Članek je del raziskovalne teme »Izboljšanje odpornosti stročnic na patogene in škodljivce«, oglejte si vseh 5 člankov
Povzročitelj glivične bolezni rastlin, nekroze, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, uporablja večstopenjsko strategijo za okužbo različnih gostiteljskih rastlin. Ta študija predlaga uporabo diamina L-ornitina, neproteinske aminokisline, ki spodbuja sintezo drugih esencialnih aminokislin, kot alternativno strategijo upravljanja za izboljšanje molekularnih, fizioloških in biokemijskih odzivov Phaseolus vulgaris L. na belo plesen, ki jo povzroča Pseudomonas sclerotiorum. Poskusi in vitro so pokazali, da L-ornitin znatno zavira rast micelija S. pyrenoidosa na način, odvisen od odmerka. Poleg tega lahko znatno zmanjša resnost bele plesni v rastlinjakih. Poleg tega je L-ornitin spodbudil rast tretiranih rastlin, kar kaže, da testirane koncentracije L-ornitina niso bile fitotoksične za tretirane rastline. Poleg tega je L-ornitin povečal izražanje neencimskih antioksidantov (skupni topni fenoli in flavonoidi) in encimskih antioksidantov (katalaza (CAT), peroksidaza (POX) in polifenol oksidaza (PPO)) ter povečal izražanje treh genov, povezanih z antioksidanti (PvCAT1, PvSOD in PvGR). Poleg tega je in silico analiza pokazala prisotnost domnevnega proteina oksaloacetat acetilhidrolaze (SsOAH) v genomu S. sclerotiorum, ki je bil zelo podoben proteinom oksaloacetat acetilhidrolaze (SsOAH) Aspergillus fijiensis (AfOAH) in Penicillium sp. (PlOAH) v smislu funkcionalne analize, ohranjenih domen in topologije. Zanimivo je, da je dodatek L-ornitina v gojišče krompirjeve dekstroze (PDB) znatno zmanjšal izražanje gena SsOAH v miceliju S. sclerotiorum. Podobno je eksogena uporaba L-ornitina znatno zmanjšala izražanje gena SsOAH v glivnih micelijih, zbranih iz tretiranih rastlin. Končno je uporaba L-ornitina znatno zmanjšala izločanje oksalne kisline tako v PDB gojišču kot v okuženih listih. Skratka, L-ornitin ima ključno vlogo pri ohranjanju redoks statusa in krepitvi obrambnega odziva okuženih rastlin. Rezultati te študije bi lahko pomagali pri razvoju inovativnih, okolju prijaznih metod za nadzor bele plesni in ublažitev njenega vpliva na pridelavo fižola in drugih poljščin.
Bela plesen, ki jo povzroča nekrotrofna gliva Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, je uničujoča bolezen, ki zmanjšuje pridelek in predstavlja resno grožnjo za svetovno pridelavo fižola (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum je eden najtežje zatiranih talnih glivičnih rastlinskih patogenov, s širokim naborom gostiteljev, ki vključuje več kot 600 rastlinskih vrst, in sposobnostjo hitre maceracije gostiteljskih tkiv na nespecifičan način (Liang in Rollins, 2018). V neugodnih pogojih preide v kritično fazo svojega življenjskega cikla, ko ostane v mirujočem stanju dlje časa kot črne, trde, semenu podobne strukture, imenovane "sklerocije", v tleh ali kot bele, puhaste izrastke v miceliju ali stebelni sredici okuženih rastlin (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum lahko tvori sklerocije, kar ji omogoča, da preživi na okuženih poljih dlje časa in vztraja med boleznijo (Schwartz et al., 2005). Sklerotije so bogate s hranili, lahko vztrajajo v tleh dlje časa in služijo kot primarni inokulum za nadaljnje okužbe (Schwartz et al., 2005). V ugodnih pogojih sklerotije kalijo in proizvajajo spore, ki se prenašajo po zraku in lahko okužijo vse nadzemne dele rastline, vključno s cvetovi, stebli ali stroki, vendar ne omejeno nanje (Schwartz et al., 2005).
Gliva Sclerotinia sclerotiorum uporablja večstopenjsko strategijo za okužbo gostiteljskih rastlin, ki vključuje vrsto usklajenih dogodkov, od kalitve sklerocijev do razvoja simptomov. Sprva S. sclerotiorum proizvaja suspendirane spore (imenovane askospore) iz gobam podobnih struktur, imenovanih apoteciji, ki se prenesejo v zrak in se razvijejo v negibne sklerocije na okuženih rastlinskih ostankih (Bolton et al., 2006). Gliva nato izloča oksalno kislino, faktor virulence, za nadzor pH rastlinske celične stene, spodbuja encimsko razgradnjo in invazijo tkiva (Hegedus in Rimmer, 2005) ter zavira oksidativni izbruh gostiteljske rastline. Ta proces zakisljevanja oslabi rastlinsko celično steno in zagotavlja ugodno okolje za normalno in učinkovito delovanje encimov, ki razgrajujejo celično steno gliv (CWDE), kar patogenu omogoča, da premaga fizično oviro in prodre v gostiteljska tkiva (Marciano et al., 1983). Ko S. sclerotiorum prodre v tkivo, izloča številne CWDE, kot sta poligalakturonaza in celulaza, ki olajšajo njegovo razširjanje v okuženih tkivih in povzročajo nekrozo tkiva. Napredovanje lezij in hifalnih zastek vodi do značilnih simptomov bele plesni (Hegedus in Rimmer, 2005). Medtem gostiteljske rastline prepoznajo s patogeni povezane molekularne vzorce (PAMP) prek receptorjev za prepoznavanje vzorcev (PRR), kar sproži vrsto signalnih dogodkov, ki na koncu aktivirajo obrambne odzive.
Kljub desetletjem prizadevanj za zatiranje bolezni pri fižolu, tako kot pri drugih komercialnih pridelkih, še vedno primanjkuje ustrezne odporne zarodne plazme zaradi odpornosti, preživetja in prilagodljivosti patogena. Zato je obvladovanje bolezni izjemno zahtevno in zahteva celostno, večplastno strategijo, ki vključuje kombinacijo gojitvenih praks, biološkega zatiranja in kemičnih fungicidov (O'Sullivan et al., 2021). Kemično zatiranje bele plesni je najučinkovitejše, ker lahko fungicidi, če se uporabljajo pravilno in ob pravem času, učinkovito nadzorujejo širjenje bolezni, zmanjšajo resnost okužbe in zmanjšajo izgube pridelka. Vendar pa lahko prekomerna uporaba in pretirano zanašanje na fungicide povzročita pojav odpornih sevov S. sclerotiorum in negativno vplivata na neciljne organizme, zdravje tal in kakovost vode (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Zato je iskanje okolju prijaznih alternativ postalo glavna prednostna naloga.
Poliamini (PA), kot so putrescin, spermidin, spermin in kadaverin, lahko služijo kot obetavne alternative proti rastlinskim patogenom, ki se prenašajo s tlemi, s čimer se v celoti ali delno zmanjša uporaba nevarnih kemičnih fungicidov (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Pri višjih rastlinah so PA vključene v številne fiziološke procese, vključno z delitvijo celic, diferenciacijo in odzivom na abiotske in biotske strese, vendar ne omejeno nanje (Killiny in Nehela, 2020). Delujejo lahko kot antioksidanti, pomagajo pri lovljenju reaktivnih kisikovih spojin (ROS), vzdržujejo redoks homeostazo (Nehela in Killiny, 2023), inducirajo gene, povezane z obrambo (Romero et al., 2018), uravnavajo različne presnovne poti (Nehela in Killiny, 2023), modulirajo endogene fitohormone (Nehela in Killiny, 2019), vzpostavljajo sistemsko pridobljeno odpornost (SAR) in uravnavajo interakcije med rastlinami in patogeni (Nehela in Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Omeniti velja, da se specifični mehanizmi in vloge PA pri obrambi rastlin razlikujejo glede na rastlinsko vrsto, patogene in okoljske pogoje. Najpogostejša PA v rastlinah se biosintetizira iz esencialnega poliamina L-ornitina (Killiny in Nehela, 2020).
L-ornitin ima več vlog pri rasti in razvoju rastlin. Prejšnje študije so na primer pokazale, da je ornitin pri rižu (Oryza sativa) lahko povezan z recikliranjem dušika (Liu et al., 2018), pridelkom, kakovostjo in aromo riža (Lu et al., 2020) ter odzivom na vodni stres (Yang et al., 2000). Poleg tega je eksogena uporaba L-ornitina znatno povečala toleranco na sušo pri sladkorni pesi (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) in omilila stres zaradi soli pri čebuli (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu in Çavuşoǧlu, 2021) in rastlinah indijskega oreščka (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Potencialna vloga L-ornitina pri obrambi pred abiotskim stresom je lahko posledica njegove vloge pri kopičenju prolina v tretiranih rastlinah. Na primer, geni, povezani s presnovo prolina, kot so geni ornitin delta aminotransferaze (delta-OAT) in prolin dehidrogenaze (ProDH1 in ProDH2), so bili predhodno opisani kot vključeni v obrambo Nicotiana benthamiana in Arabidopsis thaliana pred sevi Pseudomonas syringae, ki niso gostitelji (Senthil-Kumar in Mysore, 2012). Po drugi strani pa je za rast patogenov potrebna glivična ornitin dekarboksilaza (ODC) (Singh et al., 2020). Ciljno delovanje na ODC pri Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici z utišanjem genov, ki ga povzroči gostitelj (HIGS), je znatno povečalo odpornost rastlin paradižnika na venenje zaradi bolezni Fusarium (Singh et al., 2020). Vendar pa potencialna vloga eksogene uporabe ornitina proti biotskim stresom, kot so fitopatogeni, ni bila dobro raziskana. Še pomembneje je, da učinki ornitina na odpornost proti boleznim in z njimi povezani biokemični in fiziološki pojavi ostajajo v veliki meri neraziskani.
Razumevanje kompleksnosti okužbe stročnic z bakterijo S. sclerotiorum je pomembno za razvoj učinkovitih strategij zatiranja. V tej študiji smo želeli ugotoviti potencialno vlogo diamina L-ornitina kot ključnega dejavnika pri krepitvi obrambnih mehanizmov in odpornosti stročnic na okužbo s Sclerotinia sclerotiorum. Domnevamo, da ima L-ornitin poleg krepitve obrambnih odzivov okuženih rastlin ključno vlogo tudi pri ohranjanju redoks statusa. Predlagamo, da so potencialni učinki L-ornitina povezani z regulacijo encimskih in neencimskih antioksidativnih obrambnih mehanizmov ter z motenjem dejavnikov patogenosti/virulence gliv in povezanih beljakovin. Zaradi te dvojne funkcionalnosti je L-ornitin obetaven kandidat za trajnostno strategijo za ublažitev vpliva bele plesni in povečanje odpornosti običajnih stročnic na ta močan glivični patogen. Rezultati te študije lahko pomagajo pri razvoju inovativnih, okolju prijaznih metod za zatiranje bele plesni in ublažitev njenega vpliva na pridelavo stročnic.
V tej študiji je bila kot poskusni material uporabljena občutljiva komercialna sorta navadnega fižola, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3). Zdrava semena je prijazno zagotovil Oddelek za raziskave stročnic, Raziskovalni inštitut za poljščine (FCRI), Kmetijski raziskovalni center (ARC), Egipt. Pet semen je bilo posejanih v plastične lončke (notranji premer 35 cm, globina 50 cm), napolnjene z zemljo, okuženo s S. sclerotiorum, v rastlinjakih (25 ± 2 °C, relativna vlažnost 75 ± 1 %, 8 ur svetlobe/16 ur teme). 7–10 dni po setvi (DPS) so bile sadike redčene, tako da sta v vsakem lončku ostali le dve sadiki z enakomerno rastjo in tremi popolnoma razvitimi listi. Vse lončnice so bile zalivane enkrat na dva tedna in gnojene mesečno v priporočeni količini za dano sorto.
Za pripravo L-ornitindiamina (znanega tudi kot (+)-(S)-2,5-diaminopentanojska kislina; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Nemčija) s koncentracijo 500 mg/L smo najprej raztopili 50 mg v 100 ml sterilne destilirane vode. Osnovno raztopino smo nato razredčili in uporabili v nadaljnjih poskusih. Na kratko, šest serij koncentracij L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100 in 125 mg/L) smo testirali in vitro. Poleg tega smo kot negativno kontrolo (Mock) uporabili sterilno destilirano vodo, kot pozitivno kontrolo pa komercialni fungicid „Rizolex-T“ 50 % omočljiv prašek (toklofos-metil 20 % + tiram 30 %; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, governorat Gharbia, Egipt). Komercialni fungicid »Rizolex-T« je bil testiran in vitro v petih koncentracijah (2, 4, 6, 8 in 10 mg/L).
Vzorci stebel in strokov navadnega fižola, ki so kazali tipične simptome bele plesni (stopnja okužbe: 10–30 %), so bili zbrani na komercialnih kmetijah. Čeprav je bila večina okuženega rastlinskega materiala identificirana po vrsti/sorti (občutljiva komercialna sorta Giza 3), so bili drugi, zlasti tisti, pridobljeni na lokalnih tržnicah, neznane vrste. Zbrani okuženi materiali so bili najprej površinsko razkuženi z 0,5 % raztopino natrijevega hipoklorita 3 minute, nato večkrat sprani s sterilno destilirano vodo in obrisani do suhega s sterilnim filtrirnim papirjem, da so odstranili odvečno vodo. Okuženi organi so bili nato iz srednjega tkiva (med zdravim in okuženim tkivom) narezani na majhne koščke, gojeni na gojišču s krompirjevim dekstroznim agarjem (PDA) in inkubirani pri 25 ± 2 °C z 12-urnim ciklom svetlobe/12-urne teme 5 dni, da bi spodbudili nastanek sklerocijev. Za čiščenje glivičnih izolatov iz mešanih ali kontaminiranih kultur je bila uporabljena tudi metoda micelijskega vrha. Prečiščen glivični izolat je bil najprej identificiran na podlagi njegovih kulturnih morfoloških značilnosti, nato pa je bil na podlagi mikroskopskih značilnosti potrjen kot S. sclerotiorum. Nazadnje so bili vsi prečiščeni izolati testirani na patogenost na občutljivi sorti navadnega fižola Giza 3, da bi izpolnili Kochove postulate.
Poleg tega je bil najbolj invazivni izolat S. sclerotiorum (izolat št. 3) dodatno potrjen na podlagi sekvenciranja notranjega transkribiranega razmika (ITS), kot so opisali White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Na kratko, izolate smo gojili v krompirjevi dekstrozni juhi (PDB) in inkubirali pri 25 ± 2 °C 5–7 dni. Glivični micelij smo nato zbrali, filtrirali skozi gazo, dvakrat sprali s sterilno vodo in posušili s sterilnim filtrirnim papirjem. Genomsko DNK smo izolirali z uporabo kompleta Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Regijo ITS rDNA smo nato pomnožili z uporabo specifičnega para začetnih oligonukleotidov ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; pričakovana velikost: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Prečiščene produkte PCR smo poslali v sekvenciranje (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Zaporedja ITS rDNA smo sekvencirali dvosmerno z uporabo Sangerjeve metode sekvenciranja. Sestavljena zaporedja poizvedb smo nato primerjali z najnovejšimi podatki v GenBank in Nacionalnem centru za biotehnološke informacije (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) z uporabo programske opreme BLASTn. Zaporedje poizvedb je bilo primerjano z 20 drugimi sevi/izolati S. sclerotiorum, pridobljenimi iz najnovejših podatkov v NCBI GenBank (dodatna tabela S1) z uporabo programa ClustalW v paketu za molekularno evolucijsko genetsko analizo (MEGA-11; različica 11) (Kumar et al., 2024). Evolucijska analiza je bila izvedena z metodo največje verjetnosti in splošnim časovno reverzibilnim modelom nukleotidne substitucije (Nei in Kumar, 2000). Prikazano je drevo z najvišjo logaritemsko verjetnostjo. Začetno drevo za hevristično iskanje je izbrano z izbiro drevesa z višjo logaritemsko verjetnostjo med drevesom združevanja sosedov (NJ) (Kumar et al., 2024) in drevesom največje varčnosti (MP). Drevo NJ je bilo konstruirano z uporabo matrike parnih razdalj, izračunane z uporabo splošnega časovno reverzibilnega modela (Nei in Kumar, 2000).
Antibakterijsko delovanje L-ornitina in baktericida »Rizolex-T« smo določili in vitro z metodo agar difuzije. Metoda: Ustrezno količino osnovne raztopine L-ornitina (500 mg/L) smo dobro zmešali z 10 ml hranilnega medija PDA, da smo pripravili raztopine s končnimi koncentracijami 12,5, 25, 50, 75, 100 in 125 mg/L. Kot kontrola smo uporabili pet koncentracij fungicida »Rizolex-T« (2, 4, 6, 8 in 10 mg/L) in sterilno destilirano vodo. Po strjevanju medija smo na sredino petrijevke prenesli sveže pripravljen micelijski čep kulture Sclerotinia sclerotiorum s premerom 4 mm in gojili pri 25 ± 2 °C, dokler micelij ni prekril celotne kontrolne petrijevke, nakar smo zabeležili rast gliv. Izračunajte odstotek inhibicije radialne rasti S. sclerotiorum z uporabo enačbe 1:
Poskus je bil ponovljen dvakrat, s šestimi biološkimi ponovitvami za vsako kontrolno/poskusno skupino in petimi lončki (dve rastlini na lonček) za vsako biološko ponovitev. Vsaka biološka ponovitev je bila analizirana dvakrat (dve tehnični ponovitvi), da se zagotovi natančnost, zanesljivost in ponovljivost eksperimentalnih rezultatov. Poleg tega je bila za izračun polovične maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) in IC99 uporabljena probitna regresijska analiza (Prentice, 1976).
Za oceno potenciala L-ornitina v rastlinjakih sta bila izvedena dva zaporedna poskusa v lončkih. Na kratko, lončke so napolnili s sterilizirano glinasto-peščeno zemljo (3:1) in jih inokulirali s sveže pripravljeno kulturo S. sclerotiorum. Najprej so gojili najbolj invazivni izolat S. sclerotiorum (izolat št. 3) tako, da so en sklerocij prerezali na pol, ga z licem navzdol položili na PDA in ga 4 dni inkubirali pri 25 °C v stalni temi (24 ur), da bi spodbudili rast micelija. Nato so z vodilnega roba vzeli štiri agar-čepke s premerom 5 mm in jih inokulirali s 100 g sterilne mešanice pšeničnih in riževih otrobov (1:1, v/v) ter vse bučke 5 dni inkubirali pri 25 ± 2 °C v ciklu 12 ur svetlobe/12 ur teme, da bi spodbudili nastanek sklerocijev. Vsebino vseh bučk smo pred dodajanjem zemlje temeljito premešali, da smo zagotovili homogenost. Nato smo v vsak lonček dodali 100 g mešanice otrobov za kolonizacijo, da bi zagotovili konstantno koncentracijo patogenov. Inokulirane lončke smo zalili, da bi aktivirali rast gliv, in jih za 7 dni postavili v rastlinjak.
V vsak lonček je bilo nato posejanih pet semen sorte Giza 3. Pri lončkih, tretiranih z L-ornitinom in fungicidom Rizolex-T, so sterilizirana semena najprej dve uri namakali v vodni raztopini obeh spojin s končno koncentracijo IC99 približno 250 mg/L oziroma 50 mg/L, nato pa so jih pred setvijo eno uro sušili na zraku. Po drugi strani pa so semena kot negativno kontrolo namočili v sterilni destilirani vodi. Po 10 dneh, pred prvim zalivanjem, so sadike redčili, tako da sta v vsakem lončku ostali le dve čisti sadiki. Poleg tega so za zagotovitev okužbe z S. sclerotiorum stebla fižola v isti razvojni fazi (10 dni) odrezali na dveh različnih mestih s steriliziranim skalpelom in v vsako rano dali približno 0,5 g kolonizacijske mešanice otrobov, nato pa smo z visoko vlažnostjo spodbudili okužbo in razvoj bolezni pri vseh inokuliranih rastlinah. Kontrolne rastline so bile podobno poškodovane in v rano je bila vnesena enaka količina (0,5 g) sterilne, nekolonizirane mešanice otrobov, ki je bila vzdrževana pri visoki vlažnosti, da bi simulirali okolje za razvoj bolezni in zagotovili doslednost med tretiranimi skupinami.
Metoda tretiranja: Sadike fižola smo zalili s 500 ml vodne raztopine L-ornitina (250 mg/l) ali fungicida Rizolex-T (50 mg/l) z namakanjem tal, nato pa smo tretiranje ponovili trikrat v razmiku 10 dni. Kontrolne skupine, tretirane s placebom, smo zalili s 500 ml sterilne destilirane vode. Vse tretiranja smo izvedli v rastlinjakih (25 ± 2 °C, 75 ± 1 % relativne vlažnosti in fotoperioda 8 ur svetlobe/16 ur teme). Vse lončke smo zalivali dvakrat mesečno in jih mesečno tretirali z uravnoteženim gnojilom NPK (20-20-20, s 3,6 % žvepla in mikroelementi TE; Zain Seeds, Egipt) v koncentraciji 3–4 g/l s foliarnim škropljenjem v skladu s priporočili za določeno sorto in navodili proizvajalca. Če ni navedeno drugače, so bili popolnoma razviti zreli listi (2. in 3. list od vrha) zbrani iz vsake biološke ponovitve 72 ur po obdelavi (hpt), homogenizirani, združeni in shranjeni pri -80 °C za nadaljnje analize, vključno z, vendar ne omejeno na, in situ histokemijsko lokalizacijo indikatorjev oksidativnega stresa, lipidno peroksidacijo, encimskimi in neencimskimi antioksidanti ter izražanjem genov.
Intenzivnost okužbe z belo plesnijo je bila ocenjena tedensko 21 dni po inokulaciji (dpi) z uporabo lestvice od 1 do 9 (dodatna tabela S2), ki je temeljila na lestvici Petzoldta in Dicksona (1996), ki so jo spremenili Teran in sod. (2006). Na kratko, stebla in veje fižolovih rastlin so bile pregledane, začenši na mestu inokulacije, da bi sledili napredovanju lezij vzdolž internodijev in vozlišč. Nato je bila izmerjena razdalja lezije od mesta inokulacije do najbolj oddaljene točke vzdolž stebla ali veje in dodeljena ocena od 1 do 9 glede na lokacijo lezije, kjer (1) pomeni, da v bližini mesta inokulacije ni vidne okužbe, (2–9) pa postopno povečanje velikosti lezije in napredovanje vzdolž vozlišč/internodijev (dodatna tabela S2). Intenzivnost okužbe z belo plesnijo je bila nato pretvorjena v odstotke z uporabo formule 2:
Poleg tega je bila površina pod krivuljo napredovanja bolezni (AUDPC) izračunana z uporabo formule (Shaner in Finney, 1977), ki je bila nedavno prilagojena za belo gnilobo navadnega fižola (Chauhan et al., 2020) z uporabo enačbe 3:
Kjer je Yi = resnost bolezni v času ti, Yi+1 = resnost bolezni ob naslednjem času ti+1, ti = čas prve meritve (v dneh), ti+1 = čas naslednje meritve (v dneh), n = skupno število časovnih točk ali opazovalnih točk. Parametri rasti rastlin fižola, vključno z višino rastline (cm), številom vej na rastlino in številom listov na rastlino, so bili tedensko zabeleženi 21 dni v vseh bioloških ponovitvah.
V vsaki biološki ponovitvi so bili vzorci listov (drugi in tretji popolnoma razvit list od vrha) zbrani 45. dan po tretiranju (15 dni po zadnjem tretiranju). Vsaka biološka ponovitev je bila sestavljena iz petih lončkov (dve rastlini na lonček). Približno 500 mg zdrobljenega tkiva je bilo uporabljenih za ekstrakcijo fotosintetskih pigmentov (klorofil a, klorofil b in karotenoidi) z uporabo 80 % acetona pri 4 °C v temi. Po 24 urah so bili vzorci centrifugirani in supernatant je bil zbran za kolorimetrično določanje vsebnosti klorofila a, klorofila b in karotenoidov z uporabo spektrofotometra UV-160A (Shimadzu Corporation, Japonska) po metodi (Lichtenthaler, 1987) z merjenjem absorbance pri treh različnih valovnih dolžinah (A470, A646 in A663 nm). Nazadnje je bila vsebnost fotosintetskih pigmentov izračunana z uporabo naslednjih formul 4–6, ki jih je opisal Lichtenthaler (1987).
72 ur po obdelavi (hpt) so bili iz vsake biološke ponovitve zbrani listi (drugi in tretji popolnoma razvit list od vrha) za histokemično lokalizacijo vodikovega peroksida (H2O2) in superoksidnega aniona (O2•−) in situ. Vsaka biološka ponovitev je bila sestavljena iz petih lončkov (dve rastlini na lonček). Vsaka biološka ponovitev je bila analizirana v dvojniku (dve tehnični ponovitvi), da se zagotovi natančnost, zanesljivost in ponovljivost metode. H2O2 in O2•− sta bila določena z uporabo 0,1 % 3,3′-diaminobenzidina (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Nemčija) oziroma nitromodrega tetrazolija (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Nemčija) po metodah, ki so jih opisali Romero-Puertas et al. (2004) in Adam et al. (1989) z manjšimi spremembami. Za histokemično lokalizacijo H2O2 in situ so lističe vakuumsko infiltrirali z 0,1 % DAB v 10 mM Tris pufru (pH 7,8) in nato 60 minut inkubirali pri sobni temperaturi na svetlobi. Lističe so belili v 0,15 % (v/v) TCA v 4:1 (v/v) etanolu:kloroformu (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Egipt) in nato izpostavili svetlobi, dokler niso potemnili. Podobno so bili ventili vakuumsko infiltrirani z 10 mM kalijevim fosfatnim pufrom (pH 7,8), ki je vseboval 0,1 m/v % HBT, za histokemično lokalizacijo O2•− in situ. Lističe so 20 minut inkubirali na svetlobi pri sobni temperaturi, nato belili kot zgoraj in nato osvetljevali, dokler se niso pojavile temno modre/vijolične lise. Intenzivnost nastale rjave (kot indikator H2O2) ali modro-vijolične (kot indikator O2•−) barve je bila ocenjena z uporabo fidžijske različice programskega paketa za obdelavo slik ImageJ (http://fiji.sc; dostopano 7. marca 2024).
Malondialdehid (MDA; kot označevalec lipidne peroksidacije) je bil določen po metodi Du in Bramlage (1992) z manjšimi spremembami. Listi iz vsake biološke ponovitve (drugi in tretji popolnoma razvit list od vrha) so bili zbrani 72 ur po obdelavi (hpt). Vsaka biološka ponovitev je vključevala pet lončkov (dve rastlini na lonček). Vsaka biološka ponovitev je bila analizirana v dvojniku (dve tehnični ponovitvi), da se zagotovi natančnost, zanesljivost in ponovljivost metode. Na kratko, 0,5 g zmletega listnega tkiva je bilo uporabljenih za ekstrakcijo MDA z 20 % trikloroocetno kislino (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, ZDA), ki je vsebovala 0,01 % butiliranega hidroksitoluena (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA). Vsebnost MDA v supernatantu je bila nato kolorimetrično določena z merjenjem absorbance pri 532 in 600 nm z uporabo spektrofotometra UV-160A (Shimadzu Corporation, Japonska) in nato izražena kot nmol g−1 FW.
Za oceno neencimskih in encimskih antioksidantov so bili listi (drugi in tretji popolnoma razvit list od vrha) zbrani iz vsake biološke ponovitve 72 ur po tretiranju (hpt). Vsaka biološka ponovitev je bila sestavljena iz petih lončkov (dve rastlini na lonček). Vsak biološki vzorec je bil analiziran v dvojniku (dva tehnična vzorca). Dva lista sta bila zmleta s tekočim dušikom in neposredno uporabljena za določanje encimskih in neencimskih antioksidantov, skupnih aminokislin, vsebnosti prolina, izražanja genov in kvantifikacijo oksalata.
Skupne topne fenole smo določili z uporabo Folin-Ciocalteu reagenta (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) z rahlimi spremembami metode, ki so jo opisali Kahkonen in sod. (1999). Na kratko, približno 0,1 g homogeniziranega listnega tkiva smo 24 ur v temi ekstrahirali z 20 ml 80 % metanola, supernatant pa smo zbrali po centrifugiranju. 0,1 ml ekstrakta vzorca smo zmešali z 0,5 ml Folin-Ciocalteu reagenta (10 %), stresali 30 sekund in pustili v temi 5 minut. Nato smo v vsako epruveto dodali 0,5 ml 20 % raztopine natrijevega karbonata (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Kairo, Egipt), dobro premešali in inkubirali pri sobni temperaturi v temi 1 uro. Po inkubaciji smo izmerili absorbanco reakcijske zmesi pri 765 nm z uporabo UV-160A spektrofotometra (Shimadzu Corporation, Japonska). Koncentracija skupnih topnih fenolov v vzorčnih ekstraktih je bila določena z uporabo umeritvene krivulje galne kisline (Fisher Scientific, Hampton, NH, ZDA) in izražena v miligramih ekvivalenta galne kisline na gram sveže teže (mg GAE g-1 sveže teže).
Skupna vsebnost topnih flavonoidov je bila določena po metodi Djeridane et al. (2006) z manjšimi spremembami. Na kratko, 0,3 ml zgoraj navedenega metanolnega ekstrakta je bilo zmešanih z 0,3 ml 5 % raztopine aluminijevega klorida (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, ZDA), močno mešanih in nato inkubiranih pri sobni temperaturi 5 minut, nato pa dodanih 0,3 ml 10 % raztopine kalijevega acetata (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Egipt), dobro premešanih in inkubiranih pri sobni temperaturi 30 minut v temi. Po inkubaciji je bila absorbanca reakcijske zmesi izmerjena pri 430 nm z uporabo spektrofotometra UV-160A (Shimadzu Corporation, Japonska). Koncentracija skupnih topnih flavonoidov v ekstraktih vzorcev je bila določena z uporabo kalibracijske krivulje rutina (TCI America, Portland, OR, ZDA) in nato izražena kot miligrami ekvivalenta rutina na gram sveže teže (mg RE g-1 sveže teže).
Skupna vsebnost prostih aminokislin v listih fižola je bila določena z uporabo modificiranega ninhidrinskega reagenta (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, ZDA) na podlagi metode, ki sta jo predlagala Yokoyama in Hiramatsu (2003) ter modificirala Sun in sod. (2006). Na kratko, 0,1 g zmletega tkiva je bilo ekstrahiranih s pufrom s pH 5,4, 200 μL supernatanta pa je reagiralo z 200 μL ninhidrina (2 %) in 200 μL piridina (10 %; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, ZDA), inkubirano v vreli vodni kopeli 30 minut, nato ohlajeno in izmerjeno pri 580 nm z uporabo spektrofotometra UV-160A (Shimadzu Corporation, Japonska). Po drugi strani pa je bil prolin določen z Batesovo metodo (Bates in sod., 1973). Prolin smo ekstrahirali s 3 % sulfosalicilno kislino (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, ZDA) in po centrifugiranju 0,5 ml supernatanta zmešali z 1 ml ledocetne kisline (Fisher Scientific, Hampton, NH, ZDA) in ninhidrinskim reagentom, inkubirali 45 minut pri 90 °C, ohladili in izmerili pri 520 nm z istim spektrofotometrom kot zgoraj. Skupne proste aminokisline in prolin v listnih ekstraktih smo določili z uporabo kalibracijskih krivulj glicina oziroma prolina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ZDA) in izrazili kot mg/g sveže teže.
Za določitev encimske aktivnosti antioksidativnih encimov smo približno 500 mg homogeniziranega tkiva ekstrahirali s 3 ml 50 mM Tris pufra (pH 7,8), ki je vseboval 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) in 7,5 % polivinilpirolidona (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA), centrifugirali pri 10.000 × g 20 minut v hladilniku (4 °C) in zbrali supernatant (surovi encimski ekstrakt) (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Katalazo (CAT) smo nato reagirali z 2 ml 0,1 M natrijevega fosfatnega pufra (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) in 100 μl 269 mM raztopine H2O2, da smo določili njeno encimsko aktivnost po metodi Aebija (1984) z rahlimi spremembami (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Encimsko aktivnost od gvajakol-odvisne peroksidaze (POX) smo določili po metodi Harracha et al. (2009). (2008) z manjšimi spremembami (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023), encimska aktivnost polifenol oksidaze (PPO) pa je bila določena po reakciji z 2,2 ml 100 mM natrijevega fosfatnega pufra (pH 6,0), 100 μl gvajakola (TCI chemicals, Portland, OR, ZDA) in 100 μl 12 mM H2O2. Metoda je bila nekoliko spremenjena glede na (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Test je bil izveden po reakciji s 3 ml raztopine katehola (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, ZDA) (0,01 M), sveže pripravljene v 0,1 M fosfatnem pufru (pH 6,0). Aktivnost CAT je bila izmerjena s spremljanjem razgradnje H2O2 pri 240 nm (A240), aktivnost POX je bila izmerjena s spremljanjem povečanja absorbance pri 436 nm (A436), aktivnost PPO pa z beleženjem nihanj absorbance pri 495 nm (A495) vsakih 30 sekund po 3 minute z uporabo spektrofotometra UV-160A (Shimadzu, Japonska).
Za odkrivanje ravni transkriptov treh genov, povezanih z antioksidanti, vključno s peroksisomsko katalazo (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), superoksid dismutazo (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1) in glutation reduktazo (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1), v listih fižola (drugi in tretji popolnoma razvit list od vrha) 72 ur po zadnji obdelavi je bila uporabljena RT-PCR v realnem času. Na kratko, RNA je bila izolirana z uporabo kompleta za ekstrakcijo celotne RNA Simply P (kat. št. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Kitajska) v skladu s protokolom proizvajalca. Nato je bila cDNA sintetizirana z uporabo kompleta za sintezo cDNA TOP script™ v skladu z navodili proizvajalca. Zaporedja začetnih oligonukleotidov zgornjih treh genov so navedena v dodatni tabeli S3. Kot gonilni gen je bil uporabljen PvActin-3 (pristopna številka GenBank: XM_068616709.1), relativna ekspresija gena pa je bila izračunana z metodo 2-ΔΔCT (Livak in Schmittgen, 2001). Dokazana je bila stabilnost aktina v biotskem stresu (nezdružljiva interakcija med običajnimi stročnicami in antraknozno glivo Colletotrichum lindemuthianum) in abiotskem stresu (suša, slanost, nizka temperatura) (Borges et al., 2012).
Najprej smo izvedli in silico analizo celotnega genoma proteinov oksaloacetat acetilhidrolaze (OAH) v S. sclerotiorum z uporabo orodja protein-protein BLAST (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Na kratko, uporabili smo OAH iz Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taksid: 1191702; dostopna številka GenBank XP_040799428.1; 342 aminokislin) in Penicillium lagena (PlOAH; taksid: 94218; dostopna številka GenBank XP_056833920.1; 316 aminokislin) kot poizvedbena zaporedja za kartiranje homolognega proteina v S. sclerotiorum (taksid: 5180). BLASTp je bil izveden na podlagi najnovejših razpoložljivih podatkov o genomu S. sclerotiorum v GenBank na spletni strani Nacionalnega centra za biotehnološke informacije (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Poleg tega so bili z uporabo metode največje verjetnosti v MEGA11 (Tamura et al., 2021) in modela na osnovi matrike JTT (Jones et al., 1992) izpeljani predvideni gen OAH iz S. sclerotiorum (SsOAH) ter evolucijska analiza in filogenetsko drevo AfOAH iz A. fijiensis CBS 313.89 in PlOAH iz P. lagena. Filogenetsko drevo je bilo združeno z analizo večkratne poravnave beljakovinskih zaporedij vseh predvidenih genov OAH (SsOAH) iz S. sclerotiorum in poizvedbenega zaporedja z uporabo orodja za poravnavo na podlagi omejitev (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos in Agarwala, 2007). Poleg tega so bila najbolje ujemajoča se aminokislinska zaporedja SsOAH iz S. sclerotiorum poravnana z iskanimi zaporedji (AfOAH in PlOAH) (Larkin et al., 2007) z uporabo programa ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), ohranjena območja v poravnavi pa so bila vizualizirana z orodjem ESPript (različica 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Poleg tega so bile predvidene funkcionalne reprezentativne domene in ohranjena mesta S. sclerotiorum SsOAH interaktivno razvrščene v različne družine z uporabo orodja InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Nazadnje je bilo izvedeno tridimenzionalno (3D) modeliranje strukture predvidenega S. sclerotiorum SsOAH z uporabo programa Protein Homology/Analogy Recognition Engine (strežnik Phyre2 različice 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) in validirano z uporabo strežnika SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Napovedane tridimenzionalne strukture (PDB format) so bile interaktivno vizualizirane z uporabo paketa UCSF-Chimera (različica 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
Za določitev transkripcijske ravni oksaloacetat acetilhidrolaze (SsOAH; dostopna številka GenBank: XM_001590428.1) v miceliju Sclerotinia sclerotiorum smo uporabili kvantitativno fluorescenčno PCR v realnem času. Na kratko, S. sclerotiorum smo inokulirali v bučko, ki je vsebovala PDB, in jo postavili v stresalni inkubator (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, ZDA) pri 25 ± 2 °C za 24 ur pri 150 vrt/min in v stalni temi (24 ur), da bi spodbudili rast micelija. Nato smo celice obdelali z L-ornitinom in fungicidom Rizolex-T pri končnih koncentracijah IC50 (približno 40 oziroma 3,2 mg/L) ter jih nato gojili še 24 ur pod enakimi pogoji. Po inkubaciji smo kulture centrifugirali 5 minut pri 2500 vrt/min in supernatant (glivni micelij) zbrali za analizo izražanja genov. Podobno smo glivični micelij zbrali 0, 24, 48, 72, 96 in 120 ur po okužbi iz okuženih rastlin, ki so na površini okuženih tkiv tvorile belo plesen in bombasti micelij. Iz glivičnega micelija smo ekstrahirali RNA in nato sintetizirali cDNA, kot je opisano zgoraj. Zaporedja začetnih oligonukleotidov za SsOAH so navedena v dodatni tabeli S3. Kot glavni gen smo uporabili SsActin (pristopna številka GenBank: XM_001589919.1), relativno izražanje genov pa smo izračunali z metodo 2-ΔΔCT (Livak in Schmittgen, 2001).
Oksalno kislino smo določili v krompirjevi dekstrozni juhi (PDB) in rastlinskih vzorcih, ki so vsebovali glivični patogen Sclerotinia sclerotiorum, po metodi Xu in Zhang (2000) z manjšimi spremembami. Na kratko, izolate S. sclerotiorum smo inokulirali v bučke, ki so vsebovale PDB, in nato gojili v stresalnem inkubatorju (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, ZDA) pri 150 vrt/min pri 25 ± 2 °C 3–5 dni v stalni temi (24 ur), da bi spodbudili rast micelija. Po inkubaciji smo glivično kulturo najprej filtrirali skozi filtrirni papir Whatman št. 1 in nato centrifugirali pri 2500 vrt/min 5 minut, da smo odstranili preostali micelij. Supernatant smo zbrali in shranili pri 4 °C za nadaljnje kvantitativno določanje oksalata. Za pripravo rastlinskih vzorcev smo približno 0,1 g fragmentov rastlinskega tkiva trikrat ekstrahirali z destilirano vodo (vsakič po 2 ml). Vzorce smo nato centrifugirali pri 2500 vrt/min 5 minut, supernatant pa smo suho filtrirali skozi filtrirni papir Whatman št. 1 in zbrali za nadaljnjo analizo.
Za kvantitativno analizo oksalne kisline smo reakcijsko zmes pripravili v stekleni epruveti z zamaškom v naslednjem vrstnem redu: 0,2 ml vzorca (ali filtrata kulture PDB ali standardne raztopine oksalne kisline), 0,11 ml bromofenol modrega (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, ZDA), 0,198 ml 1 M žveplove kisline (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Egipt) in 0,176 ml 100 mM kalijevega dikromata (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, ZDA), nato pa smo raztopino razredčili na 4,8 ml z destilirano vodo, dobro premešali in takoj postavili v vodno kopel s temperaturo 60 °C. Po 10 minutah smo reakcijo ustavili z dodatkom 0,5 ml raztopine natrijevega hidroksida (NaOH; 0,75 M). Absorbanco (A600) reakcijske zmesi smo izmerili pri 600 nm z uporabo spektrofotometra UV-160 (Shimadzu Corporation, Japonska). PDB in destilirana voda sta bila uporabljena kot kontrolni analizi za kvantifikacijo filtratov kultur oziroma rastlinskih vzorcev. Koncentracije oksalne kisline v filtratih kultur, izražene v mikrogramih oksalne kisline na mililiter medija PDB (μg.mL−1), in v ekstraktih listov, izražene v mikrogramih oksalne kisline na gram sveže teže (μg.g−1 FW), smo določili z uporabo umeritvene krivulje oksalne kisline (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, ZDA).
V celotni študiji so bili vsi poskusi zasnovani po popolnoma randomiziranem načrtu (CRD) s šestimi biološkimi ponovitvami na tretiranje in petimi lončki na biološko ponovitev (dve rastlini na lonček), razen če ni navedeno drugače. Biološke ponovitve so bile analizirane v dvojniku (dve tehnični ponovitvi). Tehnične ponovitve so bile uporabljene za preverjanje ponovljivosti istega poskusa, vendar niso bile uporabljene v statistični analizi, da bi se izognili lažnim ponovitvam. Podatki so bili statistično analizirani z analizo variance (ANOVA), ki ji je sledil Tukey-Kramerjev test pošteno značilne razlike (HSD) (p ≤ 0,05). Za poskuse in vitro so bile vrednosti IC50 in IC99 izračunane z uporabo probit modela in izračunani so bili 95-odstotni intervali zaupanja.
V governoratu El Ghabiya v Egiptu so z različnih sojinih polj zbrali skupno štiri izolate. Na gojišču PDA so vsi izolati ustvarili kremasto bel micelij, ki se je v fazi sklerocija hitro obarval bombažno belo (slika 1A), nato pa v bež ali rjavi barvi. Sklerotiji so običajno gosti, črni, okrogli ali nepravilne oblike, dolgi od 5,2 do 7,7 mm in premera od 3,4 do 5,3 mm (slika 1B). Čeprav so štirje izolati po 10–12 dneh inkubacije pri 25 ± 2 °C razvili robni vzorec sklerocijev na robu gojišča (slika 1A), se je število sklerocijev na ploščo med njimi bistveno razlikovalo (P < 0,001), pri čemer je imel izolat 3 največje število sklerocijev (32,33 ± 1,53 sklerocijev na ploščo; slika 1C). Podobno je izolat št. 3 v PDB proizvedel več oksalne kisline kot drugi izolati (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; slika 1D). Izolat št. 3 je pokazal tipične morfološke in mikroskopske značilnosti fitopatogene glive Sclerotinia sclerotiorum. Na primer, na PDA so kolonije izolata št. 3 hitro rasle, bile so kremasto bele (slika 1A), obratno bež ali svetlo lososovo rumeno-rjave barve in so potrebovale 6–7 dni pri 25 ± 2 °C, da so popolnoma prekrile površino plošče s premerom 9 cm. Na podlagi zgornjih morfoloških in mikroskopskih značilnosti je bil izolat št. 3 identificiran kot Sclerotinia sclerotiorum.
Slika 1. Značilnosti in patogenost izolatov S. sclerotiorum iz običajnih stročnic. (A) Rast micelija štirih izolatov S. sclerotiorum na gojišču PDA, (B) sklerociji štirih izolatov S. sclerotiorum, (C) število sklerocijev (na ploščo), (D) izločanje oksalne kisline na gojišču PDB (μg.mL−1) in (E) resnost bolezni (%) štirih izolatov S. sclerotiorum na občutljivi komercialni sorti stročnic Giza 3 v rastlinjakih. Vrednosti predstavljajo povprečje ± SD petih bioloških ponovitev (n = 5). Različne črke označujejo statistično značilne razlike med tretiranji (p < 0,05). (F–H) Tipični simptomi bele plesni so se pojavili na nadzemnih steblih oziroma silikah 10 dni po inokulaciji z izolatom št. 3 (dpi). (I) Evolucijska analiza regije notranjega transkribiranega razmika (ITS) izolata S. sclerotiorum št. 3 je bila izvedena z metodo največje verjetnosti in primerjana z 20 referenčnimi izolati/sevi, pridobljenimi iz baze podatkov Nacionalnega centra za biotehnološke informacije (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Številke nad črtami združevanja označujejo pokritost regije (%), številke pod črtami združevanja pa dolžino vej.
Poleg tega so bili za potrditev patogenosti uporabljeni štirje pridobljeni izolati S. sclerotiorum za inokulacijo občutljive komercialnega fižola sorte Giza 3 v rastlinjakih, kar je skladno s Kochovimi postulati (slika 1E). Čeprav so bili vsi pridobljeni glivični izolati patogeni in so lahko okužili zeleni fižol (sorta Giza 3), kar je povzročilo tipične simptome bele plesni na vseh nadzemnih delih (slika 1F), zlasti na steblih (slika 1G) in strokih (slika 1H) 10 dni po inokulaciji (dpi), je bil izolat 3 najbolj agresiven izolat v dveh neodvisnih poskusih. Izolat 3 je imel najvišjo stopnjo resnosti bolezni (%) na rastlinah fižola (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 in 76,7 ± 3,1 7, 14 oziroma 21 dni po okužbi; slika 1F).
Identifikacija najbolj invazivnega izolata S. sclerotiorum št. 3 je bila dodatno potrjena na podlagi sekvenciranja notranjega transkribiranega razmika (ITS) (slika 1I). Filogenetska analiza med izolatom št. 3 in 20 referenčnimi izolati/sevi je pokazala visoko podobnost (> 99 %). Omeniti velja, da ima izolat S. sclerotiorum št. 3 (533 bp) visoko podobnost z ameriškim izolatom S. sclerotiorum LPM36, izoliranim iz suhih semen graha (pristopna številka GenBank MK896659.1; 540 bp), in kitajskim izolatom S. sclerotiorum YKY211 (pristopna številka GenBank OR206374.1; 548 bp), ki povzroča gnilobo stebla vijolice (Matthiola incana), vsi pa so ločeno združeni na vrhu dendrograma (slika 1I). Novo zaporedje je bilo deponirano v podatkovni zbirki NCBI in poimenovano »Sclerotinia sclerotiorum – izolat YN-25« (pristopna številka GenBank PV202792). Vidimo lahko, da je izolat 3 najbolj invaziven izolat; zato je bil ta izolat izbran za preučevanje v vseh nadaljnjih poskusih.
Antibakterijsko delovanje diamina L-ornitina (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Nemčija) pri različnih koncentracijah (12,5, 25, 50, 75, 100 in 125 mg/L) proti izolatu 3 S. sclerotiorum je bilo raziskano in vitro. Omeniti velja, da je L-ornitin imel antibakterijski učinek in postopoma zaviral radialno rast hif S. sclerotiorum na način, ki je bil odvisen od odmerka (slika 2A, B). Pri najvišji testirani koncentraciji (125 mg/L) je L-ornitin pokazal najvišjo stopnjo zaviranja rasti micelija (99,62 ± 0,27 %; slika 2B), kar je bilo enakovredno komercialnemu fungicidu Rizolex-T (stopnja zaviranja 99,45 ± 0,39 %; slika 2C) pri najvišji testirani koncentraciji (10 mg/L), kar kaže na podobno učinkovitost.
Slika 2. Antibakterijska aktivnost L-ornitina proti Sclerotinia sclerotiorum in vitro. (A) Primerjava antibakterijske aktivnosti različnih koncentracij L-ornitina proti S. sclerotiorum s komercialnim fungicidom Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Stopnja inhibicije (%) rasti micelija S. sclerotiorum po tretiranju z različnimi koncentracijami L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100 in 125 mg/L) oziroma Rizolex-T (2, 4, 6, 8 in 10 mg/L). Vrednosti predstavljajo povprečje ± SD petih bioloških ponovitev (n = 5). Različne črke označujejo statistične razlike med tretiranji (p < 0,05). (D, E) Regresijska analiza modela Probit L-ornitina in komercialnega fungicida Rizolex-T. Regresijska premica probitnega modela je prikazana kot neprekinjena modra črta, interval zaupanja (95 %) pa kot črtkana rdeča črta.
Poleg tega je bila izvedena probitna regresijska analiza, ustrezni grafi pa so prikazani v tabeli 1 in slikah 2D,E. Na kratko, sprejemljiva vrednost naklona (y = 2,92x − 4,67) in z njo povezana pomembna statistika (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 in p < 0,0001; slika 2D) L-ornitina kažeta na povečano protiglivično delovanje proti S. sclerotiorum v primerjavi s komercialnim fungicidom Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 in p < 0,0001) (tabela 1).
Tabela 1. Vrednosti polovične maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) in IC99 (mg/l) L-ornitina in komercialnega fungicida »Rizolex-T« proti S. sclerotiorum.
Na splošno je L-ornitin (250 mg/L) znatno zmanjšal razvoj in resnost bele plesni na tretiranih rastlinah navadnega fižola v primerjavi z netretiranimi rastlinami, okuženimi z S. sclerotiorum (kontrola; slika 3A). Na kratko, čeprav se je resnost bolezni pri netretiranih okuženih kontrolnih rastlinah postopoma povečevala (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 in 92,33 ± 3,06 %), je L-ornitin znatno zmanjšal resnost bolezni (%) v celotnem poskusu (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 in 26,36 ± 3,07) 7, 14 oziroma 21 dni po tretiranju (dpt) (slika 3A). Podobno se je površina pod krivuljo napredovanja bolezni (AUDPC) pri tretiranju rastlin fižola, okuženih z S. sclerotiorum, z 250 mg/L L-ornitina zmanjšala z 1274,33 ± 33,13 v netretirani kontroli na 281,03 ± 7,95, kar je nekoliko manj kot pri pozitivni kontroli s fungicidom Rizolex-T 50 mg/L (183,61 ± 7,71; slika 3B). Enak trend so opazili tudi v drugem poskusu.
Slika 3. Vpliv eksogene aplikacije L-ornitina na razvoj bele plesni navadnega fižola, ki jo povzroča Sclerotinia sclerotiorum, v rastlinjakih. (A) Krivulja napredovanja bolezni bele plesni navadnega fižola po tretiranju z 250 mg/L L-ornitina. (B) Površina pod krivuljo napredovanja bolezni (AUDPC) bele plesni navadnega fižola po tretiranju z L-ornitinom. Vrednosti predstavljajo povprečje ± SD petih bioloških ponovitev (n = 5). Različne črke označujejo statistično značilne razlike med tretiranji (p < 0,05).
Eksogena aplikacija 250 mg/L L-ornitina je po 42 dneh postopoma povečala višino rastline (slika 4A), število vej na rastlino (slika 4B) in število listov na rastlino (slika 4C). Medtem ko je imel komercialni fungicid Rizolex-T (50 mg/L) največji učinek na vse preučevane prehranske parametre, je imela eksogena aplikacija 250 mg/L L-ornitina drugi največji učinek v primerjavi z netretiranimi kontrolami (sliki 4A–C). Po drugi strani pa tretiranje z L-ornitinom ni imelo pomembnega vpliva na vsebnost fotosintetskih pigmentov klorofila a (slika 4D) in klorofila b (slika 4E), je pa nekoliko povečalo skupno vsebnost karotenoidov (0,56 ± 0,03 mg/g sveže teže) v primerjavi z negativno kontrolo (0,44 ± 0,02 mg/g sveže teže) in pozitivno kontrolo (0,46 ± 0,02 mg/g sveže teže; slika 4F). Na splošno ti rezultati kažejo, da L-ornitin ni fitotoksičen za tretirane stročnice in lahko celo spodbuja njihovo rast.
Slika 4. Vpliv eksogene aplikacije L-ornitina na rastne značilnosti in fotosintetske pigmente listov fižola, okuženih s Sclerotinia sclerotiorum, v rastlinjakih. (A) Višina rastline (cm), (B) Število vej na rastlino, (C) Število listov na rastlino, (D) Vsebnost klorofila a (mg g-1 sveže teže), (E) Vsebnost klorofila b (mg g-1 sveže teže), (F) Skupna vsebnost karotenoidov (mg g-1 sveže teže). Vrednosti so povprečje ± SD petih bioloških ponovitev (n = 5). Različne črke označujejo statistično značilne razlike med tretiranji (p < 0,05).
Histokemična lokalizacija reaktivnih kisikovih spojin (ROS; izraženih kot vodikov peroksid [H2O2]) in prostih radikalov (izraženih kot superoksidni anioni [O2•−]) in situ je pokazala, da je eksogena aplikacija L-ornitina (250 mg/L) znatno zmanjšala kopičenje H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; slika 5A) in O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; slika 5B) v primerjavi z kopičenjem tako pri netretiranih okuženih rastlinah (173,31 ± 12,06 oziroma 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW) kot pri rastlinah, tretiranih s 50 mg/L komercialnega fungicida Rizolex-T (170,12 ± 9,50 oziroma 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt) pri 72 urah. Visoke ravni H2O2 in O2•− so se kopičile pod vplivom visokega oksidativnega oksida (hpt) (slika 5A, B). Podobno je test malondialdehida (MDA) na osnovi TCA pokazal, da so rastline fižola, okužene z S. sclerotiorum, v listih kopičile višje ravni MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g fr. wt) (slika 5C). Vendar pa je eksogena uporaba L-ornitina znatno zmanjšala lipidno peroksidacijo, kar dokazuje zmanjšanje vsebnosti MDA v tretiranih rastlinah (33,08 ± 4,00 nmol.g fr. wt).
Slika 5. Učinek eksogene uporabe L-ornitina na glavne označevalce oksidativnega stresa in neencimskih mehanizmov antioksidativne obrambe v listih fižola, okuženih z S. sclerotiorum, 72 ur po okužbi v rastlinjaku. (A) Vodikov peroksid (H2O2; nmol g−1 FW) pri 72 hpt, (B) superoksidni anion (O2•−; nmol g−1 FW) pri 72 hpt, (C) malondialdehid (MDA; nmol g−1 FW) pri 72 hpt, (D) skupni topni fenoli (mg GAE g−1 FW) pri 72 hpt, (E) skupni topni flavonoidi (mg RE g−1 FW) pri 72 hpt, (F) skupne proste aminokisline (mg g−1 FW) pri 72 hpt in (G) vsebnost prolina (mg g−1 FW) pri 72 hpt. Vrednosti predstavljajo povprečje ± standardni odklon (povprečje ± SD) 5 bioloških ponovitev (n = 5). Različne črke označujejo statistično značilne razlike med obravnavanji (p < 0,05).