Hvala, ker ste obiskali nature.com. Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS. Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite najnovejšo različico brskalnika (ali izklopite način združljivosti v Internet Explorerju). Poleg tega za zagotovitev nadaljnje podpore to spletno mesto ne bo vključevalo slogov ali JavaScripta.
Prašne nevihte predstavljajo resno grožnjo številnim državam po svetu zaradi svojega uničujočega vpliva na kmetijstvo, zdravje ljudi, prometna omrežja in infrastrukturo. Posledično velja vetrna erozija za globalni problem. Eden od okolju prijaznih pristopov k omejevanju vetrne erozije je uporaba mikrobno induciranih karbonatnih padavin (MICP). Vendar pa stranski produkti MICP na osnovi razgradnje sečnine, kot je amonijak, niso idealni, če se proizvajajo v velikih količinah. Ta študija predstavlja dve formulaciji bakterij kalcijevega formata za razgradnjo MICP brez nastajanja sečnine in celovito primerja njuno delovanje z dvema formulacijama bakterij kalcijevega acetata, ki ne proizvajajo amonijaka. Upoštevani bakteriji sta Bacillus subtilis in Bacillus amyloliquefaciens. Najprej so bile določene optimizirane vrednosti dejavnikov, ki nadzorujejo nastajanje CaCO3. Nato so bili na vzorcih peščenih sipin, obdelanih z optimiziranimi formulacijami, izvedeni testi v vetrovniku, izmerjena pa je bila odpornost proti vetrni eroziji, prag hitrosti odstranjevanja in odpornost proti bombardiranju s peskom. Alomorfi kalcijevega karbonata (CaCO3) so bili ocenjeni z optično mikroskopijo, vrstično elektronsko mikroskopijo (SEM) in rentgensko difrakcijsko analizo. Formulacije na osnovi kalcijevega formata so se pri tvorbi kalcijevega karbonata odrezale bistveno bolje kot formulacije na osnovi acetata. Poleg tega je B. subtilis proizvedel več kalcijevega karbonata kot B. amyloliquefaciens. SEM mikrografije so jasno pokazale vezavo in odtis aktivnih in neaktivnih bakterij na kalcijev karbonat, ki ga povzroča sedimentacija. Vse formulacije so znatno zmanjšale vetrno erozijo.
Vetrna erozija je že dolgo prepoznana kot velik problem, s katerim se soočajo sušne in polsušne regije, kot so jugozahod Združenih držav Amerike, zahodna Kitajska, saharska Afrika in velik del Bližnjega vzhoda1. Nizka količina padavin v sušnih in hipersušnih podnebjih je velike dele teh regij spremenila v puščave, peščene sipine in neobdelana zemljišča. Nadaljnja vetrna erozija predstavlja okoljsko grožnjo za infrastrukturo, kot so prometna omrežja, kmetijska zemljišča in industrijska zemljišča, kar vodi v slabe življenjske razmere in visoke stroške urbanega razvoja v teh regijah2,3,4. Pomembno je, da vetrna erozija ne vpliva le na lokacijo, kjer se pojavlja, temveč povzroča tudi zdravstvene in gospodarske težave v oddaljenih skupnostih, saj z vetrom prenaša delce na območja daleč od vira5,6.
Nadzor vetrne erozije ostaja globalni problem. Za nadzor vetrne erozije se uporabljajo različne metode stabilizacije tal. Te metode vključujejo materiale, kot so nanašanje vode7, oljne zastirke8, biopolimeri5, mikrobno inducirane karbonatne oborine (MICP)9,10,11,12 in encimsko inducirane karbonatne oborine (EICP)1. Vlaženje tal je standardna metoda zatiranja prahu na terenu. Vendar pa zaradi hitrega izhlapevanja ta metoda v sušnih in polsušnih območjih ni tako učinkovita1. Uporaba oljnih zastirk poveča kohezijo peska in trenje med delci. Njihova kohezivna lastnost veže peščena zrna skupaj; vendar oljne zastirke predstavljajo tudi druge težave; njihova temna barva poveča absorpcijo toplote in vodi do smrti rastlin in mikroorganizmov. Njihov vonj in hlapi lahko povzročijo težave z dihali, predvsem pa so njihovi visoki stroški še ena ovira. Biopolimeri so ena od nedavno predlaganih okolju prijaznih metod za blaženje vetrne erozije; pridobivajo se iz naravnih virov, kot so rastline, živali in bakterije. Ksantan gumi, guar gumi, hitosan in gelan gumi so najpogosteje uporabljeni biopolimeri v inženirskih aplikacijah5. Vendar pa lahko v vodi topni biopolimeri izgubijo trdnost in se izlužijo iz tal, ko so izpostavljeni vodi13,14. EICP se je izkazal za učinkovito metodo zatiranja prahu za različne aplikacije, vključno z neasfaltiranimi cestami, jalovišči in gradbišči. Čeprav so rezultati spodbudni, je treba upoštevati nekatere morebitne pomanjkljivosti, kot so stroški in pomanjkanje nukleacijskih mest (kar pospeši nastajanje in obarjanje kristalov CaCO315,16).
MICP so prvič opisali konec 19. stoletja Murray in Irwin (1890) ter Steinmann (1901) v svoji študiji razgradnje sečnine z morskimi mikroorganizmi17. MICP je naravni biološki proces, ki vključuje različne mikrobne aktivnosti in kemične procese, pri katerih se kalcijev karbonat obori z reakcijo karbonatnih ionov iz mikrobnih metabolitov s kalcijevimi ioni v okolju18,19. MICP, ki vključuje dušikov cikel, ki razgrajuje sečnino (MICP, ki razgrajuje sečnino), je najpogostejša vrsta mikrobno povzročenega karbonatnega oborjenja, pri katerem ureaza, ki jo proizvajajo bakterije, katalizira hidrolizo sečnine20,21,22,23,24,25,26,27 kot sledi:
Pri MICP, ki vključuje ogljikov cikel oksidacije organskih soli (tip MICP brez razgradnje sečnine), heterotrofne bakterije uporabljajo organske soli, kot so acetat, laktat, citrat, sukcinat, oksalat, malat in glioksilat, kot vire energije za proizvodnjo karbonatnih mineralov28. V prisotnosti kalcijevega laktata kot vira ogljika in kalcijevih ionov je kemijska reakcija nastanka kalcijevega karbonata prikazana v enačbi (5).
V procesu MICP bakterijske celice zagotavljajo mesta nukleacije, ki so še posebej pomembna za obarjanje kalcijevega karbonata; površina bakterijske celice je negativno nabita in lahko deluje kot adsorbent za dvovalentne katione, kot so kalcijevi ioni. Z adsorpcijo kalcijevih ionov na bakterijske celice, ko je koncentracija karbonatnih ionov zadostna, kalcijevi kationi in karbonatni anioni reagirajo in kalcijev karbonat se obori na bakterijski površini29,30. Postopek lahko povzamemo takole31,32:
Biogenerirane kristale kalcijevega karbonata lahko razdelimo na tri vrste: kalcit, vaterit in aragonit. Med njimi sta kalcit in vaterit najpogostejša bakterijsko inducirana alomorfa kalcijevega karbonata33,34. Kalcit je termodinamično najbolj stabilen alomorf kalcijevega karbonata35. Čeprav je bilo poročano, da je vaterit metastabilen, se sčasoma pretvori v kalcit36,37. Vaterit je najgostejši od teh kristalov. Je heksagonalni kristal, ki ima zaradi svoje večje velikosti boljšo sposobnost polnjenja por kot drugi kristali kalcijevega karbonata38. Tako z ureo razgrajen kot z ureo nerazgrajen MICP lahko povzročita precipitacijo vaterita13,39,40,41.
Čeprav je MICP pokazal obetaven potencial pri stabilizaciji problematičnih tal in tal, dovzetnih za vetrno erozijo42,43,44,45,46,47,48, je eden od stranskih produktov hidrolize sečnine amonijak, ki lahko povzroči blage do hude zdravstvene težave, odvisno od stopnje izpostavljenosti49. Zaradi tega stranskega učinka je uporaba te posebne tehnologije sporna, zlasti kadar je treba obdelati velike površine, na primer za zatiranje prahu. Poleg tega je vonj po amoniaku nevzdržen, ko se postopek izvaja z visokimi odmerki in velikimi količinami, kar lahko vpliva na njegovo praktično uporabnost. Čeprav so nedavne študije pokazale, da je mogoče amonijeve ione zmanjšati s pretvorbo v druge produkte, kot je struvit, te metode ne odstranijo amonijevih ionov v celoti50. Zato je še vedno treba raziskati alternativne rešitve, ki ne ustvarjajo amonijevih ionov. Uporaba poti razgradnje brez sečnine za MICP lahko ponudi potencialno rešitev, ki je bila v kontekstu blaženja vetrne erozije slabo raziskana. Fattahi in sod. so raziskovali razgradnjo MICP brez sečnine z uporabo kalcijevega acetata in Bacillus megaterium41, medtem ko so Mohebbi in sod. uporabili kalcijev acetat in Bacillus amyloliquefaciens9. Vendar pa njihova študija ni bila primerjana z drugimi viri kalcija in heterotrofnimi bakterijami, ki bi lahko končno izboljšale odpornost proti vetrni eroziji. Prav tako primanjkuje literature, ki bi primerjala poti razgradnje brez sečnine s potmi razgradnje sečnine pri blaženju vetrne erozije.
Poleg tega je bila večina študij vetrne erozije in nadzora prahu izvedena na vzorcih tal z ravnimi površinami.1,51,52,53 Vendar so ravne površine v naravi manj pogoste kot hribi in kotline. Zato so peščene sipine najpogostejša krajinska značilnost v puščavskih regijah.
Da bi premagali zgoraj omenjene pomanjkljivosti, je bil cilj te študije uvesti nov nabor bakterijskih snovi, ki ne proizvajajo amoniaka. V ta namen smo preučili poti MICP, ki ne razgrajujejo sečnine. Raziskali smo učinkovitost dveh virov kalcija (kalcijevega formata in kalcijevega acetata). Kolikor je avtorjem znano, obarjanje karbonata z uporabo dveh kombinacij virov kalcija in bakterij (tj. kalcijevega formata-Bacillus subtilis in kalcijevega formata-Bacillus amyloliquefaciens) v prejšnjih študijah še ni bilo raziskano. Izbira teh bakterij je temeljila na encimih, ki jih proizvajajo in ki katalizirajo oksidacijo kalcijevega formata in kalcijevega acetata, da nastanejo mikrobne obarjanje karbonata. Zasnovali smo temeljito eksperimentalno študijo, da bi našli optimalne dejavnike, kot so pH, vrste bakterij in virov kalcija ter njihove koncentracije, razmerje med bakterijami in raztopino vira kalcija ter čas strjevanja. Končno je bila učinkovitost tega niza bakterijskih sredstev pri zatiranju vetrne erozije zaradi oborin kalcijevega karbonata raziskana z izvedbo serije testov v vetrovniku na peščenih sipinah, da bi določili velikost vetrne erozije, prag hitrosti odcepa in odpornost peska na vetrno bombardiranje, opravljene pa so bile tudi meritve s penetrometrom in mikrostrukturne študije (npr. analiza rentgenske difrakcije (XRD) in vrstična elektronska mikroskopija (SEM)).
Za proizvodnjo kalcijevega karbonata so potrebni kalcijevi in ​​karbonatni ioni. Kalcijeve ione je mogoče pridobiti iz različnih virov kalcija, kot so kalcijev klorid, kalcijev hidroksid in posneto mleko v prahu54,55. Karbonatne ione je mogoče proizvesti z različnimi mikrobnimi metodami, kot sta hidroliza sečnine in aerobna ali anaerobna oksidacija organske snovi56. V tej študiji so bili karbonatni ioni pridobljeni z oksidacijsko reakcijo formata in acetata. Poleg tega smo za proizvodnjo čistega kalcijevega karbonata uporabili kalcijeve soli formata in acetata, tako da smo kot stranska produkta dobili le CO2 in H2O. V tem postopku le ena snov služi kot vir kalcija in vir karbonata, amonijak pa ne nastaja. Zaradi teh lastnosti je metoda proizvodnje vira kalcija in karbonata, ki smo jo ocenili kot zelo obetavno.
Ustrezne reakcije kalcijevega formata in kalcijevega acetata za tvorbo kalcijevega karbonata so prikazane v formulah (7)-(14). Formule (7)-(11) kažejo, da se kalcijev format raztopi v vodi in tvori mravljinčno kislino ali format. Raztopina je tako vir prostega kalcija in hidroksidnih ionov (formuli 8 in 9). Zaradi oksidacije mravljinčne kisline se atomi ogljika v mravljinčni kislini pretvorijo v ogljikov dioksid (formula 10). Na koncu nastane kalcijev karbonat (formuli 11 in 12).
Podobno se kalcijev karbonat tvori iz kalcijevega acetata (enačbe 13–15), le da namesto mravljinčne kisline nastane ocetna kislina ali acetat.
Brez prisotnosti encimov se acetat in format ne moreta oksidirati pri sobni temperaturi. FDH (format dehidrogenaza) in CoA (koencim A) katalizirata oksidacijo formata in acetata v ogljikov dioksid (enačbi 16, 17) 57, 58, 59. Različne bakterije so sposobne proizvajati te encime, v tej študiji pa so bile uporabljene heterotrofne bakterije, in sicer Bacillus subtilis (PTCC #1204 (Persian Type Culture Collection), znana tudi kot NCIMB #13061 (Mednarodna zbirka bakterij, kvasovk, fagov, plazmidov, rastlinskih semen in rastlinskih tkivnih kultur)) in Bacillus amyloliquefaciens (PTCC #1732, NCIMB #12077). Te bakterije so bile gojene v gojišču, ki je vsebovalo mesni pepton (5 g/L) in mesni ekstrakt (3 g/L), imenovanem hranilna juha (NBR) (105443 Merck).
Tako so bile pripravljene štiri formulacije za indukcijo obarjanja kalcijevega karbonata z uporabo dveh virov kalcija in dveh bakterij: kalcijevega formata in Bacillus subtilis (FS), kalcijevega formata in Bacillus amyloliquefaciens (FA), kalcijevega acetata in Bacillus subtilis (AS) ter kalcijevega acetata in Bacillus amyloliquefaciens (AA).
V prvem delu eksperimentalne zasnove so bili izvedeni testi za določitev optimalne kombinacije, ki bi dosegla največjo proizvodnjo kalcijevega karbonata. Ker so vzorci tal vsebovali kalcijev karbonat, je bil zasnovan niz predhodnih testov za ocenjevanje, s katerimi bi natančno izmerili CaCO3, ki ga proizvajajo različne kombinacije, in ovrednotene so bile mešanice gojišča in raztopin vira kalcija. Za vsako zgoraj definirano kombinacijo vira kalcija in bakterijske raztopine (FS, FA, AS in AA) so bili izpeljani optimizacijski faktorji (koncentracija vira kalcija, čas sušenja, koncentracija bakterijske raztopine, merjena z optično gostoto raztopine (OD), razmerje med virom kalcija in bakterijsko raztopino ter pH) in uporabljeni v testih v vetrovniku za obdelavo peščenih sipin, opisanih v naslednjih razdelkih.
Za vsako kombinacijo je bilo izvedenih 150 poskusov za preučevanje vpliva obarjanja CaCO3 in oceno različnih dejavnikov, in sicer koncentracije vira kalcija, časa sušenja, vrednosti optične gostote bakterij, razmerja med virom kalcija in bakterijsko raztopino ter pH med aerobno oksidacijo organske snovi (tabela 1). Območje pH za optimiziran postopek je bilo izbrano na podlagi rastnih krivulj Bacillus subtilis in Bacillus amyloliquefaciens, da bi dosegli hitrejšo rast. To je podrobneje pojasnjeno v poglavju Rezultati.
Za pripravo vzorcev za optimizacijsko fazo so bili uporabljeni naslednji koraki. Raztopina MICP je bila najprej pripravljena z nastavitvijo začetnega pH gojišča in nato avtoklavirana pri 121 °C 15 minut. Sev je bil nato inokuliran v laminarnem toku zraka in vzdrževan v stresalnem inkubatorju pri 30 °C in 180 vrt/min. Ko je optična gostota bakterij dosegla želeno raven, je bila v želenem razmerju zmešana z raztopino vira kalcija (slika 1a). Raztopina MICP je bila puščena, da se je reagirala in strdila v stresalnem inkubatorju pri 220 vrt/min in 30 °C toliko časa, da je bila dosežena ciljna vrednost. Oborjeni CaCO3 je bil po 5-minutnem centrifugiranju pri 6000 g ločen in nato posušen pri 40 °C, da so bili vzorci pripravljeni za kalcimetrski test (slika 1b). Obarjanje CaCO3 je bilo nato izmerjeno z Bernardovim kalcimetrom, kjer prah CaCO3 reagira z 1,0 N HCl (ASTM-D4373-02) in tvori CO2, volumen tega plina pa je mera vsebnosti CaCO3 (slika 1c). Za pretvorbo volumna CO2 v vsebnost CaCO3 je bila ustvarjena umeritvena krivulja s pranjem čistega prahu CaCO3 z 1 N HCl in njenim prikazom glede na sproščeni CO2. Morfologijo in čistost oborjenega prahu CaCO3 smo raziskali s SEM slikanjem in XRD analizo. Za preučevanje nastajanja kalcijevega karbonata okoli bakterij, faze nastalega kalcijevega karbonata in aktivnosti bakterij je bil uporabljen optični mikroskop s 1000-kratno povečavo.
Porečje Dejegh je znano močno erodirano območje v jugozahodni iranski provinci Fars, raziskovalci pa so z območja zbrali vzorce tal, ki jih je erodiral veter. Vzorci so bili za študijo odvzeti s površine tal. Indikatorski testi vzorcev tal so pokazali, da so bila tla slabo sortirana peščena tla z meljem in so bila v skladu z enotnim sistemom za klasifikacijo tal (USC) razvrščena kot SP-SM (slika 2a). XRD analiza je pokazala, da so bila tla Dejegh sestavljena predvsem iz kalcita in kremena (slika 2b). Poleg tega je EDX analiza pokazala, da so bili v manjših deležih prisotni tudi drugi elementi, kot so Al, K in Fe.
Za pripravo laboratorijskih sipin za testiranje vetrne erozije so zemljo drobili z višine 170 mm skozi lijak s premerom 10 mm na trdno površino, kar je povzročilo tipično sipino višine 60 mm in premera 210 mm. V naravi so peščene sipine z najnižjo gostoto nastale zaradi eolskih procesov. Podobno je imel vzorec, pripravljen po zgornjem postopku, najnižjo relativno gostoto, γ = 14,14 kN/m³, ki je tvorila peščeni stožec, odložen na vodoravni površini s kotom mirovanja približno 29,7°.
Optimalno raztopino MICP, pridobljeno v prejšnjem razdelku, smo popršili po pobočju sipine s hitrostjo nanašanja 1, 2 in 3 lm-2, nato pa smo vzorce 9 dni (tj. optimalni čas strjevanja) shranili v inkubatorju pri 30 °C (slika 3) in jih nato odnesli na testiranje v vetrovniku.
Za vsako obdelavo so bili pripravljeni štirje vzorci, eden za merjenje vsebnosti kalcijevega karbonata in površinske trdnosti z uporabo penetrometra, preostali trije vzorci pa so bili uporabljeni za erozijske teste pri treh različnih hitrostih. V testih v vetrovniku je bila količina erozije določena pri različnih hitrostih vetra, nato pa je bila za vsak obdelani vzorec določena prag hitrosti odcepa z uporabo grafa količine erozije v odvisnosti od hitrosti vetra. Poleg testov vetrne erozije so bili obdelani vzorci podvrženi bombardiranju s peskom (tj. poskusom s skakanjem). V ta namen sta bila pripravljena dva dodatna vzorca s hitrostjo nanašanja 2 in 3 L m−2. Preskus bombardiranja s peskom je trajal 15 minut s pretokom 120 gm−1, kar je znotraj območja vrednosti, izbranih v prejšnjih študijah60,61,62. Vodoravna razdalja med abrazivno šobo in dnom sipine je bila 800 mm, nahajala se je 100 mm nad dnom tunela. Ta položaj je bil nastavljen tako, da so skoraj vsi skakajoči delci peska padli na sipino.
Preizkus v vetrovniku je bil izveden v odprtem vetrovniku dolžine 8 m, širine 0,4 m in višine 1 m (slika 4a). Vetrovnik je izdelan iz pocinkanih jeklenih pločevin in lahko ustvari hitrost vetra do 25 m/s. Poleg tega se za prilagajanje frekvence ventilatorja in postopno povečanje frekvence, da se doseže ciljna hitrost vetra, uporablja frekvenčni pretvornik. Slika 4b prikazuje shematski diagram peščenih sipin, ki jih je erodiral veter, in profil hitrosti vetra, izmerjen v vetrovniku.
Za primerjavo rezultatov neurealitične formulacije MICP, predlagane v tej študiji, z rezultati urealitičnega kontrolnega testa MICP so bili pripravljeni tudi vzorci sipin in obdelani z biološko raztopino, ki je vsebovala sečnino, kalcijev klorid in Sporosarcina pasteurii (ker ima Sporosarcina pasteurii pomembno sposobnost proizvajanja ureaze63). Optična gostota bakterijske raztopine je bila 1,5, koncentracije sečnine in kalcijevega klorida pa 1 M (izbrane na podlagi vrednosti, priporočenih v prejšnjih študijah36,64,65). Gojišče je bilo sestavljeno iz hranilne juhe (8 g/L) in sečnine (20 g/L). Bakterijska raztopina je bila popršena po površini sipine in puščena 24 ur, da so se bakterije pritrdile. Po 24 urah pritrditve je bila popršena cementna raztopina (kalcijev klorid in sečnina). Urealitični kontrolni test MICP se v nadaljnjem besedilu imenuje UMC. Vsebnost kalcijevega karbonata v urealitično in neurealitično obdelanih vzorcih tal je bila določena s pranjem po postopku, ki so ga predlagali Choi in sod.66
Slika 5 prikazuje krivulje rasti bakterij Bacillus amyloliquefaciens in Bacillus subtilis v gojišču (hranilna raztopina) z začetnim pH razponom od 5 do 10. Kot je prikazano na sliki, sta Bacillus amyloliquefaciens in Bacillus subtilis hitreje rasla pri pH 6–8 oziroma 7–9. Zato je bilo to pH območje uporabljeno v fazi optimizacije.
Rastne krivulje (a) Bacillus amyloliquefaciens in (b) Bacillus subtilis pri različnih začetnih pH vrednostih hranilnega medija.
Slika 6 prikazuje količino ogljikovega dioksida, proizvedenega v Bernardovem apnenomeru, ki predstavlja oborjeni kalcijev karbonat (CaCO3). Ker je bil v vsaki kombinaciji en faktor fiksen, drugi faktorji pa so bili spremenjeni, vsaka točka na teh grafih ustreza največji prostornini ogljikovega dioksida v tem nizu poskusov. Kot je prikazano na sliki, se je s povečevanjem koncentracije vira kalcija povečevala tudi proizvodnja kalcijevega karbonata. Zato koncentracija vira kalcija neposredno vpliva na proizvodnjo kalcijevega karbonata. Ker sta vir kalcija in vir ogljika enaka (tj. kalcijev format in kalcijev acetat), več kalcijevih ionov se sprosti, več kalcijevega karbonata se tvori (slika 6a). V formulacijah AS in AA se je proizvodnja kalcijevega karbonata še naprej povečevala z daljšim časom strjevanja, dokler količina oborine po 9 dneh ni bila skoraj nespremenjena. V formulaciji FA se je hitrost nastajanja kalcijevega karbonata zmanjšala, ko je čas strjevanja presegel 6 dni. V primerjavi z drugimi formulacijami je formulacija FS pokazala relativno nizko hitrost nastajanja kalcijevega karbonata po 3 dneh (slika 6b). V formulacijah FA in FS je bilo po treh dneh doseženih 70 % oziroma 87 % celotne proizvodnje kalcijevega karbonata, medtem ko je bil ta delež v formulacijah AA in AS le približno 46 % oziroma 45 %. To kaže, da ima formulacija na osnovi mravljinčne kisline v začetni fazi višjo stopnjo tvorbe CaCO3 v primerjavi s formulacijo na osnovi acetata. Vendar se stopnja tvorbe z naraščajočim časom strjevanja upočasni. Iz slike 6c je mogoče sklepati, da tudi pri koncentracijah bakterij nad OD1 ni pomembnega prispevka k tvorbi kalcijevega karbonata.
Sprememba volumna CO2 (in ustrezne vsebnosti CaCO3), izmerjena z Bernardovim kalcimetrom, kot funkcija (a) koncentracije vira kalcija, (b) časa strjevanja, (c) optične gostote (OG), (d) začetnega pH, (e) razmerja med virom kalcija in bakterijsko raztopino (za vsako formulacijo); in (f) največje količine kalcijevega karbonata, proizvedenega za vsako kombinacijo vira kalcija in bakterij.
Glede vpliva začetnega pH-ja gojišča slika 6d kaže, da je pri FA in FS proizvodnja CaCO3 dosegla največjo vrednost pri pH 7. To opažanje je skladno s prejšnjimi študijami, da so encimi FDH najbolj stabilni pri pH 7–6,7. Vendar pa se je pri AA in AS izločanje CaCO3 povečalo, ko je pH presegel 7. Prejšnje študije so tudi pokazale, da je optimalno območje pH za aktivnost encima CoA od 8 do 9,2–6,8. Glede na to, da sta optimalna območja pH za aktivnost encima CoA in rast B. amyloliquefaciens (8–9,2) oziroma (6–8) (slika 5a), se pričakuje, da bo optimalni pH formulacije AA 8, območja pH pa se prekrivata. To dejstvo so potrdili poskusi, kot je prikazano na sliki 6d. Ker je optimalni pH za rast B. subtilis 7–9 (slika 5b), optimalni pH za aktivnost encima CoA pa 8–9,2, se pričakuje, da bo največji izkoristek obarjanja CaCO3 v območju pH 8–9, kar potrjuje slika 6d (tj. optimalni pH obarjanja je 9). Rezultati, prikazani na sliki 6e, kažejo, da je optimalno razmerje med raztopino vira kalcija in bakterijsko raztopino 1 tako za acetatno kot za formatno raztopino. Za primerjavo je bila učinkovitost različnih formulacij (tj. AA, AS, FA in FS) ocenjena na podlagi največje proizvodnje CaCO3 v različnih pogojih (tj. koncentracija vira kalcija, čas strjevanja, optična gostota, razmerje med virom kalcija in bakterijsko raztopino ter začetni pH). Med preučevanimi formulacijami je imela formulacija FS najvišjo proizvodnjo CaCO3, ki je bila približno trikrat večja od formulacije AA (slika 6f). Za oba vira kalcija so bili izvedeni štirje kontrolni poskusi brez bakterij in po 30 dneh ni bilo opaziti obarjanja CaCO3.
Slike optične mikroskopije vseh formulacij so pokazale, da je bila vaterit glavna faza, v kateri je nastal kalcijev karbonat (slika 7). Kristali vaterita so bili okrogle oblike69,70,71. Ugotovljeno je bilo, da se je kalcijev karbonat oboril na bakterijskih celicah, ker je bila površina bakterijskih celic negativno nabita in je lahko delovala kot adsorbent za dvovalentne katione. Če v tej študiji vzamemo za primer formulacijo FS, se je po 24 urah na nekaterih bakterijskih celicah začel tvoriti kalcijev karbonat (slika 7a), po 48 urah pa se je število bakterijskih celic, prevlečenih s kalcijevim karbonatom, znatno povečalo. Poleg tega je bilo, kot je prikazano na sliki 7b, mogoče zaznati tudi delce vaterita. Končno se je po 72 urah zdelo, da se je veliko število bakterij vezalo na kristale vaterita, število delcev vaterita pa se je znatno povečalo (slika 7c).
Opaževanja izločanja CaCO3 v sestavah FS z optično mikroskopijo skozi čas: (a) 24, (b) 48 in (c) 72 ur.
Za nadaljnjo raziskavo morfologije oborjene faze so bile izvedene analize praškov z rentgensko difrakcijo (XRD) in SEM. XRD spektri (slika 8a) in SEM mikrografije (slika 8b, c) so potrdili prisotnost kristalov vaterita, saj so imeli obliko, podobno solati, in opazili so ujemanje med vrhovi vaterita in vrhovi oborine.
(a) Primerjava rentgenskih difrakcijskih spektrov nastalega CaCO3 in vaterita. SEM mikrografije vaterita pri povečavi (b) 1 kHz in (c) 5,27 kHz.
Rezultati preskusov v vetrovniku so prikazani na sliki 9a in b. Iz slike 9a je razvidno, da je prag hitrosti erozije (TDV) neobdelanega peska približno 4,32 m/s. Pri količini nanosa 1 l/m² (slika 9a) so nakloni krivulj hitrosti izgube tal za frakcije FA, FS, AA in UMC približno enaki kot pri neobdelani sipini. To kaže, da je obdelava pri tej količini nanosa neučinkovita in takoj ko hitrost vetra preseže TDV, tanka skorja tal izgine in stopnja erozije sipine je enaka kot pri neobdelani sipini. Naklon erozije frakcije AS je prav tako nižji kot pri drugih frakcijah z nižjimi abscisami (tj. TDV) (slika 9a). Puščice na sliki 9b kažejo, da pri največji hitrosti vetra 25 m/s pri količinah nanosa 2 in 3 l/m² ni prišlo do erozije v obdelanih sipinah. Z drugimi besedami, pri FS, FA, AS in UMC so bile sipine pri stopnjah nanašanja 2 in 3 l/m² bolj odporne na vetrno erozijo, ki jo povzroča odlaganje CaCO³, kot pri največji hitrosti vetra (tj. 25 m/s). Tako je vrednost TDV 25 m/s, dobljena v teh testih, spodnja meja za stopnje nanašanja, prikazane na sliki 9b, razen v primeru AA, kjer je TDV skoraj enak največji hitrosti v vetrovniku.
Preskus erozije zaradi vetra (a) Izguba teže glede na hitrost vetra (količina nanosa 1 l/m2), (b) Prag hitrosti trganja glede na količino nanosa in formulacijo (CA za kalcijev acetat, CF za kalcijev format).
Slika 10 prikazuje površinsko erozijo peščenih sipin, obdelanih z različnimi formulacijami in odmerki po testu bombardiranja s peskom, kvantitativni rezultati pa so prikazani na sliki 11. Neobdelan primer ni prikazan, ker ni pokazal odpornosti in je bil med testom bombardiranja s peskom popolnoma erodiran (skupna izguba mase). Iz slike 11 je razvidno, da je vzorec, obdelan z biokompozicijo AA, pri odmerku 2 l/m2 izgubil 83,5 % svoje teže, medtem ko so vsi drugi vzorci med postopkom bombardiranja s peskom pokazali manj kot 30 % erozije. Ko se je odmerek povečal na 3 l/m2, so vsi obdelani vzorci izgubili manj kot 25 % svoje teže. Pri obeh odmerkih je spojina FS pokazala najboljšo odpornost na bombardiranje s peskom. Največjo in najmanjšo odpornost na bombardiranje v vzorcih, obdelanih s FS in AA, je mogoče pripisati njihovim največjim in najmanjšim izločanjem CaCO3 (slika 6f).
Rezultati bombardiranja peščenih sipin različnih sestav pri pretokih 2 in 3 l/m2 (puščice označujejo smer vetra, križci pa smer vetra pravokotno na ravnino risbe).
Kot je prikazano na sliki 12, se je vsebnost kalcijevega karbonata v vseh formulah povečevala s povečanjem količine nanosa z 1 l/m² na 3 l/m². Poleg tega je bila pri vseh količinah nanosa formula z najvišjo vsebnostjo kalcijevega karbonata FS, sledili sta ji FA in UMC. To kaže, da imajo te formule lahko večjo površinsko odpornost.
Slika 13a prikazuje spremembo površinske upornosti netretiranih, kontrolnih in tretiranih vzorcev tal, izmerjeno s permeametrskim testom. Iz te slike je razvidno, da se je površinska upornost formulacij UMC, AS, FA in FS znatno povečala s povečanjem odmerka. Vendar pa je bilo povečanje površinske trdnosti pri formulaciji AA relativno majhno. Kot je prikazano na sliki, imajo formulacije FA in FS MICP, ki ni razgrajen s sečnino, boljšo površinsko prepustnost v primerjavi z MICP, razgrajenim s sečnino. Slika 13b prikazuje spremembo TDV z upornostjo površine tal. Iz te slike je jasno razvidno, da bo pri sipinah s površinsko upornostjo večjo od 100 kPa prag hitrosti odstranjevanja presegel 25 m/s. Ker je površinsko upornost in situ mogoče enostavno izmeriti s permeametrom, lahko to znanje pomaga pri oceni TDV brez testiranja v vetrovniku in tako služi kot indikator nadzora kakovosti za terenske aplikacije.
Rezultati SEM so prikazani na sliki 14. Sliki 14a-b prikazujeta povečane delce neobdelanega vzorca tal, kar jasno kaže, da je kohezivno in nima naravne vezi ali cementacije. Slika 14c prikazuje SEM mikrografijo kontrolnega vzorca, obdelanega z MICP, razgrajenim z ureo. Ta slika prikazuje prisotnost CaCO3 oborin kot kalcitnih polimorfov. Kot je prikazano na slikah 14d-o, oborjeni CaCO3 veže delce skupaj; na SEM mikrografijah je mogoče prepoznati tudi sferične kristale vaterita. Rezultati te in prejšnjih študij kažejo, da lahko vezi CaCO3, ki nastanejo kot vateritni polimorfi, zagotavljajo tudi razumno mehansko trdnost; naši rezultati kažejo, da se površinski upor poveča na 350 kPa, prag ločitvene hitrosti pa se poveča s 4,32 na več kot 25 m/s. Ta rezultat je skladen z rezultati prejšnjih študij, da je matrica CaCO3, oborjenega z MICP, vaterit, ki ima razumno mehansko trdnost in odpornost proti vetrni eroziji13,40 ter lahko ohrani razumno odpornost proti vetrni eroziji tudi po 180 dneh izpostavljenosti terenskim okoljskim razmeram13.
(a, b) SEM mikrografije neobdelanih tal, (c) kontrola razgradnje sečnine z MICP, (df) vzorci, obdelani z AA, (gi) vzorci, obdelani z AS, (jl) vzorci, obdelani s FA, in (mo) vzorci, obdelani s FS, pri stopnji nanašanja 3 L/m2 pri različnih povečavah.
Slika 14d-f kaže, da se je po obdelavi z AA spojinami kalcijev karbonat oboril na površini in med zrni peska, opazili pa so tudi nekaj neprevlečenih zrn peska. Pri AS komponentah se količina nastalega CaCO3 ni bistveno povečala (slika 6f), vendar se je količina stikov med zrni peska, ki jih povzroča CaCO3, bistveno povečala v primerjavi z AA spojinami (slika 14g-i).
Iz slik 14j-l in 14m-o je razvidno, da uporaba kalcijevega formata kot vira kalcija vodi do nadaljnjega povečanja izločanja CaCO3 v primerjavi s spojino AS, kar je skladno z meritvami kalcijevega merilnika na sliki 6f. Zdi se, da se ta dodatni CaCO3 odlaga predvsem na delce peska in ne izboljša nujno kakovosti stika. To potrjuje prej opaženo vedenje: kljub razlikam v količini izločanja CaCO3 (slika 6f) se tri formulacije (AS, FA in FS) ne razlikujejo bistveno glede odpornosti proti eolu (vetru) (slika 11) in površinske upornosti (slika 13a).
Za boljšo vizualizacijo bakterijskih celic, prevlečenih s CaCO3, in bakterijskega odtisa na oborjenih kristalih so bile posnete SEM mikrografije z veliko povečavo, rezultati pa so prikazani na sliki 15. Kot je prikazano, se kalcijev karbonat obori na bakterijskih celicah in tam zagotovi jedra, potrebna za oborino. Slika prikazuje tudi aktivne in neaktivne vezi, ki jih inducira CaCO3. Sklepamo lahko, da vsako povečanje neaktivnih vezi ne vodi nujno do nadaljnjega izboljšanja mehanskega vedenja. Zato povečanje oborine CaCO3 ne vodi nujno do večje mehanske trdnosti, vzorec oborine pa igra pomembno vlogo. To točko so preučevali tudi v delih Terzisa in Lalouija72 ter Soghija in Al-Kabanija45,73. Za nadaljnje raziskovanje razmerja med vzorcem oborine in mehansko trdnostjo so priporočljive študije MICP z uporabo slikanja µCT, kar presega obseg te študije (tj. uvedba različnih kombinacij vira kalcija in bakterij za MICP brez amoniaka).
CaCO3 je v vzorcih, obdelanih s (a) sestavo AS in (b) sestavo FS, povzročil aktivne in neaktivne vezi ter pustil odtis bakterijskih celic na usedlini.
Kot je prikazano na slikah 14j-o in 15b, je prisoten film CaCO3 (glede na EDX analizo je odstotna sestava vsakega elementa v filmu ogljik 11 %, kisik 46,62 % in kalcij 42,39 %, kar je zelo blizu odstotku CaCO3 na sliki 16). Ta film prekriva kristale vaterita in delce tal ter pomaga ohranjati celovitost sistema tla-sediment. Prisotnost tega filma je bila opažena le v vzorcih, obdelanih s formulacijo na osnovi formata.
V tabeli 2 so primerjane površinska trdnost, prag hitrosti odtrganja in bioinducirana vsebnost CaCO3 v tleh, obdelanih s potmi MICP, ki razgrajujejo in nerazgrajujejo sečnino, v prejšnjih študijah in tej študiji. Študije o odpornosti vzorcev sipin, obdelanih z MICP, na vetrno erozijo so omejene. Meng in sodelavci so raziskovali odpornost vzorcev sipin, obdelanih z MICP, ki razgrajujejo sečnino, na vetrno erozijo z uporabo puhalnika listja,13 medtem ko so bili v tej študiji vzorci sipin, ki ne razgrajujejo sečnino (kot tudi kontrolni vzorci, ki razgrajujejo sečnino), testirani v vetrovniku in obdelani s štirimi različnimi kombinacijami bakterij in snovi.
Kot je razvidno, so nekatere prejšnje študije upoštevale visoke stopnje nanašanja, ki presegajo 4 L/m213,41,74. Omeniti velja, da visoke stopnje nanašanja z ekonomskega vidika morda niso enostavno uporabne na terenu zaradi stroškov, povezanih z oskrbo z vodo, prevozom in nanašanjem velikih količin vode. Nižje stopnje nanašanja, kot je 1,62–2 L/m2, so prav tako dosegle dokaj dobre površinske trdnosti do 190 kPa in TDV, ki presega 25 m/s. V tej študiji so sipine, obdelane z MICP na osnovi formata brez razgradnje sečnine, dosegle visoke površinske trdnosti, ki so bile primerljive s tistimi, pridobljenimi s potjo razgradnje sečnine v istem območju stopenj nanašanja (tj. vzorci, obdelani z MICP na osnovi formata brez razgradnje sečnine, so prav tako lahko dosegli enak razpon vrednosti površinske trdnosti, kot so poročali Meng in sod., 13, slika 13a) pri višjih stopnjah nanašanja. Vidimo lahko tudi, da je bil pri količini nanosa 2 L/m2 izkoristek kalcijevega karbonata za blaženje vetrne erozije pri hitrosti vetra 25 m/s 2,25 % za MICP na osnovi formata brez razgradnje sečnine, kar je zelo blizu zahtevani količini CaCO3 (tj. 2,41 %) v primerjavi s sipinami, tretiranimi s kontrolnim MICP z razgradnjo sečnine pri enaki količini nanosa in enaki hitrosti vetra (25 m/s).
Iz te tabele lahko torej sklepamo, da tako pot razgradnje s sečnino kot pot razgradnje brez sečnine zagotavljata dokaj sprejemljivo delovanje glede površinske upornosti in TDV. Glavna razlika je v tem, da pot razgradnje brez sečnine ne vsebuje amonijaka in ima zato manjši vpliv na okolje. Poleg tega se zdi, da metoda MICP na osnovi formata brez razgradnje sečnine, predlagana v tej študiji, deluje bolje kot metoda MICP na osnovi acetata brez razgradnje sečnine. Čeprav so Mohebbi in sodelavci preučevali metodo MICP na osnovi acetata brez razgradnje sečnine, je njihova študija vključevala vzorce na ravnih površinah9. Zaradi večje stopnje erozije, ki jo povzroča nastanek vrtincev okoli vzorcev sipin in posledično striženje, kar ima za posledico nižjo TDV, se pričakuje, da bo vetrna erozija vzorcev sipin pri enaki hitrosti bolj očitna kot erozija ravnih površin.