Hvala, ker ste obiskali Nature.com. Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS. Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali izklopite način združljivosti v Internet Explorerju). Medtem bomo za zagotovitev nadaljnje podpore spletno mesto prikazali brez slogov in JavaScripta.
Nanodelci insulina (NP) z visoko vsebnostjo polnila so našli različne aplikacije v različnih farmacevtskih oblikah. Namen tega dela je oceniti učinek postopkov liofilizacije in razpršilnega sušenja na strukturo nanodelcev hitosana, napolnjenih z insulinom, z manitolom kot krioprotektantom ali brez njega. Kakovost teh nanodelcev smo ocenili tudi z njihovim ponovnim raztapljanjem. Pred dehidracijo je bila velikost delcev zamreženih nanodelcev hitosana/natrijevega tripolifosfata/inzulina optimizirana na 318 nm, PDI je bil 0,18, učinkovitost enkapsulacije je bila 99,4 %, polnilo pa 25,01 %. Po rekonstituciji so vsi nanodelci, razen tistih, ki so bili proizvedeni z liofilizacijo brez uporabe manitola, ohranili svojo sferično strukturo delcev. V primerjavi z nanodelci, ki vsebujejo manitol in so bili dehidrirani z razprševanjem, so nanodelci, posušeni z razprševanjem brez manitola, prav tako pokazali najmanjšo povprečno velikost delcev (376 nm) in najvišjo vsebnost polnila (25,02 %) s podobno stopnjo enkapsulacije (98,7 %) in PDI. (0,20) s sušenjem ali liofilizacijo. Posušeni nanodelci z razpršilnim sušenjem brez manitola so prav tako povzročili najhitrejše sproščanje insulina in najvišjo učinkovitost celičnega privzema. To delo kaže, da lahko razpršilno sušenje dehidrira nanodelce insulina brez potrebe po krioprotektantih v primerjavi s konvencionalnimi metodami liofilizacije, kar ustvarja večjo nosilnost, nižje potrebe po dodatkih in znatno prednost pri obratovalnih stroških.
Od svojega odkritja leta 19221,2,3 so inzulin in njegovi farmacevtski pripravki rešili življenja bolnikov s sladkorno boleznijo tipa 1 (T1DM) in sladkorno boleznijo tipa 2 (T1DM). Vendar pa se inzulin zaradi svojih lastnosti kot beljakovina z visoko molekulsko maso zlahka agregira, razgradi s proteolitičnimi encimi in izloči s prvim prehodom. Ljudje, pri katerih je bila diagnosticirana sladkorna bolezen tipa 1, potrebujejo injekcije inzulina do konca življenja. Mnogi bolniki, pri katerih je bila prvotno diagnosticirana sladkorna bolezen tipa 2, potrebujejo tudi dolgotrajne injekcije inzulina. Dnevne injekcije inzulina so za te posameznike resen vir vsakodnevnih bolečin in nelagodja, kar negativno vpliva na duševno zdravje. Posledično se obsežno preučujejo druge oblike dajanja inzulina, ki povzročajo manj nelagodja, kot je peroralno dajanje inzulina5, saj lahko obnovijo kakovost življenja približno 5 milijard ljudi s sladkorno boleznijo po vsem svetu.
Tehnologija nanodelcev je omogočila pomemben napredek pri poskusih peroralnega jemanja insulina4,6,7. Takšnega, ki učinkovito enkapsulira in ščiti insulin pred razgradnjo za ciljno dostavo na določena mesta v telesu. Vendar pa ima uporaba formulacij z nanodelci več omejitev, predvsem zaradi težav s stabilnostjo suspenzij delcev. Med shranjevanjem lahko pride do nekaj agregacije, kar zmanjša biološko uporabnost nanodelcev, napolnjenih z insulinom8. Poleg tega je treba upoštevati tudi kemijsko stabilnost polimerne matrice nanodelcev in insulina, da se zagotovi stabilnost nanodelcev insulina (NP). Trenutno je tehnologija liofilizacije zlati standard za ustvarjanje stabilnih NP, hkrati pa preprečuje neželene spremembe med shranjevanjem9.
Vendar pa liofilizacija zahteva dodatek krioprotektantov, da se prepreči vpliv mehanske obremenitve ledenih kristalov na sferično strukturo nanodelcev. To znatno zmanjša obremenitev insulinskih nanodelcev po liofilizaciji, saj krioprotektant zavzema večino masnega razmerja. Zato se pogosto izkaže, da proizvedeni insulinski nanodelci niso primerni za izdelavo suhih praškastih formulacij, kot so peroralne tablete in peroralni filmi, ker so za doseganje terapevtskega okna insulina potrebne velike količine suhih nanodelcev.
Sušenje z razprševanjem je dobro znan in poceni postopek industrijskega obsega za proizvodnjo suhih praškov iz tekočih faz v farmacevtski industriji10,11. Nadzor nad procesom nastajanja delcev omogoča pravilno enkapsulacijo več bioaktivnih spojin12, 13. Poleg tega je postalo učinkovita tehnika za pripravo enkapsuliranih beljakovin za oralno uporabo. Med sušenjem z razprševanjem voda zelo hitro izhlapi, kar pomaga ohranjati nizko temperaturo jedra delca11,14, kar omogoča njegovo uporabo za enkapsulacijo toplotno občutljivih komponent. Pred sušenjem z razprševanjem je treba premazni material temeljito homogenizirati z raztopino, ki vsebuje enkapsulirane sestavine11,14. Za razliko od liofilizacije homogenizacija pred enkapsulacijo pri sušenju z razprševanjem izboljša učinkovitost enkapsulacije med dehidracijo. Ker postopek enkapsulacije s sušenjem z razprševanjem ne zahteva krioprotektantov, se lahko sušenje z razprševanjem uporabi za proizvodnjo posušenih NP z visoko vsebnostjo polnila.
Ta študija poroča o proizvodnji nanodelcev, napolnjenih z inzulinom, z zamreženjem hitosana in natrijevega tripolifosfata z uporabo ionske gelske metode. Ionska gelacija je metoda priprave, ki omogoča proizvodnjo nanodelcev z elektrostatičnimi interakcijami med dvema ali več ionskimi vrstami pod določenimi pogoji. Za dehidracijo optimiziranih nanodelcev, zamreženih s hitosanom/natrijevim tripolifosfatom/insulinom, sta bili uporabljeni tehniki liofilizacije in razpršilnega sušenja. Po dehidraciji je bila njihova morfologija analizirana s SEM. Njihova sposobnost rekombinacije je bila ocenjena z merjenjem njihove porazdelitve velikosti, površinskega naboja, PDI, učinkovitosti enkapsulacije in vsebnosti nalaganja. Kakovost ponovno raztopljenih nanodelcev, proizvedenih z različnimi metodami dehidracije, je bila ocenjena tudi s primerjavo njihove zaščite pred inzulinom, obnašanja sproščanja in učinkovitosti celičnega privzema.
pH mešane raztopine in razmerje med hitozanom in inzulinom sta dva ključna dejavnika, ki vplivata na velikost delcev in učinkovitost enkapsulacije (EE) končnih NP, saj neposredno vplivata na ionotropni proces želiranja. Izkazalo se je, da je pH mešane raztopine močno povezan z velikostjo delcev in učinkovitostjo enkapsulacije (slika 1a). Kot je prikazano na sliki 1a, se je s povečanjem pH s 4,0 na 6,0 povprečna velikost delcev (nm) zmanjšala, EE pa znatno povečala, medtem ko se je s povečanjem pH na 6,5 ​​povprečna velikost delcev začela povečevati, EE pa je ostala nespremenjena. Z naraščanjem razmerja med hitozanom in inzulinom se poveča tudi povprečna velikost delcev. Poleg tega ni bilo opaziti nobene spremembe EE, ko so bili nanodelci pripravljeni z masnim razmerjem hitozana/insulina, višjim od 2,5:1 (m/m) (slika 1b). Zato so bili za pripravo v tej študiji uporabljeni optimalni pogoji priprave (pH 6,0, masno razmerje hitozana/insulina 2,5:1). nanodelci, napolnjeni z inzulinom, za nadaljnje študije. Pri teh pogojih priprave je bila povprečna velikost delcev nanodelcev inzulina optimizirana na 318 nm (slika 1c), PDI je bil 0,18, učinkovitost vgradnje je bila 99,4 %, zeta potencial je bil 9,8 mv, obremenitev z inzulinom pa 25,01 % (m/m). Na podlagi rezultatov transmisijske elektronske mikroskopije (TEM) so bili optimizirani nanodelci približno sferični in diskretni z relativno enakomerno velikostjo (slika 1d).
Optimizacija parametrov nanodelcev inzulina: (a) vpliv pH na povprečni premer in učinkovitost enkapsulacije (EE) nanodelcev inzulina (pripravljenih pri masnem razmerju 5:1 med hitozanom in inzulinom); (b) hitozan in vpliv masnega razmerja inzulina na povprečni premer in učinkovitost enkapsulacije (EE) nanodelcev inzulina (pripravljenih pri pH 6); (c) porazdelitev velikosti delcev optimiziranih nanodelcev inzulina; (d) TEM mikrografija optimiziranih nanodelcev inzulina.
Dobro je znano, da je hitosan šibek polielektrolit s pKa 6,5. V kislem mediju je pozitivno nabit, ker je njegova glavna amino skupina protonirana z vodikovimi ioni15. Zato se pogosto uporablja kot nosilec za enkapsulacijo negativno nabitih makromolekul. V tej študiji je bil hitosan uporabljen za enkapsulacijo insulina z izoelektrično točko 5,3. Ker se hitosan uporablja kot premazni material, se z naraščanjem njegovega deleža ustrezno poveča debelina zunanje plasti nanodelcev, kar ima za posledico večjo povprečno velikost delcev. Poleg tega lahko višje ravni hitosana enkapsulirajo več insulina. V našem primeru je bila EE najvišja, ko je razmerje med hitosanom in insulinom doseglo 2,5:1, in ni bilo bistvene spremembe EE, ko se je razmerje še naprej povečevalo.
Poleg razmerja med hitozanom in inzulinom je pri pripravi NP-jev ključno vlogo igral tudi pH. Gan in sod.17 so preučevali vpliv pH na velikost delcev hitozanskih nanodelcev. Ugotovili so, da se velikost delcev nenehno zmanjšuje, dokler pH ni dosegel 6,0, pri pH > 6,0 pa so opazili znatno povečanje velikosti delcev, kar je skladno z našimi opažanji. Ta pojav je posledica dejstva, da z naraščajočim pH molekula inzulina pridobi negativni površinski naboj, kar spodbuja elektrostatične interakcije s kompleksom hitosan/natrijev tripolifosfat (TPP), kar ima za posledico majhno velikost delcev in visoko EE. Ko pa je bil pH prilagojen na 6,5, so bile amino skupine na hitozanu deprotonirane, kar je povzročilo zvijanje hitozana. Tako visok pH povzroči manjšo izpostavljenost amino ionov TPP in inzulinu, kar ima za posledico manjše zamreženje, večjo končno povprečno velikost delcev in nižjo EE.
Analiza morfoloških lastnosti liofiliziranih in razpršilno sušenih nanodelcev lahko vodi pri izbiri boljših tehnik dehidracije in tvorbe prahu. Prednostna metoda mora zagotavljati stabilnost zdravila, enakomerno obliko delcev, visoko vsebnost zdravila in dobro topnost v prvotni raztopini. V tej študiji so bili za boljšo primerjavo obeh tehnik med dehidracijo uporabljeni inzulinski nanodelci z ali brez 1 % manitola. Manitol se uporablja kot sredstvo za povečanje prostornine ali krioprotektant v različnih formulacijah suhega prahu za liofilizacijo in razpršilno sušenje. Pri liofiliziranih inzulinskih nanodelcih brez manitola, kot je prikazano na sliki 2a, je bila pod vrstično elektronsko mikroskopijo (SEM) opažena zelo porozna struktura prahu z velikimi, nepravilnimi in hrapavimi površinami. Po dehidraciji je bilo v prahu zaznanih le malo diskretnih delcev (slika 2e). Ti rezultati so pokazali, da se je večina NP med liofilizacijo brez kakršnega koli krioprotektanta razgradila. Pri liofiliziranih in razpršilno sušenih inzulinskih nanodelcih, ki vsebujejo 1 % manitola, so bili opaženi sferični nanodelci z gladkimi površinami (slika 2b, d, f, h). Inzulinski nanodelci, posušeni z razprševanjem brez manitola, so ostali sferični, vendar... nagubana na površini (slika 2c). Sferične in nagubane površine so podrobneje obravnavane v spodnjih testih sproščanja in celične absorpcije. Glede na vidni videz posušenih NP so tako z razprševanjem sušene NP brez manitola kot z liofilizirane in z razprševanjem sušene NP z manitolom dale fine prahove NP (slika 2f, g, h). Večja kot je površina med površinama delcev, večja je topnost in s tem višja je hitrost sproščanja.
Morfologija različnih dehidriranih nanodelcev insulina: (a) SEM slika liofiliziranih nanodelcev insulina brez manitola; (b) SEM slika liofiliziranih nanodelcev insulina z manitolom; (c) z razprševanjem posušene nanodelice insulina brez manitola; SEM slika ; (d) SEM slika nanodelcev insulina, posušenih z razprševanjem z manitolom; (e) slika liofiliziranega prahu nanodelcev insulina brez manitola; (f) slika liofiliziranih nanodelcev insulina z manitolom; (g) slika z razprševanjem posušenega prahu nanodelcev insulina brez manitola; (h) slika z razprševanjem posušenega prahu nanodelcev insulina z manitolom.
Med liofilizacijo manitol deluje kot krioprotektant, ki ohranja NP v amorfni obliki in preprečuje poškodbe zaradi ledenih kristalov19. Nasprotno pa med sušenjem z razprševanjem ni koraka zamrzovanja. Zato manitol pri tej metodi ni potreben. Pravzaprav so z razprševanjem sušene NP brez manitola dale finejše NP, kot je bilo opisano že prej. Vendar pa lahko manitol še vedno deluje kot polnilo v procesu sušenja z razprševanjem, da NP dobijo bolj sferično strukturo20 (slika 2d), kar pomaga doseči enakomerno sproščanje takšnih enkapsuliranih NP. Poleg tega je jasno, da je mogoče v liofiliziranih in z razprševanjem sušenih NP insulina, ki vsebujejo manitol (slika 2b,d), zaznati nekatere velike delce, kar je lahko posledica kopičenja manitola v jedru delca skupaj z enkapsuliranim insulinom. To.Hitosanska plast. Omeniti velja, da je v tej študiji za zagotovitev, da sferična struktura po dehidraciji ostane nedotaknjena, razmerje med manitolom in hitozanom ohranjeno na 5:1, tako da lahko velika količina polnila poveča tudi velikost delcev posušenih NP.
Spektroskopija Fourierjeve transformacije infrardeče oslabljene popolne refleksije (FTIR-ATR) je okarakterizirala fizikalno mešanico prostega insulina, hitosana, hitosana, TPP in insulina. Vse dehidrirane nanodelce smo okarakterizirali z uporabo FTIR-ATR spektroskopije. Omeniti velja, da so bile intenzivnosti pasov 1641, 1543 in 1412 cm-1 opažene v enkapsuliranih nanodelcih, liofiliziranih z manitolom, in v nanodelcih, sušenih z razprševanjem z manitolom in brez njega (slika 3). Kot smo že poročali, so bila ta povečanja jakosti povezana z zamreženjem med hitosanom, TPP in insulinom. Raziskava interakcije med hitosanom in insulinom je pokazala, da se v FTIR spektrih nanodelcev hitosana, napolnjenih z insulinom, pas hitosana prekriva s pasom insulina, kar povečuje intenzivnost karbonilnega (1641 cm-1) in aminskega (1543 cm-1) pasu. Tripolifosfatne skupine TPP so v hitosanu povezane z amonijevimi skupinami in tvorijo pas pri 1412 cm-1.
FTIR-ATR spektri prostega insulina, hitosana, fizikalnih zmesi hitosana/TPP/insulina in NP, dehidriranih z različnimi metodami.
Poleg tega so ti rezultati skladni z rezultati SEM, ki je pokazal, da so enkapsulirane NP ostale nedotaknjene tako pri pršenju kot pri liofilizaciji z manitolom, vendar je v odsotnosti manitola le sušenje z razprševanjem ustvarilo enkapsulirane delce. Nasprotno pa so bili spektralni rezultati FTIR-ATR liofiliziranih NP brez manitola zelo podobni fizikalni mešanici hitosana, TPP in insulina. Ta rezultat kaže, da navzkrižne povezave med hitosanom, TPP in insulinom niso več prisotne v liofiliziranih NP brez manitola. Struktura NP je bila med liofilizacijo brez krioprotektanta uničena, kar je razvidno iz rezultatov SEM (slika 2a). Na podlagi morfologije in rezultatov FTIR dehidriranih insulinskih NP so bile za poskuse rekonstitucije uporabljene le liofilizirane, z razprševanjem posušene in NP brez manitola, zaradi razgradnje NP brez manitola med dehidracijo pa NP brez manitola. Razpravljajte.
Dehidracija se uporablja za dolgotrajno shranjevanje in predelavo v druge formulacije. Sposobnost suhih NP, da se po shranjevanju rekonstituirajo, je ključnega pomena za njihovo uporabo v različnih formulacijah, kot so tablete in filmi. Opazili smo, da se je povprečna velikost delcev z razprševanjem posušenih nanodelcev insulina brez manitola po rekonstituciji le nekoliko povečala. Po drugi strani pa se je velikost delcev z razprševanjem posušenih in liofiliziranih nanodelcev insulina z manitolom znatno povečala (tabela 1). PDI in EE se po rekombinaciji vseh NP v tej študiji nista bistveno spremenila (p > 0,05) (tabela 1). Ta rezultat kaže, da je večina delcev po ponovnem raztapljanju ostala nedotaknjena. Vendar pa je dodatek manitola močno zmanjšal obremenitev z insulinom v liofiliziranih in z razprševanjem posušenih nanodelcih manitola (tabela 1). Nasprotno pa je vsebnost insulina v NP, posušenih z razprševanjem brez manitola, ostala enaka kot prej (tabela 1).
Dobro je znano, da je količina nanodelcev ključnega pomena pri uporabi za namene dajanja zdravil. Za nanodelce z nizko količino so za doseganje terapevtskega praga potrebne zelo velike količine materiala. Vendar pa visoka viskoznost tako visokih koncentracij nanodelcev povzroča nevšečnosti in težave pri peroralni uporabi oziroma injekcijskih formulacijah 22. Poleg tega se lahko nanodelci insulina uporabljajo tudi za izdelavo tablet in viskoznih biofilmov 23, 24, kar zahteva uporabo velikih količin nanodelcev pri nizkih ravneh obremenitve, kar ima za posledico velike tablete in debele biofilme, ki niso primerni za peroralno uporabo. Zato so dehidrirani nanodelci z visoko količino insulina zelo zaželeni. Naši rezultati kažejo, da lahko visoka količina insulina v nanodelcih, posušenih z razprševanjem brez manitola, ponuja številne privlačne prednosti za te alternativne metode dajanja.
Vse dehidrirane NP so bile tri mesece shranjene v hladilniku. Rezultati SEM so pokazali, da se morfologija vseh dehidriranih NP med trimesečnim shranjevanjem ni bistveno spremenila (slika 4). Po rekonstituciji v vodi so vse NP pokazale rahlo zmanjšanje EE in sprostile približno majhno količino (~5 %) insulina med trimesečnim obdobjem shranjevanja (tabela 2). Vendar se je povprečna velikost delcev vseh nanodelcev povečala. Velikost delcev NP, sušenih z razprševanjem brez manitola, se je povečala na 525 nm, medtem ko se je velikost delcev NP, sušenih z razprševanjem in liofiliziranih z manitolom, povečala na 872 oziroma 921 nm (tabela 2).
Morfologija različnih dehidriranih nanodelcev insulina, shranjenih tri mesece: (a) SEM slika liofiliziranih nanodelcev insulina z manitolom; (b) SEM slika z razprševanjem posušenih nanodelcev insulina brez manitola; (c) brez manitola. SEM slike z razprševanjem posušenih nanodelcev insulina.
Poleg tega so bile v rekonstituiranih nanodelcih insulina, posušenih z razprševanjem z manitolom in liofiliziranih (slika S2), opažene oborine. To je lahko posledica tega, da se veliki delci v vodi ne suspendirajo pravilno. Vsi zgornji rezultati kažejo, da lahko tehnika sušenja z razprševanjem zaščiti nanodelce insulina pred dehidracijo in da je mogoče doseči visoke količine nanodelcev insulina brez kakršnih koli polnil ali krioprotektantov.
Zadrževanje insulina je bilo testirano v mediju s pH = 2,5 s pepsinom, tripsinom in α-himotripsinom, da bi dokazali zaščitno sposobnost NP pred encimsko prebavo po dehidraciji. Zadrževanje insulina dehidriranih NP je bilo primerjano z zadrževanjem insulina sveže pripravljenih NP, prosti insulin pa je bil uporabljen kot negativna kontrola. V tej študiji je prosti insulin pokazal hitro izločanje insulina v 4 urah pri vseh treh encimskih obdelavah (slika 5a–c). Nasprotno pa je testiranje izločanja insulina liofiliziranih NP z manitolom in sušenih NP z ali brez manitola pokazalo bistveno večjo zaščito teh NP pred encimsko prebavo, kar je bilo podobno kot pri sveže pripravljenih NP insulina (slika 1).5a–c). S pomočjo nanodelcev v pepsinu, tripsinu in α-himotripsinu je bilo mogoče v 4 urah zaščititi več kot 50 %, 60 % oziroma 75 % insulina (slika 5a–c). Ta sposobnost zaščite pred insulinom lahko poveča možnost večje absorpcije insulina v krvni obtok25. Ti rezultati kažejo, da pršenje Sušenje z manitolom ali brez njega in liofilizacija z manitolom lahko ohranita sposobnost nanodelcev, da zaščitijo pred insulinom, po dehidraciji.
Zaščita in sproščanje dehidriranih nanodelcev insulina: (a) zaščita insulina v raztopini pepsina; (b) zaščita insulina v raztopini tripsina; (c) zaščita insulina z raztopino α-himotripsina; (d) sproščanje dehidriranih nanodelcev v raztopini s pH = 2,5; (e) sproščanje dehidriranih nanodelcev v raztopini s pH = 6,6; (f) sproščanje dehidriranih nanodelcev v raztopini s pH = 7,0.
Sveže pripravljene in rekonstituirane suhe nanodelce insulina smo inkubirali v različnih pufrih (pH = 2,5, 6,6, 7,0) pri 37 °C, kar je simuliralo pH okolje želodca, dvanajstnika in zgornjega dela tankega črevesa, da bi preučili vpliv insulina na inzulinsko rezistenco. Obnašanje sproščanja v različnih okoljih. Fragment prebavil. Pri pH = 2,5 so z inzulinom napolnjene NP in resolubilizirane suhe inzulinske NP pokazale začetno bliskovito sproščanje v prvi uri, ki mu je sledilo počasno sproščanje v naslednjih 5 urah (slika 5d). To hitro sproščanje na začetku je najverjetneje posledica hitre površinske desorpcije beljakovinskih molekul, ki niso popolnoma imobilizirane v notranji strukturi delca. Pri pH = 6,5 so z inzulinom napolnjene NP in rekonstituirane suhe inzulinske NP pokazale gladko in počasno sproščanje v 6 urah, saj je bil pH testne raztopine podoben pH raztopine, pripravljene z NP (slika 5e). Pri pH = 7 so bile NP nestabilne in so se skoraj popolnoma razgradile v prvih dveh urah (slika 5f). To je zato, ker se deprotonacija hitosana pojavi pri višjem pH, kar povzroči manj kompaktno polimerno mrežo in sproščanje naloženega inzulina.
Poleg tega so nanodelci insulina, posušeni z razprševanjem brez manitola, pokazali hitrejši profil sproščanja kot drugi dehidrirani nanodelci (slika 5d–f). Kot je bilo že opisano, so rekonstituirani nanodelci insulina, posušeni brez manitola, pokazali najmanjšo velikost delcev. Majhni delci zagotavljajo večjo površino, zato bo večina ustreznega zdravila na površini delcev ali blizu nje, kar bo povzročilo hitro sproščanje zdravila26.
Citotoksičnost NP je bila raziskana z MTT testom. Kot je prikazano na sliki S4, je bilo ugotovljeno, da nobena dehidrirana NP nima pomembnega vpliva na viabilnost celic pri koncentracijah 50–500 μg/ml, kar kaže na to, da se lahko vse dehidrirane NP varno uporabljajo za doseganje terapevtskega okna.
Jetra so glavni organ, preko katerega inzulin izvaja svoje fiziološke funkcije. Celice HepG2 so človeška celična linija hepatoma, ki se pogosto uporablja kot model privzema hepatocitov in vitro. Tukaj so bile celice HepG2 uporabljene za oceno celičnega privzema dehidriranih NP z metodami liofilizacije in sušenja z razprševanjem. Celični privzem s konfokalnim laserskim skeniranjem s pretočno citometrijo in vidom po več urah inkubacije s prostim FITC inzulinom v koncentraciji 25 μg/ml, sveže pripravljenimi FITC inzulinom napolnjenimi NP in dehidriranimi FITC inzulinom napolnjenimi NP pri enakih koncentracijah inzulina. Izvedena so bila opazovanja s kvantitativno mikroskopijo (CLSM). Liofilizirane NP brez manitola so bile med dehidracijo uničene in v tem testu niso bile ocenjene. Intenziteta znotrajcelične fluorescence sveže pripravljenih NP, napolnjenih z insulinom, liofiliziranih NP z manitolom in z razprševanjem sušenih NP z manitolom in brez njega (slika 6a) je bila 4,3-krat, 2,6-krat, 2,4-krat in 4,1-krat večja od prostih. Skupina FITC-insulin (Slika 6b). Ti rezultati kažejo, da je inkapsulirani inzulin močnejši pri celični absorpciji kot prosti inzulin, predvsem zaradi manjše velikosti nanodelcev, napolnjenih z inzulinom, ki so nastali v študiji.
Privzem celic HepG2 po 4 urah inkubacije s sveže pripravljenimi NP in dehidriranimi NP: (a) Porazdelitev privzema FITC-insulina s celicami HepG2. (b) Geometrična sredina intenzivnosti fluorescence, analizirana s pretočno citometrijo (n = 3), *P < 0,05 v primerjavi s prostim insulinom.
Prav tako so slike CLSM pokazale, da je bila intenzivnost fluorescence FITC sveže pripravljenih nanodelcev, napolnjenih z insulinom FITC, in napolnjenih z insulinom, posušenih z razprševanjem (brez manitola), veliko močnejša kot pri drugih vzorcih (slika 6a). Poleg tega je z dodatkom manitola višja viskoznost raztopine povečala odpornost na celični privzem, kar je povzročilo zmanjšano proliferacijo insulina. Ti rezultati kažejo, da so nanodelci, posušeni z razprševanjem brez manitola, pokazali najvišjo učinkovitost celičnega privzema, ker je bila njihova velikost delcev manjša od velikosti liofiliziranih nanodelcev po ponovnem raztapljanju.
Hitozan (povprečna molekulska masa 100 KDa, 75–85 % deacetiliran) je bil kupljen pri podjetju Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada). Natrijev tripolifosfat (TPP) je bil kupljen pri podjetju VWR (Radnor, Pensilvanija, ZDA). Rekombinantni humani inzulin, uporabljen v tej študiji, je bil pri podjetju Fisher Scientific (Waltham, MA, ZDA). Humani inzulin, označen s fluorescein izotiocianatom (FITC), in 4',6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorid (DAPI) sta bila kupljena pri podjetju Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada). Celično linijo HepG2 je bilo pridobljeno pri podjetju ATCC (Manassas, Virginia, ZDA). Vsi drugi reagenti so bili analitske ali kromatografske kakovosti.
Pripravite 1 mg/ml raztopino CS tako, da jo raztopite v dvojno destilirani vodi (DD voda), ki vsebuje 0,1 % ocetne kisline. Pripravite 1 mg/ml raztopini TPP in insulina tako, da ju raztopite v DD vodi oziroma 0,1 % ocetni kislini. Predemulzijo pripravite s homogenizatorjem Polytron PCU-2-110 z visoko hitrostjo (Brinkmann Ind. Westbury, NY, ZDA). Postopek priprave je naslednji: najprej se 2 ml raztopine TPP doda k 4 ml raztopine insulina in zmes meša 30 minut, dokler se dobro ne premeša. Nato se mešana raztopina po kapljicah dodaja raztopini CS z brizgo pri hitrem mešanju (10.000 vrt/min). Zmesi smo 30 minut mešali pri hitrem mešanju (15.000 vrt/min) v ledeni kopeli in nato nastavili določen pH, da smo dobili zamrežene nanodelce insulina. Za nadaljnjo homogenizacijo in zmanjšanje velikosti delcev nanodelcev insulina smo jih sonificirali dodatnih 30 minut v ledena kopel z uporabo sonikatorja tipa sonde (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Nemčija).
Inzulinske nanodelce (NPS) smo testirali na Z-povprečni premer, indeks polidisperznosti (PDI) in zeta potencial z uporabo meritev dinamičnega sipanja svetlobe (DLS) z uporabo Litesizerja 500 (Anton Paar, Gradec, Avstrija) z redčenjem v DD vodi pri 25 °C. Morfologijo in porazdelitev velikosti smo okarakterizirali s transmisijskim elektronskim mikroskopom (TEM) Hitachi H7600 (Hitachi, Tokio, Japonska), slike pa smo nato analizirali s programsko opremo za slikanje Hitachi (Hitachi, Tokio, Japonska). Za oceno učinkovitosti enkapsulacije (EE) in nosilne kapacitete (LC) insulinskih nanodelcev smo nanodelce pipetirali v ultrafiltracijske epruvete z mejo molekulske mase 100 kDa in centrifugirali pri 500 xg 30 minut. Neenkapsulirani inzulin v filtratu smo kvantificirali z uporabo sistema HPLC serije Agilent 1100 (Agilent, Santa Clara, Kalifornija, ZDA), ki je sestavljen iz kvaternarne črpalke, avtovzorčevalnika, grelnika kolone in detektorja DAD. Inzulin smo analizirali. s kolono C18 (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, ZDA) in detektirano pri 214 nm. Mobilna faza je bila acetonitril in voda, ki je vsebovala 0,1 % TFA, gradientna razmerja od 10/90 do 100/0, in je trajala 10 minut. Mobilna faza je bila črpana s pretokom 1,0 ml/min. Temperatura kolone je bila nastavljena na 20 °C. Izračunajte odstotke EE in LC z uporabo enačb (1) in enačbe (2).
Za optimizacijo nanodelcev insulina so bila testirana različna razmerja med CS in inzulinom od 2,0 do 4,0. Med pripravo so bile dodane različne količine raztopine CS, medtem ko je bila mešanica insulina/TPP konstantna. Nanodelci insulina so bili pripravljeni v območju pH od 4,0 do 6,5 s skrbnim nadzorom pH mešanice po dodajanju vseh raztopin (inzulina, TPP in CS). EE in velikost delcev nanodelcev insulina sta bila ocenjena pri različnih vrednostih pH in masnih razmerjih CS/insulina za optimizacijo nastajanja nanodelcev insulina.
Optimizirane inzulinske nanodelceve so bile nameščene na aluminijasti posodi in prekrite s tkivom, zategnjenim z lepilnim trakom. Nato so bile privijačene posode nameščene v liofilizator Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, ZDA), opremljen s sušilnikom s pladnji. Temperatura in vakuumski tlak sta bila nastavljena na -10 °C, 0,350 Torr za prvi 2 uri ter na 0 °C in 0,120 Torr za preostalih 22 ur od 24 ur, da so bile pridobljene suhe inzulinske nanodelceve.
Za pripravo enkapsuliranega insulina je bil uporabljen Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Švica). Izbrani parametri sušenja so bili: temperatura 100 °C, pretok dovoda 3 l/min in pretok plina 4 l/min.
Nanodelce inzulina pred in po dehidraciji smo okarakterizirali s FTIR-ATR spektroskopijo. Dehidrirane nanodelce ter prosti inzulin in hitosan smo analizirali s spektrofotometrom Spectrum 100 FTIR (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, ZDA), opremljenim z univerzalnim dodatkom za vzorčenje ATR (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, ZDA). Povprečja signalov smo dobili iz 16 skeniranj z ločljivostjo 4 cm2 v frekvenčnem območju 4000–600 cm2.
Morfologijo suhih inzulinskih nanodelcev smo ocenili s SEM slikami liofiliziranih in razpršilno sušenih inzulinskih nanodelcev, posnetih z elektronskim mikroskopom s fokusiranim ionskim žarkom Helios NanoLab 650 (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, ZDA). Glavna uporabljena parametra sta bila napetost 5 keV in tok 30 mA.
Vse dehidrirane nanodelce insulina smo ponovno raztopili v dehidrirani vodi. Velikost delcev, PDI, EE in LC smo ponovno preizkusili z isto metodo, kot je bila omenjena prej, da bi ocenili njihovo kakovost po dehidraciji. Stabilnost nanodelcev anhidroinsulina smo izmerili tudi s testiranjem lastnosti nanodelcev po daljšem shranjevanju. V tej študiji smo vse nanodelce po dehidraciji tri mesece shranjevali v hladilniku. Po treh mesecih shranjevanja smo nanodelce testirali na morfološko velikost delcev, PDI, EE in LC.
Za oceno učinkovitosti insulina pri zaščiti NP po dehidraciji raztopite 5 ml rekonstituiranih NP v 45 ml simulirane želodčne tekočine (pH 1,2, ki vsebuje 1 % pepsina), črevesne tekočine (pH 6,8, ki vsebuje 1 % tripsina) ali raztopine himotripsina (100 g/ml, v fosfatnem pufru, pH 7,8). Inkubirali smo jih pri 37 °C s hitrostjo mešanja 100 vrt/min. V različnih časovnih točkah smo zbrali 500 μL raztopine in določili koncentracijo insulina s HPLC.
Sproščanje sveže pripravljenih in dehidriranih nanodelcev insulina in vitro je bilo preizkušeno z metodo dializne vrečke (mejna vrednost molekulske mase 100 kDa, Spectra Por Inc.). Sveže pripravljene in rekonstituirane suhe nanodelcev so bile dializirane v tekočinah s pH 2,5, pH 6,6 in pH 7,0 (0,1 M fosfatno pufrirana fiziološka raztopina, PBS), da bi simulirali pH okolje želodca, dvanajstnika in zgornjega dela tankega črevesa. Vsi vzorci so bili inkubirani pri 37 °C z nenehnim stresanjem pri 200 vrt/min. Tekočino iz 5 ml dializne vrečke aspirirajte ob naslednjih časih: 0,5, 1, 2, 3, 4 in 6 ur ter takoj dopolnite volumen s svežim dializatnim praškom. Kontaminacijo tekočine z insulinom smo analizirali s HPLC, hitrost sproščanja insulina iz nanodelcev pa smo izračunali iz razmerja med sproščenim prostim insulinom in celotnim insulinom, enkapsuliranim v nanodelcih (enačba 3).
Celice linije humanega hepatocelularnega karcinoma HepG2 so gojili v posodicah s premerom 60 mm z uporabo Dulbeccovega modificiranega Eagleovega medija (DMEM), ki je vseboval 10 % fetalnega govejega seruma, 100 ie/ml penicilina in 100 μg/ml streptomicina29. Kulture so vzdrževali pri 37 °C, 95 % relativni vlažnosti in 5 % CO2. Za teste absorpcije so celice HepG2 zasejali v koncentraciji 1 × 10⁶ celic/ml na 8-vdolbinski sistem Nunc Lab-Tek s komornimi stekelci (Thermo Fisher, NY, ZDA). Za teste citotoksičnosti so jih zasejali v 96-vdolbinske plošče (Corning, NY, ZDA) v gostoti 5 × 10⁶ celic/ml.
Za oceno citotoksičnosti sveže pripravljenih in dehidriranih inzulinskih NP30 je bil uporabljen MTT test. Celice HepG2 so bile zasejane v 96-jamične plošče z gostoto 5 × 104 celic/ml in gojene 7 dni pred testiranjem. Inzulinske NP so bile razredčene na različne koncentracije (50 do 500 μg/ml) v gojišču in nato dane celicam. Po 24 urah inkubacije so bile celice 3-krat oprane s PBS in inkubirane z gojiščem, ki je vsebovalo 0,5 mg/ml MTT, še dodatne 4 ure. Citotoksičnost je bila ocenjena z merjenjem encimske redukcije rumenega tetrazolijevega MTT v vijolični formazan pri 570 nm z uporabo spektrofotometra Tecan infinite M200 pro (Tecan, Männedorf, Švica).
Učinkovitost celičnega privzema NP je bila preizkušena s konfokalno lasersko vrstično mikroskopijo in analizo s pretočno citometrijo. Vsako vdolbinico sistema Nunc Lab-Tek s komornimi drsniki smo obdelali s prostim FITC-insulinom, NP, naloženimi s FITC-insulinom, in rekonstituirali 25 μg/ml dehidriranih NP FITC-insulina pri enaki koncentraciji ter inkubirali 4 ure. Celice smo 3-krat sprali s PBS in fiksirali s 4 % paraformaldehidom. Jedra smo obarvali s 4',6-diamidino-2-fenilindolom (DAPI). Lokalizacijo insulina smo opazovali z laserskim vrstičnim/dvofotonskim konfokalnim mikroskopom Olympus FV1000 (Olympus, mesto Šindžuku, Tokio, Japonska). Za analizo s pretočno citometrijo smo na 96-vdolbične plošče, zasejane s celicami HepG2, dodali enake koncentracije 10 μg/ml prostega FITC-insulina, NP, naloženih s FITC-insulinom, in resolubiliziranih dehidriranih NP FITC-insulina ter inkubirali 4 ure. Po 4 urah inkubacije so bile celice odstranjene in 3-krat sprane s FBS. 5 × 10⁴ celic na vzorec je bilo analiziranih s pretočnim citometrom BD LSR II (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Združene države Amerike).
Vse vrednosti so izražene kot povprečje ± standardni odklon. Primerjave med vsemi skupinami so bile ocenjene z uporabo enosmerne ANOVA ali t-testa s programom IBM SPSS Statistics 26 za Mac (IBM, Endicott, New York, ZDA), vrednost p < 0,05 pa je bila ocenjena kot statistično pomembna.
Ta študija dokazuje fleksibilnost in sposobnost razpršilnega sušenja za dehidracijo zamreženih nanodelcev hitosana/TPP/insulina z boljšo rekonstitucijo v primerjavi s standardnimi metodami liofilizacije z uporabo sredstev za povečanje prostornine ali krioprotektantov in večjo nosilnostjo. Optimizirani nanodelci insulina so dali povprečno velikost delcev 318 nm in učinkovitost enkapsulacije 99,4 %. Rezultati SEM in FTIR po dehidraciji so pokazali, da se je sferična struktura ohranila le v razpršilno sušenih nanodelcih z in brez manitola ter liofiliziranih z manitolom, vendar so se liofilizirani nanodelci brez manitola med dehidracijo razgradili. V testu sposobnosti rekonstitucije so nanodelci insulina, sušeni z razprševanjem brez manitola, pokazali najmanjšo povprečno velikost delcev in največjo obremenitev po rekonstituciji. Obnašanje sproščanja vseh teh dehidriranih nanodelcev je pokazalo, da so se hitro sproščali v raztopinah s pH = 2,5 in pH = 7 ter zelo stabilni v raztopini s pH = 6,5. V primerjavi z drugimi ponovno raztopljenimi dehidriranimi nanodelci so nanodelci, sušeni z razprševanjem brez manitola, pokazali najhitrejše sproščanje. sproščanje. Ta rezultat je skladen z rezultatom, opaženim v testu celičnega privzema, saj so nanodelci, posušeni z razprševanjem, brez manitola skoraj v celoti ohranili učinkovitost celičnega privzema sveže pripravljenih nanodelcev. Ti rezultati kažejo, da so suhi nanodelci insulina, pripravljeni z razpršilnim sušenjem brez manitola, najprimernejši za nadaljnjo predelavo v druge brezvodne farmacevtske oblike, kot so peroralne tablete ali bioadhezivni filmi.
Zaradi vprašanj intelektualne lastnine nabori podatkov, ustvarjeni in/ali analizirani med trenutno študijo, niso javno dostopni, vendar so na voljo pri ustreznih avtorjih na razumno zahtevo.
Kagan, A. Sladkorna bolezen tipa 2: družbeni in znanstveni izvori, medicinski zapleti in posledice za bolnike in druge. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. in Jiang, P. Razvoj inkapsulacije insulina: ali je peroralna uporaba zdaj mogoča? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. in Dass, CR. Nedavni napredek pri peroralnih sistemih za dajanje liposomov, napolnjenih z insulinom, za zdravljenje sladkorne bolezni. Interpretacija. J. Pharmacy. 549, 201–217 (2018).