Različne teorije o obrambi rastlin zagotavljajo pomembne teoretične smernice za razlago vzorcev specializiranega metabolizma rastlin, vendar je treba njihove ključne napovedi še preizkusiti. Tukaj smo uporabili nepristransko tandemsko masno spektrometrijo (MS/MS) za sistematično raziskovanje metaboloma oslabljenih sevov tobaka od posameznih rastlin do populacij in tesno sorodnih vrst ter obdelali veliko število teorij masnih spektrometričnih značilnosti, ki temeljijo na sestavljenih spektrih v informacijah. Okvir za testiranje ključnih napovedi teorij optimalne obrambe (OD) in premičnih tarč (MT). Informacijska komponenta rastlinske metabolomike je skladna s teorijo OD, vendar nasprotuje glavni napovedi teorije MT o dinamiki metabolomike, ki jo povzročajo rastlinojedci. Od mikro do makro evolucijske ravni je bil signal jasmonata opredeljen kot glavni dejavnik OD, medtem ko je signal etilena zagotovil fino uravnavanje odziva, specifičnega za rastlinojedce, ki ga je označila molekularna mreža MS/MS.
Posebni metaboliti z raznolikimi strukturami so glavni udeleženci pri prilagajanju rastlin okolju, zlasti pri obrambi pred sovražniki (1). Neverjetna raznolikost posebnega metabolizma, ki ga najdemo v rastlinah, je spodbudila desetletja poglobljenih raziskav o njegovih številnih vidikih ekoloških funkcij in oblikovala dolg seznam teorij obrambe rastlin, ki predstavljajo evolucijski in ekološki razvoj interakcij med rastlinami in žuželkami. Empirične raziskave zagotavljajo pomembne smernice (2). Vendar te teorije obrambe rastlin niso sledile normativni poti hipotetičnega deduktivnega sklepanja, pri katerem so bile ključne napovedi na isti ravni analize (3) in so bile eksperimentalno preizkušene za napredek v naslednjem ciklu teoretičnega razvoja (4). Tehnične omejitve omejujejo zbiranje podatkov na specifične presnovne kategorije in izključujejo celovito analizo specializiranih metabolitov, kar preprečuje primerjave med kategorijami, ki so bistvene za teoretični razvoj (5). Pomanjkanje celovitih metabolomskih podatkov in skupne valute za primerjavo poteka dela v presnovnem prostoru med različnimi skupinami rastlin ovira znanstveno zrelost področja.
Najnovejši razvoj na področju metabolomike s tandemsko masno spektrometrijo (MS/MS) lahko celovito okarakterizira presnovne spremembe znotraj in med vrstami danega sistemskega klada ter se lahko kombinira z računalniškimi metodami za izračun strukturne podobnosti med temi kompleksnimi mešanicami. Predhodno znanje kemije (5). Kombinacija naprednih tehnologij v analizi in računalništvu zagotavlja potreben okvir za dolgoročno testiranje številnih napovedi, ki jih podajajo ekološke in evolucijske teorije presnovne raznolikosti. Shannon (6) je prvič predstavil teorijo informacij v svojem temeljnem članku leta 1948 in s tem postavil temelje za matematično analizo informacij, ki se uporablja na številnih področjih, razen v prvotni uporabi. V genomiki je bila teorija informacij uspešno uporabljena za kvantificiranje konzervativnih informacij o zaporedjih (7). V raziskavah transkriptomike teorija informacij analizira splošne spremembe v transkriptomu (8). V prejšnjih raziskavah smo statistični okvir teorije informacij uporabili v metabolomiki za opis presnovne ekspertize na tkivni ravni v rastlinah (9). Tukaj združujemo delovni tok, ki temelji na MS/MS, s statističnim okvirom informacijske teorije, za katero je značilna presnovna raznolikost v skupni valuti, da bi primerjali ključne napovedi teorije obrambe rastlin metaboloma, ki ga povzročajo rastlinojedci.
Teoretični okviri obrambe rastlin so običajno medsebojno vključujoči in jih lahko razdelimo v dve kategoriji: tiste, ki poskušajo razložiti porazdelitev rastlinsko specifičnih metabolitov na podlagi obrambnih funkcij, kot so optimalna obramba (OD) (10), teorija premikajoče se tarče (MT) (11) in teorija videza (12), medtem ko drugi iščejo mehanične razlage, kako spremembe v razpoložljivosti virov vplivajo na rast rastlin in kopičenje specializiranih metabolitov, kot so hipoteza o ravnovesju ogljika in hranil (13), hipoteza o stopnji rasti (14) in hipoteza o ravnovesju rasti in diferenciacije (15). Oba sklopa teorij sta na različnih ravneh analize (4). Vendar pa v pogovoru o konstitutivni in inducibilni obrambi rastlin prevladujeta dve teoriji, ki vključujeta obrambne funkcije na funkcionalni ravni: teorija OD, ki predpostavlja, da rastline vlagajo v svojo drago kemično obrambo le, kadar je to potrebno, na primer, ko jo zaužijejo. Ko napade travnata žival, se torej glede na možnost prihodnjega napada dodeli spojina z obrambno funkcijo (10); Hipoteza MT predpostavlja, da ni osi usmerjenega spreminjanja metabolitov, temveč se metabolit spreminja naključno, kar ustvarja možnost oviranja presnovne "tarče gibanja" napadajočih rastlinojedcev. Z drugimi besedami, ti dve teoriji dajeta nasprotujoče si napovedi o presnovnem preoblikovanju, ki se pojavi po napadu rastlinojedcev: razmerje med enosmernim kopičenjem metabolitov z obrambno funkcijo (OD) in neusmerjenimi presnovnimi spremembami (MT) (11).
Hipotezi OD in MT ne vključujeta le induciranih sprememb v metabolomu, temveč tudi ekološke in evolucijske posledice kopičenja teh metabolitov, kot so prilagoditveni stroški in koristi teh presnovnih sprememb v specifičnem ekološkem okolju (16). Čeprav obe hipotezi priznavata obrambno funkcijo specializiranih metabolitov, ki so lahko dragi ali pa tudi ne, ključna napoved, ki razlikuje hipotezi OD in MT, leži v usmerjenosti induciranih presnovnih sprememb. Napoved teorije OD je bila doslej deležna največ eksperimentalne pozornosti. Ti testi vključujejo preučevanje neposrednih ali posrednih obrambnih funkcij različnih tkiv specifičnih spojin v rastlinjakih in naravnih pogojih, pa tudi sprememb v fazi razvoja rastlin (17–19). Vendar pa zaradi pomanjkanja poteka dela in statističnega okvira za globalno celovito analizo presnovne raznolikosti katerega koli organizma glavna napoved razlike med obema teorijama (torej smer presnovnih sprememb) še ni bila preizkušena. Tukaj ponujamo takšno analizo.
Ena najpomembnejših značilnosti rastlinsko specifičnih metabolitov je njihova izjemna strukturna raznolikost na vseh ravneh, od posameznih rastlin, populacij do podobnih vrst (20). Na ravni populacije je mogoče opaziti številne kvantitativne spremembe v specializiranih metabolitih, medtem ko se na ravni vrste običajno ohranijo močne kvalitativne razlike (20). Zato je rastlinska metabolična raznolikost glavni vidik funkcionalne raznolikosti, ki odraža prilagodljivost različnim nišam, zlasti tistim z različnimi možnostmi invazije posebnih žuželk in običajnih rastlinojedcev (21). Od Fraenkelovega (22) prelomnega članka o razlogih za obstoj rastlinsko specifičnih metabolitov so interakcije z različnimi žuželkami obravnavane kot pomembni selekcijski pritiski in domneva se, da so te interakcije oblikovale rastline med evolucijo. Presnovna pot (23). Medvrstne razlike v raznolikosti specializiranih metabolitov lahko odražajo tudi fiziološko ravnovesje, povezano s konstitutivno in inducibilno obrambo rastlin pred strategijami rastlinojedcev, saj sta vrsti pogosto negativno korelirani druga z drugo (24). Čeprav je lahko koristno ves čas vzdrževati dobro obrambo, pravočasne presnovne spremembe, povezane z obrambo, zagotavljajo jasne koristi, saj rastlinam omogočajo, da dragocene vire namenijo drugim fiziološkim naložbam (19, 24) in se izognejo potrebi po simbiozi. Kolateralna škoda (25). Poleg tega lahko te reorganizacije specializiranih metabolitov, ki jih povzročajo rastlinojedci, vodijo do destruktivne porazdelitve v populaciji (26) in lahko odražajo neposredne odčitke znatnih naravnih sprememb v signalu jasmonske kisline (JA), ki se lahko ohrani v populaciji. Visoki in nizki signali JA so kompromisi med obrambo pred rastlinojedci in konkurenco s specifičnimi vrstami (27). Poleg tega se bodo specializirane biosintetske poti metabolitov med evolucijo hitro izgubljale in preoblikovale, kar bo povzročilo neenakomerno presnovno porazdelitev med tesno sorodnimi vrstami (28). Ti polimorfizmi se lahko hitro vzpostavijo kot odziv na spreminjajoče se vzorce rastlinojedcev (29), kar pomeni, da je nihanje rastlinojedskih skupnosti ključni dejavnik, ki spodbuja presnovno heterogenost.
Tukaj smo posebej rešili naslednje probleme. (I) Kako rastlinojeda žuželka preoblikuje rastlinski metabolom? (Ii) Katere so glavne informacijske komponente presnovne plastičnosti, ki jih je mogoče kvantificirati za preizkus napovedi teorije dolgoročne obrambe? (Iii) Ali je treba rastlinski metabolom preprogramirati na način, ki je edinstven za napadalca, in če je tako, kakšno vlogo ima rastlinski hormon pri prilagajanju specifičnega presnovnega odziva in kateri presnovki prispevajo k vrstni specifičnosti obrambe? (Iv) Ker je mogoče napovedi številnih obrambnih teorij razširiti na vse ravni bioloških tkiv, smo se vprašali, kako dosleden je povzročeni presnovni odziv od notranje primerjave do medvrstne primerjave? V ta namen smo sistematično preučevali listni metabolom nikotina v tobaku, ki je ekološki model rastline z bogatim specializiranim metabolizmom in je učinkovit proti ličinkam dveh avtohtonih rastlinojedcev, Lepidoptera Datura (Ms) (zelo agresivna, večinoma se jedo). Na Solanaceae in Spodoptera littoralis (Sl) so bombažni črvi nekakšen "rod", pri čemer so gostiteljske rastline Solanaceae in drugi gostitelji drugih rodov in družin rastlinska hrana. Razčlenili smo MS/MS metabolomski spekter in izluščili statistične deskriptorje informacijske teorije za primerjavo teorij OD in MT. Ustvarili smo zemljevide specifičnosti, da bi razkrili identiteto ključnih metabolitov. Analizo smo razširili na avtohtono populacijo N. nasi in tesno sorodnih vrst tobaka, da bi dodatno analizirali kovarianco med signalizacijo rastlinskih hormonov in indukcijo OD.
Da bi zajeli celoten zemljevid plastičnosti in strukture metaboloma listov rastlinojedega tobaka, smo uporabili predhodno razvit potek analize in izračuna za celovito zbiranje in dekonvolucijo podatkov visoke ločljivosti neodvisnih MS/MS spektrov iz rastlinskih izvlečkov (9). Ta nediferencirana metoda (imenovana MS/MS) lahko konstruira neredundantne spektre spojin, ki jih je nato mogoče uporabiti za vse analize na ravni spojin, opisane tukaj. Ti dekonvoluirani rastlinski metaboliti so različnih vrst, sestavljeni iz stotin do tisočev metabolitov (tukaj približno 500–1000 s/MS/MS). Tukaj obravnavamo metabolno plastičnost v okviru teorije informacij in kvantificiramo raznolikost in profesionalnost metaboloma na podlagi Shannonove entropije porazdelitve metabolnih frekvenc. Z uporabo predhodno implementirane formule (8) smo izračunali nabor indikatorjev, ki jih je mogoče uporabiti za kvantifikacijo raznolikosti metaboloma (indikator Hj), specializacije metabolnega profila (indikator δj) in metabolne specifičnosti posameznega metabolita (indikator Si). Poleg tega smo za kvantifikacijo inducibilnosti metaboloma pri rastlinojedcih (slika 1A) (30) uporabili indeks plastičnosti relativne razdalje (RDPI). Znotraj tega statističnega okvira obravnavamo spekter MS/MS kot osnovno informacijsko enoto in obdelamo relativno številčnost MS/MS v zemljevid frekvenčne porazdelitve, nato pa uporabimo Shannonovo entropijo za oceno raznolikosti metaboloma iz njega. Specializacija metaboloma se meri s povprečno specifičnostjo posameznega spektra MS/MS. Zato se povečanje številčnosti nekaterih razredov MS/MS po indukciji pri rastlinojedcih pretvori v spektralno inducibilnost, RDPI in specializacijo, torej v povečanje indeksa δj, ker se proizvajajo bolj specializirani metaboliti in visok indeks Si. Znižanje indeksa raznolikosti Hj odraža, da se bodisi zmanjša število ustvarjenih MS/MS bodisi se porazdelitev frekvenčnih profilov spremeni v manj enakomerno smer, hkrati pa se zmanjša njena splošna negotovost. Z izračunom indeksa Si je mogoče poudariti, katere MS/MS inducirajo določene rastlinojedke živali, nasprotno pa, katere MS/MS se na indukcijo ne odzivajo, kar je ključni kazalnik za razlikovanje med napovedjo MT in OD.
(A) Statistični deskriptorji, uporabljeni za inducibilnost podatkov MS/MS (RDPI), raznolikost (indeks Hj), specializacijo (indeks δj) in specifičnost metabolitov (indeks Si) pri rastlinojedcih. Povečanje stopnje specializacije (δj) kaže, da bo v povprečju proizvedenih več metabolitov, specifičnih za rastlinojedce, medtem ko zmanjšanje raznolikosti (Hj) kaže na zmanjšanje proizvodnje metabolitov ali neenakomerno porazdelitev metabolitov na zemljevidu porazdelitve. Vrednost Si ocenjuje, ali je metabolit specifičen za dano stanje (tukaj rastlinojedstvo) ali pa se, nasprotno, ohranja na isti ravni. (B) Konceptualni diagram napovedi obrambne teorije z uporabo osi informacijske teorije. Teorija OD napoveduje, da bo napad rastlinojedcev povečal obrambne metabolite, s čimer se bo povečal δj. Hkrati se Hj zmanjša, ker se profil reorganizira v smeri zmanjšane negotovosti presnovnih informacij. Teorija MT napoveduje, da bo napad rastlinojedcev povzročil neusmerjene spremembe v metabolomu, s čimer se bo povečal Hj kot indikator povečane negotovosti presnovnih informacij in povzročil naključno porazdelitev Si. Predlagali smo tudi mešani model, najboljši MT, pri katerem bodo nekateri metaboliti z višjimi obrambnimi vrednostmi še posebej povečani (visoka vrednost Si), drugi pa bodo kazali naključne odzive (nižja vrednost Si).
Z uporabo deskriptorjev teorije informacij interpretiramo teorijo OD, da napovedujemo, da bodo spremembe posebnih metabolitov, ki jih povzročajo rastlinojedci v neinduciranem konstitutivnem stanju, vodile do (i) povečanja presnovne specifičnosti (indeks Si), kar bo povzročilo metabonomsko specifičnost (indeks δj) (povečanje) določenih skupin posebnih metabolitov z višjo obrambno vrednostjo, in (ii) zmanjšanja raznolikosti metaboloma (indeks Hj) zaradi spremembe porazdelitve presnovne frekvence v smeri večje porazdelitve leptinskih teles. Na ravni posameznega metabolita se pričakuje urejena porazdelitev Si, kjer bo metabolit povečal vrednost Si glede na svojo obrambno vrednost (slika 1B). V skladu s tem pojasnjujemo teorijo MT, ki napoveduje, da bo vzbujanje vodilo do (i) neusmerjenih sprememb v metabolitih, kar bo povzročilo zmanjšanje indeksa δj, in (ii) povečanja indeksa Hj zaradi povečanja presnovne negotovosti ali naključnosti, ki jo je mogoče kvantificirati s Shannonovo entropijo v obliki posplošene raznolikosti. Kar zadeva presnovno sestavo, bo teorija MT napovedala naključno porazdelitev Si. Glede na to, da so nekateri metaboliti pod specifičnimi pogoji, drugi pa ne, njihova obrambna vrednost pa je odvisna od okolja, smo predlagali tudi model mešane obrambe, v katerem sta δj in Hj porazdeljena vzdolž Si v dveh smereh. Če se Si poveča v vseh smereh, bodo le določene skupine metabolitov, ki imajo višje obrambne vrednosti, še posebej povečale, medtem ko bodo drugi imeli naključno porazdelitev (slika 1B).
Da bi preizkusili napoved na novo definirane obrambne teorije na osi deskriptorja informacijske teorije, smo na listih vrste Nepenthes pallens (slika 2A) vzgojili ličinke rastlinojedcev strokovnjakov (Ms) ali generalistov (Sl) (slika 2A). Z analizo MS/MS smo pridobili 599 neredundantnih MS/MS spektrov (podatkovna datoteka S1) iz metanolnih ekstraktov listnega tkiva, zbranih po hranjenju gosenic. Uporaba indeksov RDPI, Hj in δj za vizualizacijo rekonfiguracije informacijske vsebine v konfiguracijskih datotekah MS/MS razkriva zanimive vzorce (slika 2B). Splošni trend je, kot je opisan v informacijskem deskriptorju, da se stopnja vse presnovne reorganizacije sčasoma povečuje, ko gosenice še naprej jedo liste: 72 ur po tem, ko rastlinojedec zaužije hrano, se RDPI znatno poveča. V primerjavi z nepoškodovano kontrolo se je Hj znatno zmanjšal, kar je bilo posledica povečane stopnje specializacije presnovnega profila, ki je bila kvantificirana z indeksom δj. Ta očitni trend je skladen z napovedmi teorije OD, vendar ni v skladu z glavnimi napovedmi teorije MT, ki meni, da se naključne (neusmerjene) spremembe ravni metabolitov uporabljajo kot obrambna kamuflaža (slika 1B). Čeprav se vsebnost elicitorja oralne sekrecije (OS) in prehranjevalno vedenje teh dveh rastlinojedcev razlikujeta, je njuno neposredno hranjenje povzročilo podobne spremembe v smereh Hj in δj med 24-urnim in 72-urnim obdobjem žetve. Edina razlika se je pojavila pri 72 urah RDPI. V primerjavi s presnovo, ki jo je povzročilo hranjenje z Ms, je bil celotni metabolizem, ki ga je povzročilo hranjenje z Sl, višji.
(A) Eksperimentalna zasnova: rastlinojedci navadnega prašiča (S1) ali strokovnjaka (Ms) se hranijo z razsoljenimi listi vrčev, medtem ko se pri simulirani rastlinojedosti za obravnavo vboda rane na standardiziranih mestih listov uporablja OS Ms (W + OSMs). Ličinke S1 (W + OSSl) ali voda (W + W). Kontrolna skupina (C) je nepoškodovan list. (B) Indeks indukcije (RDPI v primerjavi s kontrolno karto), raznolikosti (indeks Hj) in specializacije (indeks δj), izračunan za zemljevid posebnih metabolitov (599 MS/MS; podatkovna datoteka S1). Zvezdice označujejo pomembne razlike med neposrednim hranjenjem rastlinojedcev in kontrolno skupino (Studentov t-test s parnim t-testom, *P<0,05 in ***P<0,001). ns, ni pomembno. (C) Indeks časovne ločljivosti glavnega (modri okvir, aminokislina, organska kislina in sladkor; podatkovna datoteka S2) in spektra posebnih metabolitov (rdeči okvir 443 MS/MS; podatkovna datoteka S1) po simulirani obdelavi rastlin. Barvni pas se nanaša na 95-odstotni interval zaupanja. Zvezdica označuje pomembno razliko med obdelavo in kontrolo [kvadratna analiza variance (ANOVA), ki ji sledi Tukeyjeva pošteno pomembna razlika (HSD) za post hoc večkratne primerjave, *P<0,05, **P<0,01 in *** P <0,001]. (D) Specializacija razpršenih diagramov in profilov posebnih metabolitov (ponavljajoči se vzorci z različnimi obdelavami).
Da bi raziskali, ali se preoblikovanje, ki ga povzročajo rastlinojedci na ravni metaboloma, odraža v spremembah ravni posameznih metabolitov, smo se najprej osredotočili na metabolite, ki smo jih predhodno preučevali v listih rastline Nepenthes pallens z dokazano odpornostjo na rastlinojedce. Fenolni amidi so konjugati hidroksicinamamid-poliamina, ki se kopičijo med procesom rastlinojedstva žuželk in so znani po tem, da zmanjšujejo njihovo učinkovitost (32). Preiskali smo predhodnike ustreznih MS/MS in narisali njihove kumulativne kinetične krivulje (slika S1). Ni presenetljivo, da so fenolni derivati, ki niso neposredno vključeni v obrambo pred rastlinojedci, kot sta klorogenska kislina (CGA) in rutin, po rastlinojedstvu zmanjšano izraženi. Nasprotno pa lahko rastlinojedci fenol amide naredijo zelo potentne. Neprekinjeno hranjenje obeh rastlinojedcev je povzročilo skoraj enak spekter vzbujanja fenolamidov, ta vzorec pa je bil še posebej očiten pri de novo sintezi fenolamidov. Enak pojav bomo opazili pri raziskovanju poti 17-hidroksigeranil nonandiol diterpenskih glikozidov (17-HGL-DTG), ki proizvaja veliko število acikličnih diterpenov z učinkovitimi anti-rastlinojedimi funkcijami (33), od katerih je hranjenje Ms s Sl sprožilo podoben profil izražanja (slika S1).
Možna pomanjkljivost poskusov neposrednega hranjenja rastlinojedcev je razlika v hitrosti porabe listov in času hranjenja rastlinojedcev, zaradi česar je težko odpraviti učinke, specifične za rastlinojedce, ki jih povzročajo rane in rastlinojedci. Da bi bolje rešili specifičnost induciranega presnovnega odziva listov pri rastlinojedcih, smo simulirali hranjenje ličink Ms in Sl tako, da smo sveže zbrane OS (OSM in OSS1) takoj nanesli na standardno punkcijo W v enakih položajih listov. Ta postopek se imenuje obdelava W + OS in standardizira indukcijo z natančnim časovnim določanjem začetka odziva, ki ga povzroči rastlinojedec, ne da bi pri tem povzročil moteče učinke razlik v hitrosti ali količini izgube tkiva (slika 2A) (34). Z uporabo MS/MS analize in izračunskega cevovoda smo pridobili 443 MS/MS spektrov (podatkovna datoteka S1), ki so se prekrivali s spektri, ki smo jih predhodno sestavili iz poskusov neposrednega hranjenja. Analiza informacijske teorije tega nabora podatkov MS/MS je pokazala, da je reprogramiranje metabolomov, specializiranih za liste, s simulacijo rastlinojedcev pokazalo spodbude, specifične za OS (slika 2C). Predvsem v primerjavi z zdravljenjem z OSS1 je OSM po 4 urah povzročil povečanje specializacije metaboloma. Omeniti velja, da se je v primerjavi z eksperimentalnim naborom podatkov o neposrednem hranjenju rastlinojedcev presnovna kinetika, vizualizirana v dvodimenzionalnem prostoru z uporabo koordinat Hj in δj, ter usmerjenost specializacije metaboloma kot odziv na simulirano zdravljenje z rastlinojedci skozi čas dosledno povečevala (slika 2D). Hkrati smo kvantificirali vsebnost aminokislin, organskih kislin in sladkorjev (podatkovna datoteka S2), da bi raziskali, ali je to ciljno povečanje strokovnega znanja o metabolomu posledica rekonfiguracije centralnega metabolizma ogljika kot odziv na simulirane rastlinojedce (slika S2). Da bi bolje razložili ta vzorec, smo nadalje spremljali kinetiko presnovne akumulacije prej omenjenih poti fenolamida in 17-HGL-DTG. Indukcija rastlinojedcev, specifična za OS, se pretvori v vzorec diferencialne prerazporeditve znotraj metabolizma fenolamida (slika S3). OSS1 prednostno inducira fenolne amide, ki vsebujejo kumarinske in kofeoilne dele, medtem ko OSM sprožijo specifično indukcijo ferulilnih konjugatov. Za pot 17-HGL-DTG je bila zaznana diferencialna indukcija OS z nizkonapetostnimi produkti malonilacije in dimalonilacije (slika S3).
Nato smo preučevali plastičnost transkriptoma, ki jo povzroča OS, z uporabo nabora podatkov mikromrež s časovnim potekom, ki simulira uporabo OSM za obdelavo listov rozete rastlin pri rastlinojedcih. Kinetika vzorčenja se v bistvu prekriva s kinetiko, uporabljeno v tej študiji metabolomike (35). V primerjavi z rekonfiguracijo metaboloma, pri kateri se metabolična plastičnost sčasoma še posebej poveča, opazujemo prehodne transkripcijske izbruhe v listih, ki jih povzroča Ms, kjer sta inducibilnost transkriptoma (RDPI) in specializacija (δj) na ravni 1. V tem časovnem obdobju je prišlo do znatnega povečanja ur in raznolikosti (Hj), izražanje BMP1 pa se je znatno zmanjšalo, sledila pa je sprostitev specializacije transkriptoma (slika S4). Družine presnovnih genov (kot so P450, glikoziltransferaza in BAHD aciltransferaza) sodelujejo v procesu sestavljanja posebnih presnovkov iz strukturnih enot, ki izhajajo iz primarnega metabolizma, po zgoraj omenjenem zgodnjem modelu visoke specializacije. Kot študija primera je bila analizirana pot fenilalanina. Analiza je potrdila, da so osrednji geni v presnovi fenolamida pri rastlinojedcih v primerjavi z rastlinami, ki jih ta pot ne privlači, močno inducirani z OS in so si v vzorcih izražanja tesno povezani. Transkripcijski faktor MYB8 in strukturni geni PAL1, PAL2, C4H in 4CL v zgornjem delu te poti so pokazali zgodnjo iniciacijo transkripcije. Aciltransferaze, ki igrajo vlogo pri končni sestavi fenolamida, kot so AT1, DH29 in CV86, kažejo dolgotrajen vzorec povečane regulacije (slika S4). Zgornja opažanja kažejo, da sta zgodnja iniciacija specializacije transkriptoma in kasnejša okrepitev specializacije metabolomike sklopljen način, kar je lahko posledica sinhronega regulatornega sistema, ki sproži močan obrambni odziv.
Rekonfiguracija v signalizaciji rastlinskih hormonov deluje kot regulatorna plast, ki integrira informacije o rastlinojedcih za reprogramiranje fiziologije rastlin. Po simulaciji rastlinojedcev smo izmerili kumulativno dinamiko ključnih kategorij rastlinskih hormonov in vizualizirali časovno soizražanje med njimi [Pearsonov korelacijski koeficient (PCC) > 0,4] (slika 3A). Kot je bilo pričakovano, so rastlinski hormoni, povezani z biosintezo, povezani znotraj mreže soizražanja rastlinskih hormonov. Poleg tega je na to mrežo preslikana presnovna specifičnost (indeks Si), da se poudarijo rastlinski hormoni, ki jih povzročajo različni tretmaji. Narisana sta dve glavni področji specifičnega odziva rastlinojedcev: eno je v grozdu JA, kjer JA (njegova biološko aktivna oblika JA-Ile) in drugi derivati ​​JA kažejo najvišjo vrednost Si; drugo je etilen (ET). Giberelin je pokazal le zmerno povečanje specifičnosti za rastlinojedce, medtem ko so imeli drugi rastlinski hormoni, kot so citokinin, avksin in abscisinska kislina, nizko indukcijsko specifičnost za rastlinojedce. V primerjavi z uporabo samega W + W se lahko ojačanje najvišje vrednosti derivatov JA z uporabo OS (W + OS) v bistvu pretvori v močan specifičen indikator JA. Nepričakovano je znano, da OSM in OSS1 z različno vsebnostjo elicitorjev povzročata podobno kopičenje JA in JA-Ile. Za razliko od OSS1 OSM specifično in močno inducirajo, medtem ko OSS1 ne ojača odziva bazalnih ran (slika 3B).
(A) Analiza koekspresijske mreže na podlagi PCC izračuna kinetike kopičenja rastlinskih hormonov, ki jih povzročajo rastlinojedci. Vozlišče predstavlja posamezen rastlinski hormon, velikost vozlišča pa predstavlja indeks Si, specifičen za rastlinski hormon med tretiranji. (B) Kopičenje JA, JA-Ile in ET v listih, ki ga povzročajo različna tretiranja, je označeno z različnimi barvami: marelična, W + OSM; modra, W + OSSl; črna, W + W; siva, C (kontrola). Zvezdice označujejo pomembne razlike med tretiranjem in kontrolo (dvosmerna ANOVA, ki ji sledi Tukey HSD post hoc večkratna primerjava, *** P <0,001). Analiza informacijske teorije (C)697 MS/MS (podatkovna datoteka S1) v biosintezi JA in spektru oslabljenega zaznavanja (irAOC in irCOI1) ter (D)585 MS/MS (podatkovna datoteka S1) v ETR1 z oslabljenim ET signalom. Dve simulirani tretiranji z rastlinojedci sta sprožili rastlinske linije in kontrolne rastline s praznim vozilom (EV). Zvezdice označujejo pomembne razlike med obdelavo W+OS in nepoškodovano kontrolo (dvosmerna ANOVA, ki ji je sledila Tukey HSD post hoc večkratna primerjava, *P<0,05, **P<0,01 in ***P<0,001). (E) Razpršeni grafi razpršene opozicije do specializacije. Barve predstavljajo različne gensko spremenjene seve; simboli predstavljajo različne metode obdelave: trikotnik, W + OSS1; pravokotnik, W + OSM; krog C
Nato smo uporabili gensko spremenjen sev atenuiranih Nepenthes (irCOI1 in sETR1) v ključnih korakih biosinteze JA in ET (irAOC in irACO) ter zaznavanja (irCOI1 in sETR1) za analizo metabolizma teh dveh rastlinskih hormonov pri rastlinojedcih. Relativni prispevek reprogramiranja. V skladu s prejšnjimi poskusi smo potrdili indukcijo rastlinojedega OS v rastlinah s praznimi nosilci (EV) (slika 3, C do D) in splošno zmanjšanje indeksa Hj, ki ga je povzročil OSM, medtem ko se je indeks δj povečal. Odziv je bolj izrazit kot odziv, ki ga je sprožil OSS1. Dvovrstični graf z uporabo Hj in δj kot koordinat prikazuje specifično deregulacijo (slika 3E). Najbolj očiten trend je, da so pri sevih brez JA signala spremembe metaboloma in specializacije, ki jih povzročajo rastlinojedci, skoraj v celoti odpravljene (slika 3C). V nasprotju s tem tiha zaznava ET pri rastlinah sETR1, čeprav je skupni učinek na spremembe v metabolizmu rastlinojedcev veliko manjši kot učinek signalizacije JA, zmanjšuje razliko v indeksih Hj in δj med vzbujanji OSM in OSS1 (slika 3D in slika S5). To kaže, da poleg osnovne funkcije prenosa signala JA, prenos signala ET služi tudi kot fino uglaševanje vrstno specifičnega presnovnega odziva rastlinojedcev. V skladu s to funkcijo finega uglaševanja ni bilo spremembe v skupni inducibilnosti metaboloma pri rastlinah sETR1. Po drugi strani pa so rastline irACO v primerjavi z rastlinami sETR1 povzročile podobne skupne amplitude presnovnih sprememb, ki jih povzročajo rastlinojedci, vendar so pokazale bistveno drugačne rezultate Hj in δj med izzivi OSM in OSS1 (slika S5).
Da bi identificirali specializirane metabolite, ki pomembno prispevajo k vrstno specifičnemu odzivu rastlinojedcev, in natančno prilagodili njihovo proizvodnjo prek ET signalov, smo uporabili predhodno razvito strukturno metodo MS/MS. Ta metoda se opira na metodo dvojnega združevanja, da ponovno sklepamo o presnovni družini iz fragmentov MS/MS [normaliziran skalarni produkt (NDP)] in ocene podobnosti na podlagi nevtralne izgube (NL). Nabor podatkov MS/MS, zgrajen z analizo transgenih linij ET, je ustvaril 585 MS/MS (podatkovna datoteka S1), ki smo jih razrešili z združevanjem v sedem glavnih modulov MS/MS (M) (slika 4A). Nekateri od teh modulov so gosto zapakirani s predhodno karakteriziranimi posebnimi metaboliti: na primer, M1, M2, M3, M4 in M7 so bogati z različnimi fenolnimi derivati ​​(M1), flavonoidnimi glikozidi (M2), acilnimi sladkorji (M3 in M4) in 17-HGL-DTG (M7). Poleg tega se izračunajo specifične presnovne informacije (indeks Si) posameznega metabolita v vsakem modulu, njegova porazdelitev Si pa je intuitivno vidna. Skratka, MS/MS spektri, ki kažejo visoko specifičnost za rastlinojedstvo in genotip, so značilni po visokih vrednostih Si, statistika kurtoze pa kaže na porazdelitev dlake na desnem kotu repa. Ena takšna porazdelitev pustega koloida je bila zaznana v M1, kjer je fenol amid pokazal najvišji delež Si (slika 4B). Prej omenjeni rastlinojedski inducibilni 17-HGL-DTG v M7 je pokazal zmerno vrednost Si, kar kaže na zmerno stopnjo diferencialne regulacije med obema tipoma OS. Nasprotno pa je večina konstitutivno proizvedenih specializiranih metabolitov, kot so rutin, CGA in acilni sladkorji, med najnižjimi vrednostmi Si. Da bi bolje raziskali strukturno kompleksnost in porazdelitev Si med posebnimi metaboliti, je bila za vsak modul zgrajena molekularna mreža (slika 4B). Pomembna napoved teorije OD (povzeto na sliki 1B) je, da bi morala reorganizacija posebnih metabolitov po rastlinojedstvu voditi do enosmernih sprememb v metabolitih z visoko obrambno vrednostjo, zlasti s povečanjem njihove specifičnosti (v nasprotju z naključno porazdelitvijo) Obrambni metabolit, ki ga napoveduje teorija MT. Večina fenolnih derivatov, ki se kopičijo v M1, je funkcionalno povezanih z upadom učinkovitosti žuželk (32). Pri primerjavi vrednosti Si v metabolitih M1 med induciranimi listi in sestavnimi listi kontrolnih rastlin EV po 24 urah smo opazili, da ima presnovna specifičnost mnogih metabolitov po rastlinojedstvu pomemben naraščajoči trend (slika 4C). Specifično povečanje vrednosti Si je bilo zaznano le pri obrambnih fenolamidih, pri drugih fenolih in neznanih metabolitih, ki sočasno obstajajo v tem modulu, pa ni bilo zaznanega povečanja vrednosti Si. To je specializiran model, ki je povezan s teorijo OD. Glavne napovedi presnovnih sprememb, ki jih povzročajo rastlinojedci, so skladne. Da bi preverili, ali je to posebnost fenolamidnega spektra povzročil OS-specifični ET, smo narisali indeks metabolita Si in povzročili diferencialno vrednost izražanja med OSM in OSS1 v genotipih EV in sETR1 (slika 4D). Pri sETR1 se je razlika med OSM in OSS1, ki jo povzroča fenamid, močno zmanjšala. Metodo dvojnega združevanja smo uporabili tudi za podatke MS/MS, zbrane v sevih z nezadostno JA, da bi sklepali na glavne MS/MS module, povezane z JA-regulirano presnovno specializacijo (slika S6).
(A) Rezultati združevanja 585 MS/MS na podlagi skupnih fragmentov (podobnost NDP) in skupne nevtralne izgube (podobnost NL) kažejo, da je modul (M) skladen z znano družino spojin ali z neznano ali slabo presnovljeno sestavo presnovkov. Zraven vsakega modula je prikazana specifična porazdelitev presnovkov (MS/MS) (Si). (B) Modularna molekularna mreža: Vozlišča predstavljajo MS/MS in robove, NDP (rdeča) in NL (modra) MS/MS ocene (mejna vrednost, > 0,6). Stopnjevani indeks specifičnosti presnovkov (Si) je obarvan glede na modul (levo) in preslikan v molekularno mrežo (desno). (C) Modul M1 rastline EV v konstitutivnem (kontrola) in induciranem stanju (simulirana rastlinojedka) po 24 urah: diagram molekularne mreže (vrednost Si je velikost vozlišča, obrambni fenolamid je označen z modro barvo). (D) Diagram molekularne mreže M1 spektralne črte sETR1 z oslabljenim zaznavanjem EV in ET: fenolna spojina, predstavljena z zelenim krogom, in pomembna razlika (vrednost P) med obdelavami W + OSM in W + OSS1 kot velikost vozlišča. CP, N-kafeoil-tirozin; CS, N-kafeoil-spermidin; FP, ester N-ferulne kisline-sečna kislina; FS, N-ferulil-spermidin; CoP, N', N “-kumarolil-tirozin; DCS, N', N”-dikafeoil-spermidin; CFS, N', N”-kafeoil, feruloil-spermidin; Lycium barbarum v volčji jagodičevju Son; Nick. O-AS, O-acilni sladkor.
Analizo smo nadalje razširili z enega samega oslabljenega genotipa Nepenthes na naravne populacije, kjer so bile v naravnih populacijah že prej opisane močne intraspecifične spremembe v ravneh JA pri rastlinojedcih in ravneh specifičnih metabolitov (26). Ta nabor podatkov smo uporabili za zajemanje 43 zarodnih plazm. Te zarodne plazme sestavlja 123 vrst rastlin iz N. pallens. Te rastline so bile vzete iz semen, zbranih v različnih avtohtonih habitatih v Utahu, Nevadi, Arizoni in Kaliforniji (slika S7), izračunali smo raznolikost metaboloma (tukaj imenovano raven populacije) (β raznolikost) in specializacijo, ki jo povzroča OSM. V skladu s prejšnjimi študijami smo opazili širok razpon presnovnih sprememb vzdolž osi Hj in δj, kar kaže, da se zarodne plazme bistveno razlikujejo v plastičnosti svojih presnovnih odzivov na rastlinojedce (slika S7). Ta organizacija spominja na prejšnja opažanja o dinamičnem razponu sprememb JA, ki jih povzročajo rastlinojedci, in je ohranila zelo visoko vrednost v eni sami populaciji (26, 36). Z uporabo JA in JA-Ile za testiranje celotne korelacije ravni med Hj in δj smo ugotovili, da obstaja pomembna pozitivna korelacija med JA in indeksom raznolikosti ter specializacije metaboloma β (slika S7). To kaže, da je heterogenost pri indukciji JA, ki jo povzročajo rastlinojedci in je bila zaznana na ravni populacije, lahko posledica ključnih presnovnih polimorfizmov, ki jih povzroča selekcija pri žuželkah rastlinojedcih.
Prejšnje študije so pokazale, da se vrste tobaka zelo razlikujejo po vrsti in relativni odvisnosti od inducirane in konstitutivne presnovne obrambe. Domneva se, da te spremembe v prenosu signalov proti rastlinojedcem in obrambnih zmogljivostih uravnavajo populacijski pritisk žuželk, življenjski cikel rastline in stroški obrambne proizvodnje v niši, kjer določena vrsta raste. Preučevali smo doslednost preoblikovanja metaboloma listov, ki ga povzročajo rastlinojedci šestih vrst Nicotiana, ki izvirajo iz Severne in Južne Amerike. Te vrste so tesno sorodne severnoameriškim Nepenthes, in sicer Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. atenuirana trava, Nicotiana tabacum, linearni tobak, tobak (Nicotiana spegazzinii) in tobak iz tobačnih listov (Nicotiana obtusifolia) (slika 5A) (37). Šest teh vrst, vključno z dobro okarakterizirano vrsto N. please, so enoletne rastline klada petunia, obtusifolia N. pa so trajnice sestrskega klada Trigonophyllae (38). Nato so na teh sedmih vrstah izvedli indukcijo W + W, W + OSM in W + OSS1, da bi preučili presnovno preureditev hranjenja žuželk na ravni vrste.
(A) Filogenetsko drevo bootstrap, ki temelji na največji verjetnosti [za sintezo jedrnega glutamina (38)] in geografski razširjenosti sedmih tesno sorodnih vrst Nicotiana (različne barve) (37). (B) Razpršeni diagram specializirane raznolikosti za presnovne profile sedmih vrst Nicotiana (939 MS/MS; podatkovna datoteka S1). Na ravni vrste je raznolikost metaboloma negativno povezana s stopnjo specializacije. Analiza korelacije na ravni vrste med presnovno raznolikostjo in specializacijo ter kopičenjem JA je prikazana na sliki 2. S9. Barva, različne vrste; trikotnik, W + OSS1; pravokotnik, W + OSM; (C) Dinamika JA in JA-Ile pri Nicotiana je razvrščena glede na amplitudo vzbujanja OS (dvosmerna ANOVA in Tukey HSD po večkratni primerjavi, * P <0,05, ** P <0,01 in * ** Za primerjavo W + OS in W + W, P <0,001). Škatlasti diagram (D) raznolikosti in (E) specializacije vsake vrste po simulaciji rastlinojede in metil JA (MeJA). Zvezdica označuje pomembno razliko med W + OS in W + W ali lanolinom plus W (Lan + W) ali Lan plus MeJA (Lan + MeJa) in kontrolo Lan (dvosmerna analiza variance, ki ji je sledila Tukeyjeva HSD post hoc večkratna primerjava, *P<0,05, **P<0,01 in ***P<0,001).
Z metodo dvojnega grozda smo identificirali 9 modulov 939 MS/MS (podatkovna datoteka S1). Sestava MS/MS, rekonfiguriranih z različnimi tretmaji, se med različnimi moduli in vrstami zelo razlikuje (slika S8). Vizualizacija Hj (tukaj imenovana γ-raznolikost na ravni vrste) in δj razkriva, da se različne vrste združujejo v zelo različne skupine v presnovnem prostoru, kjer je delitev na ravni vrste običajno bolj izrazita kot vzbujanje. Z izjemo N. linear in N. obliquus kažejo širok dinamični razpon indukcijskih učinkov (slika 5B). Nasprotno pa imajo vrste, kot sta N. purpurea in N. obtusifolia, manj očiten presnovni odziv na tretma, vendar je metabolom bolj raznolik. Vrstospecifična porazdelitev induciranega presnovnega odziva je povzročila pomembno negativno korelacijo med specializacijo in gama raznolikostjo (PCC = -0,46, P = 4,9 × 10-8). Spremembe ravni JA, ki jih povzročajo OS, so pozitivno povezane s specializacijo metaboloma in negativno s presnovno gama raznolikostjo, ki jo kaže posamezna vrsta (slika 5B in slika S9). Omeniti velja, da so vrste, ki jih na sliki 5C pogovorno imenujemo vrste z »odzivom na signal«, kot so ogorčice Nepenthes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute in Nepenthes attenuated, povzročile pomembne znake po 30 minutah. Nedavni izbruhi JA in JA-Ile, specifični za OS, medtem ko druge bakterije, imenovane »neodzivne na signal«, kot so Nepenthes mills, Nepenthes powdery in N. obtusifolia, kažejo le indukcijo JA-Ile Edge brez kakršne koli specifičnosti za OS (slika 5C). Na presnovni ravni so, kot je omenjeno zgoraj, pri oslabljenih Nepenthesih signalno odzivne snovi pokazale specifičnost za OS in znatno povečale δj, hkrati pa zmanjšale Hj. Ta za OS specifičen učinek primarnega delovanja ni bil zaznan pri vrstah, razvrščenih kot signalno nereaktivne vrste (slika 5, D in E). Presnovki, specifični za OS, se pogosteje delijo med vrstami, ki se odzivajo na signale, in ti signalni grozdi se združujejo z vrstami s šibkejšimi signalnimi odzivi, medtem ko vrste s šibkejšimi signalnimi odzivi kažejo manjšo medsebojno odvisnost (slika S8). Ta rezultat kaže, da sta indukcija JA, specifična za OS, in rekonfiguracija metaboloma, specifična za OS, povezani na ravni vrste.
Nato smo za obdelavo rastlin uporabili lanolinsko pasto, ki vsebuje metil JA (MeJA), da bi raziskali, ali so ti načini spajanja omejeni z razpoložljivostjo JA, ki ga nanese eksogeni JA, ki bo v citoplazmi rastlin. Hitra deesterifikacija je JA. Ugotovili smo enak trend postopne spremembe od vrst, ki se odzivajo na signale, do vrst, ki se ne odzivajo na signale, ki jo povzroča neprekinjena oskrba z JA (slika 5, D in E). Skratka, obdelava z MeJA je močno reprogramirala metabolome linearnih ogorčic, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens in N. mikimotoi, kar je povzročilo znatno povečanje δj in zmanjšanje Hj. Le N. purpurea je pokazala povečanje δj, ne pa tudi Hj. N. obtusifolia, za katero je bilo že prej dokazano, da kopiči izjemno nizke ravni JA, se prav tako slabo odziva na obdelavo z MeJA v smislu rekonfiguracije metaboloma. Ti rezultati kažejo, da je proizvodnja JA ali prenos signala fiziološko omejena pri vrstah, ki se ne odzivajo na signale. Da bi preizkusili to hipotezo, smo preučevali štiri vrste (N. pallens, N. mills, N. pink in N. microphylla), ki jih povzročajo transkriptomi W + W, W + OSM in W + OSS1 (39). V skladu z vzorcem preoblikovanja metaboloma so vrste v transkriptomskem prostoru dobro ločene, med katerimi je N. attenuated pokazal najvišji RDPI, induciran z OS, medtem ko je imel N. gracilis najnižjega (slika 6A). Vendar pa je bilo ugotovljeno, da je bila transkriptomska raznolikost, ki jo je povzročil N. oblonga, najnižja med štirimi vrstami, v nasprotju z najvišjo metabonomsko raznolikostjo N. oblonga, ki je bila predhodno prikazana pri sedmih vrstah. Prejšnje študije so pokazale, da niz genov, povezanih z zgodnjimi obrambnimi signali, vključno s signali JA, pojasnjuje specifičnost zgodnjih obrambnih odzivov, ki jih povzročajo elicitorji, povezani z rastlinojedci, pri vrstah Nicotiana (39). Primerjava signalnih poti JA med temi štirimi vrstami je razkrila zanimiv vzorec (slika 6B). Večina genov v tej poti, kot so AOC, OPR3, ACX in COI1, je pri teh štirih vrstah pokazala relativno visoke ravni indukcije. Vendar pa ključni gen, JAR4, pretvarja JA v njegovo biološko aktivno obliko akumuliranih transkriptov JA-Ile, njegova raven transkripcije pa je zelo nizka, zlasti pri N. mills, Nepenthes pieris in N. microphylla. Poleg tega pri N. bifidum ni bil zaznan le transkript drugega gena AOS. Te spremembe v izražanju genov so lahko odgovorne za ekstremne fenotipe, ki jih povzroča nizka produkcija JA pri signalno anergičnih vrstah in indukcija N. gracilis.
(A) Analiza informacijske teorije reprogramiranja zgodnjih transkripcijskih odzivov štirih tesno sorodnih vrst tobaka, vzorčenih 30 minut po indukciji rastlinojedstva. RDPI se izračuna s primerjavo listov, ki jih je induciral rastlinojed OS, s kontrolno rano. Barve označujejo različne vrste, simboli pa različne metode obdelave. (B) Analiza izražanja genov v signalnih poteh JA med štirimi vrstami. Poenostavljena pot JA je prikazana poleg škatlastega diagrama. Različne barve označujejo različne metode obdelave. Zvezdica označuje, da obstaja pomembna razlika med obdelavo W + OS in kontrolno W + W (za Studentov t-test za parne razlike, *P<0,05, **P<0,01 in ***P<0,001). OPDA, 12-oksofitodienojska kislina; OPC-8: 0,3-okso-2(2′(Z)-pentenil)-ciklopentan-1-oktanojska kislina.
V zadnjem delu smo preučevali, kako je lahko preoblikovanje metaboloma različnih rastlinskih vrst, specifično za posamezne žuželke, odporno na rastlinojedce. Prejšnje raziskave so se osredotočile na rod Nicotiana. Njihova odpornost na Ms in ličinke se zelo razlikuje (40). Tukaj smo preučevali povezavo med tem modelom in njihovo presnovno plastičnostjo. Z uporabo zgoraj omenjenih štirih vrst tobaka in testiranjem korelacije med raznolikostjo in specializacijo metaboloma, ki ga povzročajo rastlinojedci, ter odpornostjo rastlin na Ms in Sl smo ugotovili, da so odpornost, raznolikost in specializacija na generalistični Sl vse pozitivno korelirane, medtem ko je korelacija med odpornostjo na strokovne dame in specializacijo šibka, korelacija z raznolikostjo pa ni pomembna (slika S10). Glede odpornosti na S1 sta imela tako oslabljena N. chinensis kot N. gracilis, za katera je bilo predhodno dokazano, da kažeta tako raven prenosa signala JA kot plastičnost metaboloma, zelo različne odzive na indukcijo rastlinojedcev in sta pokazala tudi podobno visoko odpornost. Spol.
V zadnjih šestdesetih letih je teorija obrambe rastlin zagotovila teoretični okvir, na podlagi katerega so raziskovalci napovedali precejšnje število evolucij in funkcij specializiranih rastlinskih metabolitov. Večina teh teorij ne sledi običajnemu postopku močnih sklepov (41). Predlagajo ključne napovedi (3) na isti ravni analize. Ko testiranje ključnih napovedi omogoča analizo specifičnih teorij, bo to omogočilo, da se nekatere teorije podprejo, druge pa zavrnejo (42). Namesto tega nova teorija podaja napovedi na različnih ravneh analize in doda novo plast opisnih premislekov (42). Vendar pa je mogoče dve teoriji, predlagani na funkcionalni ravni, MT in OD, enostavno razložiti kot pomembni napovedi specializiranih presnovnih sprememb, ki jih povzročajo rastlinojedci: teorija OD meni, da so spremembe v specializiranem presnovnem "prostoru" zelo usmerjene. Teorija MT meni, da bodo te spremembe neusmerjene in naključno locirane v presnovnem prostoru ter da imajo običajno metabolite z visoko obrambno vrednostjo. Prejšnje preiskave napovedi OD in MT so bile preizkušene z ozkim naborom a priori "obrambnih" spojin. Ti testi, osredotočeni na metabolite, onemogočajo analizo obsega in poti rekonfiguracije metaboloma med herbivorijo in ne omogočajo testiranja znotraj doslednega statističnega okvira, ki bi zahteval ključne napovedi, ki jih je mogoče obravnavati kot celoto. Kvantificirajte spremembe v rastlinskem metabolomu. Tukaj smo uporabili inovativno tehnologijo v metabolomiki, ki temelji na računalniški MS, in izvedli dekonvolucijsko MS analizo v splošni valuti deskriptorjev informacijske teorije, da bi preizkusili razliko med obema, predlaganima na globalni ravni metabolomike. Ključna napoved te teorije. Informacijska teorija se uporablja na številnih področjih, zlasti v kontekstu raziskav biotske raznovrstnosti in pretoka hranil (43). Vendar pa je, kolikor vemo, to prva uporaba, ki se uporablja za opis metabolnega informacijskega prostora rastlin in reševanje ekoloških problemov, povezanih z začasnimi presnovnimi spremembami kot odziv na okoljske znake. Zlasti sposobnost te metode je v njeni sposobnosti primerjave vzorcev znotraj in med rastlinskimi vrstami, da bi preučili, kako so se rastlinojedci razvili iz različnih vrst v medvrstne makroevolucijske vzorce na različnih ravneh evolucije. Presnova.
Analiza glavnih komponent (PCA) pretvori multivariatni nabor podatkov v prostor za zmanjšanje dimenzionalnosti, tako da je mogoče razložiti glavni trend podatkov, zato se običajno uporablja kot raziskovalna tehnika za razčlenjevanje nabora podatkov, kot je dekonvolucijski metabolom. Vendar pa zmanjšanje dimenzionalnosti izgubi del informacijske vsebine v naboru podatkov in PCA ne more zagotoviti kvantitativnih informacij o značilnostih, ki so še posebej pomembne za ekološko teorijo, kot so: kako rastlinojedci preoblikujejo raznolikost na specializiranih področjih (na primer bogastvo, porazdelitev) in številčnost) metaboliti? Kateri metaboliti so napovedovalci induciranega stanja določenega rastlinojedca? Z vidika specifičnosti, raznolikosti in inducibilnosti se informacijska vsebina profila listno specifičnih metabolitov razgradi in ugotovi se, da lahko prehranjevanje rastlinojedcev aktivira specifični metabolizem. Nepričakovano smo opazili, da se, kot je opisano v uporabljenih kazalnikih informacijske teorije, nastala presnovna situacija po napadih obeh rastlinojedcev (nočno hranjenega generalista Sl) in strokovnjaka za razhudnika Ms. močno prekriva. Čeprav se njuno prehranjevalno vedenje in koncentracija bistveno razlikujeta. Iniciator konjugata maščobnih kislin in aminokislin (FAC) v OS (31). Z uporabo rastlinojede OS za zdravljenje standardiziranih vbodnih ran je simulirano zdravljenje z rastlinojedo živaljo pokazalo podoben trend. Ta standardiziran postopek za simulacijo odziva rastlin na napade rastlinojede živali odpravlja moteče dejavnike, ki jih povzročajo spremembe v prehranjevalnih navadah rastlinojede živali, ki vodijo do različnih stopenj poškodb v različnih obdobjih (34). FAC, ki je znan kot glavni vzrok za OSM, zmanjša odziv JAS in drugih rastlinskih hormonov v OSS1, medtem ko OSS1 zmanjša več stokrat (31). Vendar pa je OSS1 povzročil podobne ravni kopičenja JA kot OSM. Predhodno je bilo dokazano, da je odziv JA v oslabljenih Nepenthesih zelo občutljiv na OSM, kjer lahko FAC ohrani svojo aktivnost, tudi če je razredčen z vodo v razmerju 1:1000 (44). Zato je v primerjavi z OSM, čeprav je FAC v OSS1 zelo nizek, zadosten za sprožitev zadostnega izbruha JA. Prejšnje študije so pokazale, da se lahko porinom podobni proteini (45) in oligosaharidi (46) uporabijo kot molekularni namigi za sprožitev obrambnih odzivov rastlin v OSS1. Vendar pa še vedno ni jasno, ali so ti elicitorji v OSS1 odgovorni za kopičenje JA, opaženo v trenutni študiji.
Čeprav obstaja malo študij, ki opisujejo različne presnovne prstne odtise, ki jih povzroča uporaba različnih rastlinojedcev ali eksogene JA ali SA (salicilne kisline) (47), nihče ni motil vrstno specifične motnje v rastlinski mreži in njenih učinkov na specifične osebne podatke. Celoten vpliv presnove se sistematično preučuje. Ta analiza je nadalje potrdila, da povezava notranjega hormonskega omrežja z drugimi rastlinskimi hormoni, ki niso JA, oblikuje specifičnost presnovne reorganizacije, ki jo povzročajo rastlinojedci. Zlasti smo ugotovili, da je bil ET, ki ga povzroča OSM, bistveno večji kot tisti, ki ga povzroča OSS1. Ta način je skladen z večjo vsebnostjo FAC v OSM, kar je nujen in zadosten pogoj za sprožitev izbruha ET (48). V kontekstu interakcije med rastlinami in rastlinojedci je signalna funkcija ET na dinamiko rastlinsko specifičnih presnovkov še vedno sporadična in cilja le na eno samo skupino spojin. Poleg tega je večina študij uporabila eksogeno uporabo ET ali njegovih predhodnikov ali različnih inhibitorjev za preučevanje regulacije ET, med katerimi bodo te eksogene kemične aplikacije povzročile številne nespecifične stranske učinke. Kolikor vemo, ta študija predstavlja prvo obsežno sistematično preučevanje vloge ET pri uporabi ET za proizvodnjo in zaznavanje okvarjenih transgenih rastlin za usklajevanje dinamike rastlinskega metaboloma. Indukcija ET, specifična za rastlinojedce, lahko na koncu modulira odziv metaboloma. Najpomembnejša je transgena manipulacija genov biosinteze (ACO) in zaznavanja (ETR1), ki je razkrila rastlinojedce specifično de novo kopičenje fenolamidov. Predhodno je bilo dokazano, da lahko ET natančno uravnava kopičenje nikotina, ki ga povzroča JA, z uravnavanjem putrescin N-metiltransferaze (49). Vendar pa z mehanskega vidika ni jasno, kako ET natančno uravnava indukcijo fenamida. Poleg funkcije prenosa signala ET se lahko presnovni tok preusmeri tudi na S-adenozil-1-metionin za uravnavanje naložbe v poliaminofenol amide. S-adenozil-1-metionin je ET in pogosti intermediat biosintetske poti poliamina. Mehanizem, s katerim signal ET uravnava raven fenolamida, zahteva nadaljnje raziskave.
Dolgo časa zaradi velikega števila posebnih metabolitov neznane strukture intenzivna pozornost, posvečena specifičnim metabolnim kategorijam, ni mogla strogo oceniti časovnih sprememb metabolne raznolikosti po bioloških interakcijah. Trenutno je na podlagi analize teorije informacij glavni rezultat pridobivanja spektra MS/MS na podlagi nepristranskih metabolitov ta, da rastlinojedci, ki jedo ali simulirajo rastlinojedce, še naprej zmanjšujejo celotno metabolno raznolikost metaboloma listov, hkrati pa povečujejo njegovo stopnjo specializacije. To začasno povečanje specifičnosti metaboloma, ki ga povzročajo rastlinojedci, je povezano s sinergističnim povečanjem specifičnosti transkriptoma. Značilnost, ki najbolj prispeva k tej večji specializaciji metaboloma (z višjo vrednostjo Si), je posebni metabolit s prej okarakterizirano rastlinojedo funkcijo. Ta model je skladen z napovedjo teorije OD, vendar napoved MT, povezana z naključnostjo reprogramiranja metaboloma, ni skladna. Vendar pa so ti podatki skladni tudi z napovedjo mešanega modela (najboljši MT; slika 1B), ker lahko drugi neokarakterizirani metaboliti z neznanimi obrambnimi funkcijami še vedno sledijo naključni porazdelitvi Si.
Pomemben vzorec, ki ga je ta raziskava dodatno zajela, je, da so od mikroevolucijske ravni (posamezna rastlina in populacija tobaka) do večje evolucijske lestvice (tesno sorodne vrste tobaka) različne ravni evolucijske organizacije v "najboljši obrambi". Obstajajo znatne razlike v sposobnostih rastlinojedcev. Moore in sod. (20) ter Kessler in Kalske (1) so neodvisno predlagali pretvorbo treh funkcionalnih ravni biotske raznovrstnosti, ki jih je prvotno razlikoval Whittaker (50), v konstitutivne in inducirane časovne spremembe kemijske raznovrstnosti; niti ta avtorja nista povzela. Postopki za obsežno zbiranje podatkov o metabolomih tudi ne opisujejo, kako izračunati presnovno raznovrstnost iz teh podatkov. V tej študiji bodo manjše prilagoditve Whittakerjeve funkcionalne klasifikacije upoštevale α-presnovno raznovrstnost kot raznovrstnost MS/MS spektrov v dani rastlini, β-presnovno raznovrstnost pa kot osnovni intraspecifični metabolizem skupine populacij, γ-presnovna raznovrstnost pa bo razširitev analize podobnih vrst.
Signal JA je bistvenega pomena za širok spekter presnovnih odzivov rastlinojedcev. Vendar pa primanjkuje strogega kvantitativnega testiranja prispevka intraspecifične regulacije biosinteze JA k raznolikosti metaboloma in ali je signal JA splošno mesto za stresno povzročeno presnovno diverzifikacijo na višji makroevolucijski ravni, je še vedno nejasno. Opazili smo, da rastlinojeda narava rastlinojedca Nepenthes povzroča specializacijo metaboloma in da je variacija specializacije metaboloma znotraj populacije vrst Nicotiana in med tesno sorodnimi vrstami Nicotiana sistematično pozitivno povezana z JA signalizacijo. Poleg tega se ob oslabitvi signala JA presnovna specifičnost, ki jo povzroči rastlinojedec enega genotipa, izniči (slika 3, C in E). Ker so spremembe presnovnega spektra naravno oslabljenih populacij Nepenthes večinoma kvantitativne, so lahko spremembe v presnovni raznolikosti in specifičnosti β v tej analizi v veliki meri posledica močnega vzbujanja kategorij spojin, bogatih z metaboliti. Ti razredi spojin prevladujejo v delu profila metaboloma in vodijo do pozitivne korelacije s signali JA.
Ker se biokemični mehanizmi vrst tobaka, ki so mu tesno sorodne, zelo razlikujejo, so metaboliti specifično identificirani v kvalitativnem vidiku, zato je bolj analitičen. Obdelava zajetega metabolnega profila s strani informacijske teorije razkriva, da rastlinojeda indukcija poslabša kompromis med metabolno gama raznolikostjo in specializacijo. Signal JA ima pri tem kompromisu osrednjo vlogo. Povečanje specializacije metaboloma je skladno z glavno napovedjo OD in je pozitivno korelirano s signalom JA, medtem ko je signal JA negativno koreliran s presnovno gama raznolikostjo. Ti modeli kažejo, da je zmogljivost OD rastlin v glavnem odvisna od plastičnosti JA, bodisi na mikroevolucijski bodisi na večji evolucijski ravni. Eksogeni poskusi uporabe JA, ki zaobidejo napake v biosintezi JA, nadalje razkrivajo, da lahko tesno sorodne vrste tobaka ločimo na vrste, ki se odzivajo na signale, in vrste, ki se ne odzivajo na signale, tako kot njihov način JA in plastičnost metaboloma, ki jo povzročajo rastlinojede živali. Vrste, ki se ne odzivajo na signale, se ne morejo odzvati zaradi nezmožnosti proizvodnje endogenega JA in so zato podvržene fiziološkim omejitvam. To lahko povzročijo mutacije v nekaterih ključnih genih v signalni poti JA (AOS in JAR4 pri N. crescens). Ta rezultat poudarja, da so ti medvrstni makroevolucijski vzorci lahko predvsem posledica sprememb v notranjem zaznavanju in odzivnosti hormonov.
Poleg interakcije med rastlinami in rastlinojedci je raziskovanje presnovne raznolikosti povezano z vsemi pomembnimi teoretičnimi dosežki v raziskavah biološke prilagoditve okolju in evolucije kompleksnih fenotipskih lastnosti. Z naraščajočo količino podatkov, pridobljenih s sodobnimi instrumenti MS, lahko testiranje hipotez o presnovni raznolikosti zdaj preseže individualne/kategorijske razlike v presnovkih in izvede globalno analizo, ki razkrije nepričakovane vzorce. V procesu obsežne analize je pomembna metafora ideja o zasnovi smiselnih zemljevidov, ki jih je mogoče uporabiti za raziskovanje podatkov. Zato je pomemben rezultat trenutne kombinacije nepristranske MS/MS metabolomike in teorije informacij ta, da zagotavlja preprosto metriko, ki jo je mogoče uporabiti za izdelavo zemljevidov za brskanje po presnovni raznolikosti na različnih taksonomskih lestvicah. To je osnovna zahteva te metode. Preučevanje mikro/makro evolucije in ekologije združb.
Na makroevolucijski ravni je jedro teorije koevolucije rastlin in žuželk Ehrlicha in Ravena (51) napoved, da je variacija medvrstne presnovne raznolikosti vzrok za diverzifikacijo rastlinskih linij. Vendar pa je bila ta hipoteza v petdesetih letih od objave tega temeljnega dela le redko preizkušena (52). To je v veliki meri posledica filogenetskih značilnosti primerljivih presnovnih značilnosti v rastlinskih linijah na dolge razdalje. Redkost se lahko uporabi za zasidranje metod analize ciljev. Trenutni potek dela MS/MS, ki ga obdeluje informacijska teorija, kvantificira strukturno podobnost neznanih metabolitov MS/MS (brez predhodne izbire metabolitov) in pretvori te MS/MS v niz MS/MS, tako da se v profesionalnem metabolizmu ti makroevolucijski modeli primerjajo v klasifikacijski lestvici. Preprosti statistični kazalniki. Postopek je podoben filogenetski analizi, ki lahko uporabi poravnavo zaporedja za kvantificiranje stopnje diverzifikacije ali evolucije znakov brez predhodne napovedi.
Na biokemični ravni hipoteza presejanja Firna in Jonesa (53) kaže, da se presnovna raznolikost ohranja na različnih ravneh, da se zagotovijo surovine za izvajanje bioloških aktivnosti prej nepovezanih ali substituiranih metabolitov. Metode teorije informacij zagotavljajo okvir, v katerem je mogoče te evolucijske prehode, specifične za metabolite, ki se pojavijo med specializacijo metabolitov, kvantificirati kot del predlaganega evolucijskega procesa presejanja: biološko aktivna prilagoditev iz nizke specifičnosti v visoko specifičnost. Inhibirani metaboliti danega okolja.
Skratka, v zgodnjih dneh molekularne biologije so bile razvite pomembne teorije o obrambi rastlin, deduktivne metode, ki temeljijo na hipotezah, pa veljajo za edino sredstvo znanstvenega napredka. To je v veliki meri posledica tehničnih omejitev merjenja celotnega metaboloma. Čeprav so metode, ki temeljijo na hipotezah, še posebej uporabne pri izbiri drugih vzročnih mehanizmov, je njihova sposobnost napredovanja našega razumevanja biokemijskih omrežij bolj omejena kot računalniške metode, ki so trenutno na voljo v sodobni podatkovno intenzivni znanosti. Zato teorije, ki jih ni mogoče napovedati, daleč presegajo obseg razpoložljivih podatkov, zato hipotetičnega formule/testnega cikla napredka na raziskovalnem področju ni mogoče odpraviti (4). Predvidevamo, da lahko računalniški potek dela metabolomike, predstavljen tukaj, ponovno obudi zanimanje za nedavna (kako) in končna (zakaj) vprašanja presnovne raznolikosti ter prispeva k novi dobi teoretično vodene podatkovne znanosti. Doba je ponovno preučila pomembne teorije, ki so navdihnile prejšnje generacije.
Neposredno hranjenje rastlinojedcev se izvaja tako, da se ličinka drugega stadija ali ličinka Sl vzgoji na enem samem listu bledo obarvanega vrča ene same cvetoče rastline vrtnice, z 10 rastlinskimi ponovitvami na rastlino. Ličinke žuželk so bile vpete s sponkami, preostalo listno tkivo pa je bilo zbrano 24 in 72 ur po okužbi in hitro zamrznjeno, presnovki pa so bili ekstrahirani.
Simulirajte zdravljenje rastlinojedcev na zelo sinhroniziran način. Metoda je, da s pomočjo kolesc za vzorce iz blaga prebodete tri vrste trnov na vsaki strani srednjega rebra treh popolnoma razvitih listov rastline med rastno fazo tkaninskega girlanda in takoj nanesete razredčeno Ms v razmerju 1:5. Ali pa z rokavicami vstavite S1 OS v vbodno rano. Poberite in obdelajte list, kot je opisano zgoraj. Za ekstrakcijo primarnih metabolitov in rastlinskih hormonov uporabite prej opisano metodo (54).
Za eksogeno uporabo JA se trije pecljasti listi vsake od šestih cvetočih rastlin vrtnic vsake vrste obdelajo z 20 μl lanolinske paste, ki vsebuje 150 μg MeJA (Lan + MeJA), in 20 μl lanolina ter obdelavo ran (Lan + W) ali pa se kot kontrola uporabi 20 μl čistega lanolina. Listi so bili pobrani 72 ur po obdelavi, zamrznjeni v tekočem dušiku in shranjeni pri -80 °C do uporabe.
V naši raziskovalni skupini smo identificirali štiri transgene linije JA in ET, in sicer irAOC (36), irCOI1 (55), irACO in sETR1 (48). Pri irAOC je bilo močno znižanje ravni JA in JA-Ile, medtem ko irCOI1 ni bil občutljiv na JA. V primerjavi z EV se je kopičenje JA-Ile povečalo. Podobno bo irACO zmanjšal proizvodnjo ET, v primerjavi z EV pa bo sETR1, ki je neobčutljiv na ET, povečal proizvodnjo ET.
Za neinvazivno merjenje ET se uporablja fotoakustični laserski spektrometer (senzor ET v realnem času Sensor Sense ETD-300). Takoj po obdelavi je bila polovica listov odrezana in prenesena v 4-mililitrsko zaprto stekleno vialo, prostor nad tekočino pa se je pustil kopičiti v 5 urah. Med meritvijo je bila vsaka viala 8 minut splakovana s tokom 2 litra/uro čistega zraka, ki je predhodno prešel skozi katalizator, ki ga je zagotovil Sensor Sense za odstranitev CO2 in vode.
Podatki mikromrež so bili prvotno objavljeni v (35) in shranjeni v celoviti bazi podatkov o izražanju genov Nacionalnega centra za biotehnološke informacije (NCBI) (pristopna številka GSE30287). Za to študijo so bili izvlečeni podatki, ki ustrezajo listom, ki jih je povzročila obdelava z W + OSM, in nepoškodovanemu kontrolnemu vzorcu. Surova intenzivnost je log2. Pred statistično analizo je bila izhodiščna vrednost pretvorjena in normalizirana na 75. percentil z uporabo programskega paketa R.
Izvirni podatki sekvenciranja RNA (RNA-seq) vrst Nicotiana so bili pridobljeni iz arhiva kratkih odčitkov NCBI (SRA), številka projekta je PRJNA301787, o katerem so poročali Zhou in sod. (39), in nadaljevanje poteka, kot je opisano v (56). Surovi podatki, obdelani z W + W, W + OSM in W + OSS1, ki ustrezajo vrstam Nicotiana, so bili izbrani za analizo v tej študiji in obdelani na naslednji način: Najprej so bili surovi odčitki sekvenciranja RNA pretvorjeni v format FASTQ. HISAT2 pretvori FASTQ v SAM, SAMtools pa pretvori datoteke SAM v razvrščene datoteke BAM. Za izračun izražanja genov se uporablja StringTie, njegova metoda izražanja pa temelji na številu fragmentov na tisoč baznih fragmentov na milijon sekvenciranih transkripcijskih fragmentov.
Kromatografska kolona Acclaim (150 mm x 2,1 mm; velikost delcev 2,2 μm), uporabljena v analizi, in zaščitna kolona 4 mm x 4 mm sta izdelani iz istega materiala. V sistemu Dionex UltiMate 3000 za ultra visokozmogljivo tekočinsko kromatografijo (UHPLC) se uporablja naslednji binarni gradient: 0 do 0,5 minute, izokratski 90 % A [deionizirana voda, 0,1 % (v/v) acetonitrila in 0,05 % mravljinčne kisline], 10 % B (acetonitril in 0,05 % mravljinčne kisline); 0,5 do 23,5 minute, gradientna faza je 10 % A oziroma 90 % B; 23,5 do 25 minut, izokratski 10 % A in 90 % B. Pretok je 400 μl/min. Za vse MS analize vbrizgajte eluent kolone v kvadrupolni analizator in analizator časa preleta (qTOF), opremljen z virom elektrospreja, ki deluje v načinu pozitivne ionizacije (kapilarna napetost 4500 V; izhod kapile 130 V; temperatura sušenja 200 °C; pretok zraka med sušenjem 10 litrov/min).
Izvedite analizo fragmentov MS/MS (v nadaljevanju MS/MS), ki so nepomembni ali jih ni mogoče razlikovati od podatkov, da pridobite strukturne informacije o celotnem zaznavnem metabolnem profilu. Koncept nediskriminatorne metode MS/MS temelji na dejstvu, da ima kvadrupol zelo veliko okno izolacije mase [zato vse signale razmerja mase in naboja (m/z) obravnavajte kot fragmente]. Ker instrument Impact II ni mogel ustvariti nagiba CE, je bilo izvedenih več neodvisnih analiz z uporabo povečanih vrednosti energije trkov (CE) zaradi disociacije. Skratka, najprej analizirajte vzorec z UHPLC-elektrosprejno ionizacijo/qTOF-MS z uporabo načina enojne masne spektrometrije (pogoji nizke fragmentacije, ki jih ustvari fragmentacija v viru), skeniranje od m/z 50 do 1500 s frekvenco ponavljanja 5 Hz. Za analizo MS/MS uporabite dušik kot plin za trke in izvedite neodvisne meritve pri naslednjih štirih različnih napetostih disociacije, ki jih povzročijo trki: 20, 30, 40 in 50 eV. Med celotnim postopkom merjenja ima kvadrupol največje okno izolacije mase, od m/z 50 do 1500. Ko je eksperiment m/z sprednjega telesa in širine izolacije nastavljen na 200, se območje mase samodejno aktivira z operacijsko programsko opremo instrumenta in 0 Da. Skenirajte za fragmente mase kot v načinu ene same mase. Za kalibracijo mase uporabite natrijev format (50 ml izopropanola, 200 μl mravljinčne kisline in 1 ml 1M vodne raztopine NaOH). Z uporabo Brukerjevega algoritma za visoko natančno kalibracijo se podatkovna datoteka kalibrira po izvedbi povprečnega spektra v danem časovnem obdobju. Za pretvorbo surovih podatkovnih datotek v format NetCDF uporabite funkcijo izvoza programske opreme Data Analysis v4.0 (Brook Dalton, Bremen, Nemčija). Nabor podatkov MS/MS je bil shranjen v odprti metabolomski podatkovni bazi MetaboLights (www.ebi.ac.uk) z dostopno številko MTBLS1471.
Sestavljanje MS/MS je mogoče izvesti s korelacijsko analizo med signali kakovosti MS1 in MS/MS za nizko in visoko energijo trka ter na novo implementiranimi pravili. Za izvedbo korelacijske analize porazdelitve predhodnika v produkt se uporablja skripta R, za implementacijo pravil pa skripta C# (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline).
Da bi zmanjšali lažno pozitivne napake, ki jih povzroča šum ozadja, in lažno korelacijo, ki jo povzroči zaznavanje določenih značilnosti m/z le v nekaj vzorcih, uporabljamo funkcijo »zapolnjen vrh« paketa R XCMS (za korekcijo šuma ozadja), ki jo je treba uporabiti za nadomestitev intenzivnosti »NA« (nezaznan vrh). Ko se uporabi funkcija zapolnjenega vrha, je v naboru podatkov še vedno veliko vrednosti intenzivnosti »0«, ki bodo vplivale na izračun korelacije. Nato primerjamo rezultate obdelave podatkov, pridobljene z uporabo funkcije zapolnjenega vrha in brez uporabe funkcije zapolnjenega vrha, in izračunamo vrednost šuma ozadja na podlagi povprečne popravljene ocenjene vrednosti, nato pa te vrednosti intenzivnosti 0 nadomestimo z izračunano vrednostjo ozadja. Upoštevali smo tudi le značilnosti, katerih intenzivnost je trikrat presegla vrednost ozadja, in jih obravnavali kot »prave vrhove«. Za izračune PCC se upoštevajo samo signali m/z predhodnika vzorca (MS1) in naborov podatkov fragmentov z vsaj osmimi pravimi vrhovi.
Če je intenzivnost značilnosti kakovosti predhodnika v celotnem vzorcu pomembno povezana z zmanjšano intenzivnostjo iste značilnosti kakovosti, ki je izpostavljena nizki ali visoki energiji trka, in če značilnost s programom CAMERA ni označena kot izotopski vrh, jo je mogoče podrobneje definirati. Nato se z izračunom vseh možnih parov predhodnik-produkt v 3 sekundah (ocenjeno okno retencijskega časa za retencijo vrha) izvede korelacijska analiza. Le če je vrednost m/z nižja od vrednosti predhodnika in se fragmentacija MS/MS pojavi na istem mestu vzorca v naboru podatkov kot predhodnik, iz katerega izhaja, se šteje za fragment.
Na podlagi teh dveh preprostih pravil izključimo določene fragmente z vrednostmi m/z, večjimi od m/z identificiranega predhodnika, in na podlagi položaja vzorca, kjer se predhodnik pojavi, in določenega fragmenta. Možno je tudi izbrati kakovostne značilnosti, ki jih ustvari veliko fragmentov v izvoru, ustvarjenih v načinu MS1, kot kandidatne predhodnike, s čimer ustvarimo redundantne spojine MS/MS. Da bi zmanjšali to redundanco podatkov, bomo združili spektre, če podobnost NDP spektrov presega 0,6 in pripadajo kromatogramu "pcgroup", ki ga označuje CAMERA. Na koncu združimo vse štiri rezultate CE, povezane s predhodnikom in fragmenti, v končni dekonvoluirani sestavljeni spekter tako, da med vsemi kandidatnimi vrhovi z enako vrednostjo m/z pri različnih energijah trka izberemo vrh najvišje intenzivnosti. Nadaljnji koraki obdelave temeljijo na konceptu sestavljenega spektra in upoštevajo različne pogoje CE, potrebne za maksimiranje verjetnosti fragmentacije, saj je nekatere fragmente mogoče zaznati le pri določeni energiji trka.
Za izračun inducibilnosti metabolnega profila je bil uporabljen RDPI (30). Raznolikost metabolnega spektra (indeks Hj) je izpeljana iz številčnosti predhodnikov MS/MS z uporabo Shannonove entropije frekvenčne porazdelitve MS/MS z uporabo naslednje enačbe, ki jo opisujejo Martínez in sod. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij), kjer Pij ustreza relativni frekvenci i-te MS/MS v j-tem vzorcu (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2,…, m)t).
Presnovna specifičnost (indeks Si) je definirana kot identiteta izražanja danega MS/MS v odnosu do frekvence med obravnavanimi vzorci. Specifičnost MS/MS se izračuna kot Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Za merjenje metabolomsko specifičnega indeksa δj vsakega j-tega vzorca in povprečja specifičnosti MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi uporabite naslednjo formulo
Spektri MS/MS so poravnani v parih, podobnost pa se izračuna na podlagi obeh ocen. Najprej se z uporabo standardne metode NDP (znane tudi kot metoda kosinusne korelacije) z naslednjo enačbo oceni podobnost segmentov med spektri: NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2, kjer sta S1 in S2. Za spekter 1 in spekter 2, kot tudi za WS1, i in WS2, i predstavlja težo na podlagi intenzivnosti vrhov, pri čemer je razlika i-tega skupnega vrha med obema spektroma manjša od 0,01 Da. Utež se izračuna na naslednji način: W = [intenzivnost vrhov] m [kakovost] n, m = 0,5, n = 2, kot predlaga MassBank.
Izvedena je bila druga metoda točkovanja, ki je vključevala analizo skupne NL med MS/MS. V ta namen smo uporabili 52 seznamov NL, ki se pogosto pojavljajo med procesom fragmentacije MS, skupaj in bolj specifično NL (podatkovna datoteka S1), ki je bila predhodno označena za MS/MS spekter sekundarnih metabolitov oslabljene vrste Nepenthes (9, 26). Za vsak MS/MS ustvarite binarni vektor 1 in 0, ki ustreza trenutnemu oziroma neobstoječemu NL. Na podlagi podobnosti evklidske razdalje se izračuna rezultat podobnosti NL za vsak par binarnih NL vektorjev.
Za izvedbo dvojnega združevanja v skupine smo uporabili paket R DiffCoEx, ki temelji na razširitvi analize utežene genske koekspresije (WGCNA). Z uporabo matrik točkovanja NDP in NL spektrov MS/MS smo z DiffCoEx izračunali primerjalno korelacijsko matriko. Binarno združevanje v skupine se izvede tako, da se parameter »cutreeDynamic« nastavi na method = »hybrid«, cutHeight = 0,9999, deepSplit = T in minClusterSize = 10. Izvorno kodo R za DiffCoEx so iz dodatne datoteke 1 prenesli Tesson in sod. (57); potreben programski paket R za WGCNA najdete na https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Za izvedbo molekularne analize omrežij MS/MS smo izračunali parno spektralno povezljivost na podlagi tipov podobnosti NDP in NL ter uporabili programsko opremo Cytoscape za vizualizacijo topologije omrežja z uporabo organske postavitve v aplikaciji za razširitev algoritma postavitve CyFilescape yFiles.
Za statistično analizo podatkov smo uporabili programsko opremo R različice 3.0.1. Statistična značilnost je bila ocenjena z dvosmerno analizo variance (ANOVA), ki ji je sledil Tukeyjev post-hoc test pošteno značilne razlike (HSD). Za analizo razlike med rastlinojedo skupino in kontrolno skupino smo analizirali dvostransko porazdelitev obeh skupin vzorcev z enako varianco z uporabo Studentovega t-testa.
Za dodatno gradivo k temu članku glejte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
To je članek z odprtim dostopom, distribuiran pod pogoji licence Creative Commons Priznanje avtorstva-Nekomercialno, ki dovoljuje uporabo, distribucijo in reprodukcijo v katerem koli mediju, če končna uporaba ni namenjena komercialnemu dobičku in če je predpostavka, da je izvirno delo pravilno. Referenca.
Opomba: Prosimo vas, da navedete svoj e-poštni naslov le zato, da oseba, ki jo priporočite strani, ve, da želite, da vidi e-pošto in da ne gre za neželeno pošto. E-poštnih naslovov ne bomo zbirali.
To vprašanje se uporablja za preverjanje, ali ste obiskovalec, in za preprečevanje samodejnega pošiljanja neželene pošte.
Teorija informacij zagotavlja univerzalno valuto za primerjavo posebnih metabolomov in napovedovanje teorij obrambe pred testi.
Teorija informacij zagotavlja univerzalno valuto za primerjavo posebnih metabolomov in napovedovanje teorij obrambe pred testi.
©2021 Ameriško združenje za napredek znanosti. vse pravice pridržane. AAAS je partner HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef in COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.