo tako pri 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] kot pri 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (slika 3c), medtem ko je povprečni volumen vsake mitohondrijske strukture ostal nespremenjen (slika 3c). 3d). Če povzamemo, to kaže, da preoblikovanje mitohondrijske dinamike služi kot kompenzacijski odziv, ki uspešno ohranja integriteto mitohondrijske mreže. Povečanje števila fisijskih dogodkov pri 3 mM PPA kaže, da je povečanje števila mitohondrijev delno posledica mitohondrijske fisije, vendar glede na to, da povprečni volumen mitohondrijev ostaja v bistvu nespremenjen, biogeneze ni mogoče izključiti kot dodatnega kompenzacijskega odziva. Vendar pa so ti podatki skladni z manjšimi, okroglimi mitohondrijskimi strukturami, ki jih je opazil TEM, in kažejo tudi na pomembne spremembe v mitohondrijski dinamiki, ki jih povzroča PPA.
Propionska kislina (PPA) inducira dinamično mitohondrijsko preoblikovanje za ohranjanje integritete omrežja. Celice SH-SY5Y so bile gojene, 24 ur obdelane s 3 in 5 mM PPA ter obarvane s TMRE in Hoechst 33342, čemur je sledila MEL analiza. (a) Reprezentativne slike mikroskopije s časovnim zamikom, ki prikazujejo barvne in binarizirane projekcije največje intenzivnosti v času 2 (t2) za vsak pogoj. Izbrana območja, označena na vsaki binarni sliki, so izboljšana in prikazana v 3D v treh različnih časovnih okvirih (t1-t3), da se ponazori dinamika skozi čas; fuzijski dogodki so označeni z zeleno; fisijski dogodki so označeni z zeleno. Prikazano z rdečo. (b) Povprečno število dinamičnih dogodkov na pogoj. (c) Povprečno število mitohondrijskih struktur na celico. (d) Povprečni volumen (µm3) vsake mitohondrijske strukture na celico. Prikazani podatki so reprezentativni za n = 15 celic na tretirano skupino. Prikazane stolpce napak predstavljajo povprečje ± SEM, merilo = 10 μm, * p < 0,05.
Propionska kislina (PPA) povzroča transkripcijsko supresijo genov, povezanih z mitohondrijsko dinamiko. Celice SH-SY5Y so bile 24 ur tretirane s 3 in 5 mM PPA. Relativna kvantifikacija genov je bila izvedena z uporabo RT-qPCR in normalizirana na B2M. Geni mitohondrijske biogeneze (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 in (d) NFE2L2. Geni mitohondrijske fuzije in fisije (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 in (i) DRP1. Pomembne razlike (p < 0,05) so bile testirane z enosmerno ANOVA (kontrola proti zdravljenju) in Dunnettovim testom večkratne primerjave: * označuje p < 0,05, ** označuje p < 0,01 in **** označuje p < 0,0001. Črtice predstavljajo povprečno izražanje ± SEM. Prikazani podatki predstavljajo n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) in n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) bioloških ponovitev.
Podatki iz analiz TEM in MEL skupaj kažejo, da PPA spreminja morfologijo in dinamiko mitohondrijev. Vendar pa te slikovne tehnike ne dajejo vpogleda v osnovne mehanizme, ki poganjajo te procese. Zato smo preučili izražanje mRNA devetih ključnih regulatorjev mitohondrijske dinamike, biogeneze in mitoze kot odziv na zdravljenje s PPA. Kvantificirali smo onkogen celičnega mieloma (cMYC), jedrni respiratorni faktor (NRF1), mitohondrijski transkripcijski faktor 1 (TFAM), NFE2-podoben transkripcijski faktor BZIP (NFE2L2), gastrinu podoben protein 2 (STOML2), atrofijo vidnega živca 1 (OPA1), mitofuzin 1 (MFN1), mitofuzin 2 (MFN2) in z dinaminom povezan protein 1 (DRP1) po 24 urah zdravljenja s 3 mM in 5 mM PPA. Opazili smo zdravljenje s PPA pri 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 in p < 0,0001) in 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) (slika 3a–c). Zmanjšanje izražanja mRNA je bilo odvisno od odmerka: izražanje cMYC, NRF1 in TFAM se je pri 3 mM zmanjšalo za 5,7-krat, 2,6-krat in 1,9-krat, pri 5 mM pa za 11,2-krat, 3-krat in 2,2-krat. Nasprotno pa se centralni gen za redoks biogenezo NFE2L2 ni spremenil pri nobeni koncentraciji PPA, čeprav je bil opažen podoben od odmerka odvisen trend zmanjšanega izražanja (slika 3d).
Preučili smo tudi izražanje klasičnih genov, ki sodelujejo pri regulaciji fisije in fuzije. Domneva se, da je STOML2 vključen v fuzijo, mitofagijo in biogenezo, njegovo izražanje pa se je znatno zmanjšalo (p < 0,0001) pri 3 mM (2,4-kratna sprememba) in 5 mM (2,8-kratna sprememba) PPA (slika 1). 3d). Podobno se je izražanje fuzijskega gena OPA1 zmanjšalo pri 3 mM (1,6-kratna sprememba) in 5 mM (1,9-kratna sprememba) PPA (p = 0,006 oziroma p = 0,0024) (slika 3f). Vendar nismo ugotovili pomembnih razlik v izražanju fuzijskih genov MFN1, MFN2 ali fisijskega gena DRP1 pod 24-urnim stresom PPA (slika 3g–i). Poleg tega smo ugotovili, da se ravni štirih fuzijskih in fisijskih proteinov (OPA1, MFN1, MFN2 in DRP1) niso spremenile pod enakimi pogoji (slika 4a–d). Pomembno je omeniti, da ti podatki odražajo eno samo časovno točko in morda ne odražajo sprememb v izražanju ali aktivnosti proteinov v zgodnjih fazah stresa PPA. Vendar pa znatno zmanjšanje izražanja cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 in OPA1 kaže na pomembno transkripcijsko disregulacijo mitohondrijskega metabolizma, biogeneze in dinamike. Poleg tega ti podatki poudarjajo uporabnost slikovnih tehnik za neposredno preučevanje sprememb končnega stanja mitohondrijske funkcije.
Ravni beljakovin fuzijskega in fisijskega faktorja se po obdelavi s propionsko kislino (PPA) niso spremenile. Celice SH-SY5Y so bile 24 ur obdelane s 3 in 5 mM PPA. Ravni beljakovin so bile kvantificirane z Western blot analizo, ravni izražanja pa so bile normalizirane na skupne beljakovine. Prikazane so povprečna ekspresija beljakovin in reprezentativni Western bloti ciljnih in skupnih beljakovin. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Stolpci predstavljajo povprečje ± SEM, prikazani podatki pa so reprezentativni za n = 3 biološke ponovitve. Večkratne primerjave (p < 0,05) so bile izvedene z enosmerno analizo variance in Dunnettovim testom. Izvirni gel in blot sta prikazana na sliki S1.
Mitohondrijska disfunkcija je povezana z večsistemskimi boleznimi, od presnovnih, kardiovaskularnih in mišičnih do nevroloških bolezni1,10. Številne nevrodegenerativne in nevrodegenerativne bolezni so povezane z mitohondrijsko disfunkcijo, kar poudarja pomen teh organelov skozi celotno življenjsko dobo možganov. Te bolezni vključujejo Parkinsonovo bolezen, Alzheimerjevo bolezen in avtizem3,4,18. Vendar pa je dostop do možganskega tkiva za preučevanje teh bolezni težaven, zlasti na mehanistični ravni, zato so celični modelni sistemi nujna alternativa. V tej študiji uporabljamo celični modelni sistem z uporabo celic SH-SY5Y, obdelanih s PPA, za povzetek mitohondrijske disfunkcije, opažene pri nevronskih boleznih, zlasti pri motnjah avtističnega spektra. Uporaba tega modela PPA za preučevanje mitohondrijske dinamike v nevronih lahko ponudi vpogled v etiologijo avtizma.
Raziskali smo možnost uporabe TEM za opazovanje sprememb v mitohondrijski morfologiji. Pomembno je omeniti, da je treba TEM uporabljati pravilno, da se poveča njegova učinkovitost. Priprava kriogenih vzorcev omogoča boljše ohranjanje nevronskih struktur z istočasnim fiksiranjem celičnih komponent in zmanjšanjem nastajanja artefaktov34. V skladu s tem smo opazili, da imajo nevronom podobne celice SH-SY5Y nedotaknjene subcelične organele in podolgovate mitohondrije (slika 1a). To poudarja uporabnost kriogenih tehnik priprave za preučevanje mitohondrijske morfologije v modelih nevronskih celic. Čeprav so kvantitativne meritve ključne za objektivno analizo podatkov TEM, še vedno ni soglasja o tem, katere specifične parametre je treba meriti za potrditev mitohondrijskih morfoloških sprememb. Na podlagi velikega števila študij, ki so kvantitativno preučile mitohondrijsko morfologijo17,31,32, smo razvili avtomatiziran cevovod za analizo mitohondrijskih slik, ki meri osem morfoloških parametrov, in sicer: površino, površino2, razmerje stranic, obseg, krožnost, stopnjo, Feretov premer in okroglost.
Med njimi je PPA znatno zmanjšal površino 2, površino, obseg in Feretov premer (slika 1b–e). To je pokazalo, da so mitohondriji postali manjši in bolj zaobljen, kar je skladno s prejšnjimi študijami, ki so pokazale zmanjšanje površine mitohondrijev po 72 urah mitohondrijskega stresa, ki ga povzroča PPA30. Te morfološke značilnosti lahko kažejo na mitohondrijsko fisijo, nujen proces za sekvestracijo poškodovanih komponent iz mitohondrijske mreže, da se spodbudi njihova razgradnja z mitofagijo35,36,37. Po drugi strani pa je lahko zmanjšanje povprečne velikosti mitohondrijev povezano s povečano biogenezo, kar povzroči nastanek majhnih nastajajočih mitohondrijev. Povečana fisija ali biogeneza predstavlja kompenzacijski odziv za vzdrževanje mitoze proti mitohondrijskemu stresu. Vendar pa ni mogoče izključiti zmanjšane rasti mitohondrijev, motene fuzije ali drugih stanj.
Čeprav slike visoke ločljivosti, ustvarjene s TEM, omogočajo določanje morfoloških značilnosti na ravni posameznih mitohondrijev, ta metoda ustvari dvodimenzionalne posnetke v enem samem trenutku. Za preučevanje dinamičnih odzivov na presnovni stres smo mitohondrije obarvali s TMRE in uporabili časovno zamik mikroskopije z MEL analizo, ki omogoča visokozmogljivo 3D vizualizacijo sprememb v mitohondrijskem omrežju skozi čas33,38. Opazili smo subtilne, a pomembne spremembe v dinamiki mitohondrijev pod stresom PPA (slika 2). Pri 3 mM se je število dogodkov fisije znatno povečalo, medtem ko so dogodki fuzije ostali enaki kot v kontrolni skupini. Pri 5 mM PPA so opazili povečanje števila dogodkov fisije in fuzije, vendar so bile te spremembe približno sorazmerne, kar kaže na to, da kinetika fisije in fuzije doseže ravnovesje pri višjih koncentracijah (slika 2b). Povprečni volumen mitohondrijev je ostal nespremenjen tako pri 3 kot pri 5 mM PPA, kar kaže na to, da je bila ohranjena celovitost mitohondrijskega omrežja (slika 2d). To odraža sposobnost dinamičnih mitohondrijskih omrežij, da se odzovejo na blag presnovni stres in učinkovito vzdržujejo homeostazo, ne da bi pri tem povzročile fragmentacijo omrežja. Pri 3 mM PPA je povečanje fisije zadostno za spodbujanje prehoda v novo ravnovesje, vendar je kot odziv na stres, ki ga povzročajo višje koncentracije PPA, potrebno globlje kinetično preoblikovanje.
Število mitohondrijev se je povečalo pri obeh koncentracijah stresa PPA, vendar se povprečni volumen mitohondrijev ni bistveno spremenil (slika 2c). To je lahko posledica povečane biogeneze ali povečane delitve; vendar je v odsotnosti znatnega zmanjšanja povprečnega volumna mitohondrijev bolj verjetno, da se biosinteza poveča. Vendar pa podatki na sliki 2 podpirajo obstoj dveh kompenzacijskih mehanizmov: povečanje števila dogodkov fisije, kar je skladno s povečano regulacijo mitohondrijske fisije, in povečanje števila dogodkov, kar je skladno z mitohondrijsko biogenezo. Konec koncev lahko dinamična kompenzacija za blagi stres vključuje sočasne procese, ki vključujejo fisijo, fuzijo, biogenezo in mitofagijo. Čeprav so prejšnji avtorji pokazali, da PPA krepi mitozo30,39 in mitofagijo29, mi ponujamo dokaze za preoblikovanje dinamike mitohondrijske fisije in fuzije kot odziv na PPA. Ti podatki potrjujejo morfološke spremembe, opažene s TEM, in zagotavljajo nadaljnji vpogled v mehanizme, povezane z mitohondrijsko disfunkcijo, ki jo povzroča PPA.
Ker niti TEM niti MEL analiza nista zagotovili neposrednih dokazov o mehanizmih regulacije genov, ki so podlaga za opažene morfološke spremembe, smo preučili izražanje RNA genov, vključenih v mitohondrijski metabolizem, biogenezo in dinamiko. Protoonkogen cMYC je transkripcijski faktor, ki sodeluje pri regulaciji mitohondrijev, glikolize, metabolizma aminokislin in maščobnih kislin40. Poleg tega je znano, da cMYC uravnava izražanje skoraj 600 mitohondrijskih genov, ki sodelujejo pri mitohondrijski transkripciji, translaciji in sestavljanju kompleksov, vključno z NRF1 in TFAM41. NRF1 in TFAM sta dva osrednja regulatorja mitoze, ki delujeta nižje v signalu PGC-1α in aktivirata replikacijo mtDNA. To pot aktivira signalizacija cAMP in AMPK ter je občutljiva na porabo energije in presnovni stres. Preučili smo tudi NFE2L2, redoks regulator mitohondrijske biogeneze, da bi ugotovili, ali so učinki PPA morda posredovani z oksidativnim stresom.
Čeprav je izražanje NFE2L2 ostalo nespremenjeno, smo po 24 urah zdravljenja s 3 mM in 5 mM PPA ugotovili dosledno, od odmerka odvisno zmanjšanje izražanja cMYC, NRF1 in TFAM (slika 3a–c). Znižanje izražanja cMYC je bilo že prej opisano kot odziv na mitohondrijski stres42, in obratno, znižanje izražanja cMYC lahko povzroči mitohondrijsko disfunkcijo s preoblikovanjem mitohondrijskega metabolizma, omrežne povezljivosti in membranske polarizacije43. Zanimivo je, da je cMYC vključen tudi v regulacijo mitohondrijske fisije in fuzije42,43 in je znano, da poveča fosforilacijo DRP1 in lokalizacijo mitohondrijev med delitvijo celic44, pa tudi posreduje pri morfološkem preoblikovanju mitohondrijev v nevronskih matičnih celicah45. Dejansko imajo fibroblasti s pomanjkanjem cMYC zmanjšano velikost mitohondrijev, kar je skladno s spremembami, ki jih povzroča stres PPA43. Ti podatki ponazarjajo zanimivo, a še nejasno razmerje med cMYC in mitohondrijsko dinamiko, kar predstavlja zanimivo tarčo za prihodnje študije preoblikovanja, ki ga povzroča stres PPA.
Zmanjšanje NRF1 in TFAM je skladno z vlogo cMYC kot pomembnega transkripcijskega aktivatorja. Ti podatki so skladni tudi s prejšnjimi študijami na celicah človeškega raka debelega črevesa, ki so pokazale, da je PPA zmanjšal izražanje mRNA NRF1 po 22 urah, kar je bilo povezano z izčrpavanjem ATP in povečanjem ROS46. Ti avtorji so tudi poročali, da se je izražanje TFAM povečalo po 8,5 urah, vendar se je po 22 urah vrnilo na izhodiščne ravni. Nasprotno pa so Kim in sod. (2019) pokazali, da se je izražanje mRNA TFAM po 4 urah stresa s PPA v celicah SH-SY5Y znatno zmanjšalo; vendar se je po 72 urah izražanje proteina TFAM znatno povečalo in število kopij mtDNA se je znatno povečalo. Tako zmanjšanje števila genov mitohondrijske biogeneze, ki smo ga opazili po 24 urah, ne izključuje možnosti, da je povečanje števila mitohondrijev povezano z aktivacijo biogeneze v zgodnejših časovnih točkah. Prejšnje študije so pokazale, da PPA znatno poveča raven mRNA in proteina PGC-1α v celicah SH-SY5Y po ​​4 urah in 30 minutah, medtem ko propionska kislina pospeši mitohondrijsko biogenezo v telečjih hepatocitih preko PGC-1α po 12 urah in 39 minutah. Zanimivo je, da PGC-1α ni le neposredni transkripcijski regulator NRF1 in TFAM, temveč je bilo dokazano tudi, da uravnava aktivnost MFN2 in DRP1 z uravnavanjem fisije in fuzije47. Skupaj to poudarja tesno povezanost mehanizmov, ki uravnavajo mitohondrijske kompenzacijske odzive, ki jih povzroča PPA. Poleg tega naši podatki odražajo pomembno disregulacijo transkripcijske regulacije biogeneze in presnove pod stresom PPA.
Geni STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 in DRP1 sodijo med osrednje regulatorje mitohondrijske fisije, fuzije in dinamike37,48,49. V mitohondrijsko dinamiko je vključenih še veliko drugih genov, vendar je bilo že prej ugotovljeno, da so STOML2, OPA1 in MFN2 v kohortah z avtizmom diferencialno metilirani16, več neodvisnih študij pa je poročalo o spremembah teh transkripcijskih faktorjev kot odziv na mitohondrijski stres50,51.52. Izražanje OPA1 in STOML2 se je znatno zmanjšalo z zdravljenjem s 3 mM in 5 mM PPA (slika 3e, f). OPA1 je eden od klasičnih regulatorjev mitohondrijske fuzije preko neposredne interakcije z MFN1 in 2 ter igra vlogo pri preoblikovanju krist in mitohondrijski morfologiji53. Natančna vloga STOML2 v mitohondrijski dinamiki ostaja nejasna, vendar dokazi kažejo, da ima vlogo pri mitohondrijski fuziji, biogenezi in mitofagiji.
STOML2 sodeluje pri vzdrževanju mitohondrijske dihalne sklopitve in nastajanju kompleksov dihalnih verig54,55 ter dokazano močno spreminja presnovne značilnosti rakavih celic56. Študije so pokazale, da STOML2 spodbuja potencial mitohondrijske membrane in biogenezo z interakcijo z BAN in kardiolipinom 55, 57, 58. Poleg tega so neodvisne študije pokazale, da interakcija med STOML2 in PINK1 uravnava mitofagijo59,60. Poročali so, da STOML2 neposredno interagira z MFN2 in ga stabilizira, poleg tega pa igra pomembno vlogo pri stabilizaciji dolgih izooblik OPA1 z zaviranjem proteaze, odgovorne za razgradnjo OPA153,61,62. Zmanjšanje izražanja STOML2, opaženo v reakcijah PPA, lahko te fuzijske proteine ​​naredi bolj dovzetne za razgradnjo prek poti, odvisnih od ubikvitina in proteasomov48. Čeprav natančna vloga STOML2 in OPA1 v dinamičnem odzivu na PPA ni jasna, lahko zmanjšana ekspresija teh fuzijskih genov (slika 3) poruši ravnovesje med fisijo in fuzijo ter povzroči zmanjšanje velikosti mitohondrijev (slika 3). 1).
Po drugi strani pa je izražanje proteina OPA1 po 24 urah ostalo nespremenjeno, medtem ko se ravni mRNA in proteinov MFN1, MFN2 ali DRP1 po obdelavi s PPA niso bistveno spremenile (slika 3g-i, slika 4). To lahko kaže na to, da ni sprememb v regulaciji teh dejavnikov, ki sodelujejo pri mitohondrijski fuziji in fisiji. Vendar je treba omeniti, da vsakega od teh štirih genov uravnavajo tudi posttranskripcijske modifikacije (PTM), ki nadzorujejo aktivnost proteinov. OPA1 ima osem alternativnih variant spajanja, ki se proteolitično cepijo v mitohondrijih in tvorijo dve različni izoobliki 63. Ravnotežje med dolgimi in kratkimi izooblikami na koncu določa vlogo OPA1 pri mitohondrijski fuziji in vzdrževanju mitohondrijske mreže64. Aktivnost DRP1 uravnava fosforilacija kalcij/kalmodulin-odvisne proteinske kinaze II (CaMKII), medtem ko razgradnjo DRP1 uravnavata ubikvitinacija in SUMOilacija65. Končno sta tako DRP1 kot MFN1/2 GTPaze, zato lahko na aktivnost vpliva hitrost proizvodnje GTP v mitohondrijih 66. Čeprav torej izražanje teh beljakovin ostaja konstantno, to morda ne odraža nespremenjene aktivnosti ali lokalizacije beljakovin 67,68. Dejansko obstoječi repertoarji beljakovin PTM pogosto služijo kot prva obrambna linija, odgovorna za posredovanje akutnih stresnih odzivov. V prisotnosti zmernega presnovnega stresa v našem modelu je verjetno, da PTM spodbuja povečano aktivnost fuzijskih in fisijskih beljakovin, da zadostno obnovi integriteto mitohondrijev, ne da bi bila potrebna dodatna aktivacija teh genov na ravni mRNA ali beljakovin.
Zgornji podatki skupaj poudarjajo kompleksno in časovno odvisno regulacijo mitohondrijske morfologije ter izzive pri razjasnjevanju teh mehanizmov. Za preučevanje izražanja genov je najprej treba identificirati specifične ciljne gene v poti. Vendar pa naši podatki kažejo, da se geni v isti poti ne odzivajo na enak način na isti stres. Pravzaprav so prejšnje študije pokazale, da lahko različni geni v isti poti kažejo različne časovne profile odziva30,46. Poleg tega obstajajo kompleksni posttranskripcijski mehanizmi, ki motijo ​​razmerje med transkripcijo in delovanjem genov. Proteomske študije lahko ponudijo vpogled v vpliv PTM-jev in delovanje beljakovin, vendar predstavljajo tudi izzive, vključno z metodami z nizko prepustnostjo, visokim razmerjem signal/šum in slabo ločljivostjo.
V tem kontekstu ima preučevanje mitohondrijske morfologije z uporabo TEM in MEL velik potencial za obravnavo temeljnih vprašanj o odnosu med mitohondrijsko dinamiko in funkcijo ter o tem, kako to vpliva na bolezen. Najpomembneje je, da TEM zagotavlja neposredno metodo za merjenje mitohondrijske morfologije kot konvergentne končne točke mitohondrijske disfunkcije in dinamike51. MEL zagotavlja tudi neposredno metodo za vizualizacijo dogodkov fisije in fuzije v tridimenzionalnem celičnem okolju, kar omogoča kvantifikacijo dinamičnega mitohondrijskega preoblikovanja tudi brez sprememb v izražanju genov33. Tukaj poudarjamo uporabnost tehnik mitohondrijskega slikanja pri sekundarnih mitohondrijskih boleznih. Za te bolezni je običajno značilen kronični blagi presnovni stres, za katerega je značilno subtilno preoblikovanje mitohondrijskih mrež, ne pa akutna mitohondrijska poškodba. Vendar pa ima mitohondrijska kompenzacija, potrebna za vzdrževanje mitotoze pri kroničnem stresu, globoke funkcionalne posledice. V kontekstu nevroznanosti lahko boljše razumevanje teh kompenzacijskih mehanizmov zagotovi pomembne informacije o pleiotropni nevropatologiji, povezani z mitohondrijsko disfunkcijo.
Naši podatki navsezadnje poudarjajo uporabnost slikovnih tehnik za razumevanje funkcionalnih posledic kompleksnih interakcij med izražanjem genov, modifikacijami beljakovin in aktivnostjo beljakovin, ki nadzorujejo dinamiko mitohondrijev nevronov. Za modeliranje mitohondrijske disfunkcije v modelu nevronskih celic smo uporabili PPA, da bi dobili vpogled v mitohondrijsko komponento ASD. Celice SH-SY5Y, zdravljene s PPA, so pokazale spremembe v morfologiji mitohondrijev: mitohondriji so postali majhni in okrogli, kriste pa so bile pri opazovanju s TEM slabo definirane. Analiza MEL kaže, da se te spremembe pojavljajo sočasno s povečanjem števila dogodkov fisije in fuzije, da se ohrani mitohondrijska mreža kot odziv na blag presnovni stres. Poleg tega PPA pomembno moti transkripcijsko regulacijo mitohondrijskega metabolizma in homeostaze. Ugotovili smo, da so cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 in OPA1 ključni mitohondrijski regulatorji, ki jih moti stres zaradi PPA, in da lahko igrajo vlogo pri posredovanju sprememb v morfologiji in delovanju mitohondrijev, ki jih povzroča PPA. Potrebne so nadaljnje študije za boljšo opredelitev časovnih sprememb v izražanju genov in aktivnosti beljakovin, lokalizaciji in posttranslacijskih modifikacijah, ki jih povzroča PPA. Naši podatki poudarjajo kompleksnost in soodvisnost regulativnih mehanizmov, ki posredujejo pri odzivu mitohondrijskega stresa, in dokazujejo uporabnost TEM in drugih slikovnih tehnik za bolj ciljno usmerjene mehanistične študije.
Celično linijo SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) smo kupili pri podjetju Sigma-Aldrich. Celice SH-SY5Y smo gojili v Dulbeccovem modificiranem Eagleovem mediju/hranilni mešanici F-12 (DMEM/F-12) in L-glutaminu (SC09411, ScienCell) v 25 cm2 bučkah, dopolnjenih z 20 % fetalnim govejim serumom (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) in 1 % penicilin-streptomicinom (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) pri 37 °C in 5 % CO2. Celice smo subkultivirali do 80 % konfluence z uporabo 0,05 % tripsina-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), centrifugirali pri 300 g in nasadili na plošče z gostoto približno 7 × 105 celic/ml. Vsi poskusi so bili izvedeni na nediferenciranih celicah SH-SY5Y med pasažami 19–22. PPA se daje kot NaP. Prah NaP (CAS št. 137-40-6, kemijska formula C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) raztopimo v topli vodi MilliQ do koncentracije 1 M in shranimo pri 4 °C. Na dan tretiranja to raztopino razredčimo z 1 M PPA do 3 mM in 5 mM PPA v mediju brez seruma (DMEM/F-12 z L-glutaminom). Koncentracije tretiranja za vse poskuse so bile brez PPA (0 mM, kontrola), 3 mM in 5 mM PPA. Poskusi so bili izvedeni v vsaj treh bioloških ponovitvah.
Celice SH-SY5Y so bile zasejane v 25 cm5 bučke s hitrostjo 5,5 × 105 celic/ml in gojene 24 ur. Obdelava PPA je bila v bučko dodana pred 24 urami inkubacije. Celične pelete zberite po običajnih protokolih za subkulturo tkiva sesalcev (opisanih zgoraj). Celične pelete resuspendirajte v 100 µl 2,5 % glutaraldehida, 1× PBS in shranite pri 4 °C do obdelave. Celice SH-SY5Y so bile na kratko centrifugirane, da so se celice pelete in odstranile 2,5 % raztopine glutaraldehida, 1× PBS. Usedlino resuspendirajte v 4 % agaroznem gelu, pripravljenem v destilirani vodi (razmerje med prostornino agaroze in usedline je 1:1). Koščke agaroze so položili na mreže na ravnih ploščah in jih pred zamrzovanjem pod visokim tlakom prekrili z 1-heksadecenom. Vzorce smo zamrznili v 100 % suhem acetonu pri -90 °C 24 ur. Temperaturo smo nato zvišali na -80 °C in dodali raztopino 1 % osmijevega tetroksida in 0,1 % glutaraldehida. Vzorce smo shranili pri -80 °C 24 ur. Nato smo temperaturo v nekaj dneh postopoma zvišali na sobno temperaturo: od –80 °C do –50 °C za 24 ur, do –30 °C za 24 ur, do –10 °C za 24 ur in končno na sobno temperaturo.
Po kriogeni pripravi so bili vzorci impregnirani s smolo in ultratanki rezi (∼100 nm) so bili narejeni z ultramikrotomom Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Rezine so bile obarvane z 2 % uranil acetatom in svinčevim citratom. Vzorce so opazovali s transmisijskim elektronskim mikroskopom FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (prej FEI), Eindhoven, Nizozemska) z napetostjo 200 kV (oddajnik Lab6) in kamero Gatan CCD (Gatan, Združeno kraljestvo), opremljeno z energijskim filtrom Tridiem.
V vsaki tehnični ponovitvi je bilo pridobljenih vsaj 24 slik posameznih celic, skupno 266 slik. Vse slike so bile analizirane z uporabo makra Region of Interest (ROI) in makra Mitochondria. Mitohondrijski makro temelji na objavljenih metodah17,31,32 in omogoča polavtomatsko paketno obdelavo TEM slik v Fiji/ImageJ69. Na kratko: slika je invertirana in obrnjena z uporabo odštevanja ozadja kotalne kroglice (polmer 60 slikovnih pik) in pasovnega filtra FFT (z uporabo zgornje in spodnje meje 60 oziroma 8 slikovnih pik) ter zaviranja navpičnih črt s toleranco orientacije 5 %. Obdelana slika je samodejno pragovno omejena z algoritmom maksimalne entropije in generirana je binarna maska. Izvlečena so bila območja slike, povezana z ročno izbranimi ROI v surovih TEM slikah, pri čemer so bili karakterizirani mitohondriji in izključeni plazemska membrana in druga območja z visokim kontrastom. Za vsak izvlečen ROI so bili analizirani binarni delci, večji od 600 slikovnih pik, površina delcev, obseg, glavne in stranske osi, Feretov premer, okroglost in krožnost pa so bili izmerjeni z uporabo vgrajenih merilnih funkcij Fiji/ImageJ. Po Merrillu, Flippu in Stracku (2017) so bili iz teh podatkov izračunani površina 2, razmerje stranic delcev (razmerje med glavno in stransko osjo) in faktor oblike (FF), kjer je FF = obseg 2/4pi x površina. Definicijo parametrične formule najdete v Merrillu, Flippu in Stracku (2017). Omenjeni makri so na voljo na GitHubu (glejte izjavo o dostopnosti podatkov). V povprečju je bilo na obdelavo s PPA analiziranih približno 5600 delcev, kar je skupaj približno 17.000 delcev (podatki niso prikazani).
Celice SH-SH5Y so bile nameščene v 8-komorne gojitvene posode (ThermoFisher, #155411) za oprijem čez noč in nato inkubirane s TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) in Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Slike so bile pridobljene z laserji z valovno dolžino 405 nm in 561 nm v 10-minutnem okolju, surove slike pa so bile pridobljene kot z-skladi, ki vsebujejo 10 slikovnih mikrografij z a-korakom 0,2 μm med slikovnimi okvirji v 12 zaporednih časovnih točkah. Slike so bile zbrane z uporabo platforme Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 z visoko ločljivostjo (Carl Zeiss, Oberkochen, Nemčija) z uporabo leče LCI Plan Apochromate 100x/1,4 Oil DIC M27. Slike so bile analizirane v programu ImageJ z uporabo prej opisanega cevovoda in vtičnika ImageJ za merjenje dogodkov fuzije in fisije, povprečnega števila mitohondrijskih struktur in povprečnega volumna mitohondrijev na celico33. Makri MEL so na voljo na GitHubu (glejte izjavo o razpoložljivosti podatkov).
Celice SH-SY5Y so bile 24 ur pred obdelavo gojene na šestjamičnih ploščah pri gostoti 0,3 × 106 celic/ml. RNA je bila ekstrahirana z uporabo protokola Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) z rahlimi spremembami: pred odstranitvijo je bilo v vsako vdolbinico dodanih 300 μl pufra za lizo RNA in vsak vzorec je bil kot zadnji korak liziran s 30 μl vode brez DNaze/RNaze za elucijo. Količina in kakovost vseh vzorcev je bila preverjena z uporabo UV-Vis spektrofotometra NanoDrop ND-1000. Skupne beljakovine iz celičnih lizatov so bile pridobljene z uporabo 200 μl pufra za lizo RIPA, koncentracija beljakovin pa je bila kvantificirana z Bradfordovim testom za beljakovine70.
Sinteza cDNA je bila izvedena z uporabo kompleta Tetro™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) v skladu z navodili proizvajalca z nekaj spremembami. cDNA je bila sintetizirana v 20-μl reakcijah z uporabo 0,7 do 1 μg celotne RNA. Primerji so bili izbrani iz predhodno objavljenih člankov 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (tabela S1), priložene sonde pa so bile zasnovane z orodjem PrimerQuest podjetja Integrated DNA Technologies. Vsi geni, ki nas zanimajo, so bili normalizirani na jedrni gen B2M. Genska ekspresija STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC in OPA1 je bila izmerjena z RT-qPCR. Glavna mešanica je vključevala polimerazo LUNA Taq (M3003L, New England Biolabs), 10 μM primerjev naprej in nazaj, cDNA in vodo PCR-kvalitete, da je bil končni volumen 10 μL za vsako reakcijo. Ekspresijo genov za delitev in fisijo (DRP1, MFN1/2) smo izmerili z multipleks testi TaqMan. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) smo uporabili v skladu z navodili proizvajalca z manjšimi spremembami. Multipleks RT-qPCR master mix vključuje 1X LUNA Taq polimerazo, 10 μM primerje za naprej in nazaj, 10 μM sondo, cDNA in vodo PCR-kvalitete, kar je dalo končni volumen 20 μL za vsako reakcijo. RT-qPCR smo izvedli z uporabo Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG – serijska številka: R0618110). Pogoji cikliranja so prikazani v tabeli S1. Vsi vzorci cDNA smo pomnožili v treh ponovitvah in standardno krivuljo smo ustvarili z uporabo serije desetkratnih razredčitev. Izstopajoče vrednosti v treh vzorcih s standardnim odklonom praga cikla (Ct) > 0,5 smo iz analize odstranili, da bi zagotovili ponovljivost podatkov30,72. Relativno izražanje genov smo izračunali z metodo 2-ΔΔCt79.
Vzorce beljakovin (60 μg) smo zmešali z Laemmlijevim nalagalnim pufrom v razmerju 2:1 in analizirali na 12 % brezbarvnem beljakovinskem gelu (Bio-Rad #1610184). Beljakovine smo s sistemom Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad) prenesli na PVDF (poliviniliden fluorid) membrano (#170-84156, Bio-Rad). Membrana je bila blokirana in inkubirana z ustreznimi primarnimi protitelesi (OPA1, MFN1, MFN2 in DRP1) (razredčena 1:1000) 48 ur, nato pa še 1 uro inkubacije s sekundarnimi protitelesi (1:10.000). Membrane smo nato slikali z uporabo Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) in posneli s sistemom Bio-Rad ChemiDoc MP. Za Western blot analizo smo uporabili programsko opremo ImageLab različice 6.1. Izvirni gel in blot sta prikazana na sliki S1. Informacije o protitelesih so navedene v tabeli S2.
Podatkovni nizi so predstavljeni kot povprečje in standardna napaka povprečja (SEM) vsaj treh neodvisnih vzorcev. Pred predpostavko Gaussove porazdelitve in enakih standardnih odklonov ter nadaljevanjem analiz smo podatkovne nize preizkusili glede normalnosti s Shapiro-Wilksovim testom (če ni navedeno drugače). Poleg analize podatkov smo za določitev pomembnosti (p < 0,05) uporabili še Fisherjev MEL LSD (p < 0,05), enosmerno ANOVA (povprečje zdravljenja v primerjavi s kontrolno skupino) in Dunnettov test večkratne primerjave. Pomembne vrednosti p so v grafu prikazane kot *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Vse statistične analize in grafi so bili izvedeni in ustvarjeni z uporabo programa GraphPad Prism 9.4.0.
Makri Fiji/ImageJ za analizo slik TEM so javno dostopni na GitHubu: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Makro Mitochondrial Event Locator (MEL) je javno dostopen na GitHubu: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM in Vijaya A. Mitohondriji: glavni regulatorji metabolizma, homeostaze, stresa, staranja in epigenetike. Indonezijščina. Biomedical Science. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Večplastna mitohondrijska disfunkcija pri shizofreniji, kompleks I kot možna patološka tarča. Schizophrenia. vir. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. in Beal, MF Mitohondrijska disfunkcija pri Parkinsonovi bolezni. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG in Mehta V. Stresni mitohondriji: tarče invazije pri Alzheimerjevi bolezni. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF in Ferreira GK Mitohondriji in možgani: bioenergetika in drugo. Nevrotoksini. vir. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Pleiotropni mitohondriji: vpliv mitohondrijev na razvoj nevronov in bolezni. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. in Morais, VA Mitohondrijska biogeneza v nevronih: kako in kje. Mednarodnost. J. Mohr. Znanost. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. in Zhao, J. Regulacija mitohondrijske dinamike pri sesalcih: priložnosti in izzivi. front. endokrini. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. in Slack, RS Mitohondrijska dinamika v regulaciji nevrogeneze: od razvijajočih se do odraslih možganov. development. dynamic. 247, 47–53 (2018).