Predhodno smo poročali, da so serumske ravni črevesnega presnovka triptofana, indol-3-propionske kisline (IPA), nižje pri bolnikih z jetrno fibrozo. V tej študiji smo raziskali transkriptom in DNA metilom v debelih jetrih v povezavi s serumskimi ravnmi IPA, pa tudi vlogo IPA pri indukciji fenotipske inaktivacije jetrnih zvezdastih celic (HSC) in vitro.
V študijo je bilo vključenih 116 debelih bolnikov brez sladkorne bolezni tipa 2 (T2DM) (starost 46,8 ± 9,3 let; ITM: 42,7 ± 5,0 kg/m²), ki so bili podvrženi bariatrični operaciji v centru za bariatrično kirurgijo Kuopio (KOBS). Ravni IPA v krvnem obtoku so bile izmerjene s tekočinsko kromatografijo-masno spektrometrijo (LC-MS), analiza jetrnih transkriptomov je bila izvedena s sekvenciranjem celotne RNK, analiza metilacije DNK pa z uporabo čipa Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Za poskuse in vitro so bile uporabljene človeške jetrne zvezdaste celice (LX-2).
Serumske ravni IPA so bile v korelaciji z izražanjem genov, ki sodelujejo pri apoptotičnih, mitofagnih in dolgoživih poteh v jetrih. Gen AKT serin/treonin kinaza 1 (AKT1) je bil najpogostejši in prevladujoči interagirajoči gen v profilih jetrnih transkriptov in metilacije DNA. Zdravljenje z IPA je povzročilo apoptozo, zmanjšalo mitohondrijsko dihanje ter spremenilo celično morfologijo in mitohondrijsko dinamiko z moduliranjem izražanja genov, za katere je znano, da uravnavajo fibrozo, apoptozo in preživetje celic LX-2.
Ti podatki skupaj podpirajo terapevtske učinke IPA, ki lahko povzroči apoptozo in premakne fenotip HSC v neaktivno stanje, s čimer se poveča možnost zaviranja jetrne fibroze z motenjem aktivacije HSC in presnove mitohondrijev.
Razširjenost debelosti in metabolnega sindroma je povezana z naraščajočo incidenco metabolno povezane zamaščenosti jeter (MASLD); bolezen prizadene 25 % do 30 % splošne populacije [1]. Glavna posledica etiologije MASLD je jetrna fibroza, dinamičen proces, za katerega je značilno nenehno kopičenje vlaknatega zunajceličnega matriksa (ECM) [2]. Glavne celice, vključene v jetrno fibrozo, so jetrne zvezdaste celice (HSC), ki kažejo štiri znane fenotipe: mirujoče, aktivirane, inaktivirane in starajoče se [3, 4]. HSC se lahko aktivirajo in transdiferencirajo iz mirujoče oblike v proliferativne celice, podobne fibroblastom, z visokimi energijskimi potrebami, s povečanim izražanjem α-gladkomišičnega aktina (α-SMA) in kolagena tipa I (Col-I) [5, 6]. Med odpravo jetrne fibroze se aktivirane HSC izločijo z apoptozo ali inaktivacijo. Ti procesi vključujejo znižanje regulacije fibrogenih genov in modulacijo genov, ki spodbujajo preživetje (kot so signalne poti NF-κB in PI3K/Akt) [7, 8], pa tudi spremembe v dinamiki in delovanju mitohondrijev [9].
Ugotovljeno je bilo, da so serumske ravni presnovka triptofana indol-3-propionske kisline (IPA), ki nastaja v črevesju, zmanjšane pri presnovnih boleznih pri ljudeh, vključno z MASLD [10–13]. IPA je povezan z vnosom prehranskih vlaknin, znan je po svojih antioksidativnih in protivnetnih učinkih ter zmanjšuje fenotip brezalkoholnega steatohepatitisa (NASH), ki ga povzroča prehrana, in vivo in in vitro [11–14]. Nekateri dokazi izvirajo iz naše prejšnje študije, ki je pokazala, da so bile serumske ravni IPA nižje pri bolnikih z jetrno fibrozo kot pri debelih bolnikih brez jetrne fibroze v študiji Kuopio Bariatric Surgery Study (KOBS). Poleg tega smo pokazali, da lahko zdravljenje z IPA zmanjša izražanje genov, ki so klasični označevalci celične adhezije, migracije celic in aktivacije hematopoetskih matičnih celic v modelu človeških zvezdastih jetrnih celic (LX-2), in je potencialni hepatoprotektivni presnovek [15]. Vendar pa ostaja nejasno, kako IPA povzroča regresijo jetrne fibroze z aktiviranjem apoptoze HSC in mitohondrijske bioenergetike.
Tukaj dokazujemo, da je serumski IPA povezan z izražanjem genov, obogatenih z apoptozo, mitofagijo in potmi dolgoživosti v jetrih debelih posameznikov, vendar brez sladkorne bolezni tipa 2 (KOBS). Poleg tega smo ugotovili, da lahko IPA povzroči čiščenje in razgradnjo aktiviranih hematopoetskih matičnih celic (HSC) preko inaktivacijske poti. Ti rezultati razkrivajo novo vlogo IPA, zaradi česar je potencialna terapevtska tarča za spodbujanje regresije jetrne fibroze.
Prejšnja študija v kohorti KOBS je pokazala, da so imeli bolniki z jetrno fibrozo nižje ravni IPA v krvnem obtoku v primerjavi z bolniki brez jetrne fibroze [15]. Da bi izključili morebitni zavajajoči učinek sladkorne bolezni tipa 2, smo iz tekoče študije KOBS kot študijsko populacijo vključili 116 debelih bolnikov brez sladkorne bolezni tipa 2 (povprečna starost ± SD: 46,8 ± 9,3 let; ITM: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (tabela 1) [16]. Vsi udeleženci so podali pisno informirano soglasje, protokol študije pa je odobril Etični odbor bolnišnice okrožja North Savo v skladu s Helsinško deklaracijo (54/2005, 104/2008 in 27/2010).
Vzorce biopsije jeter so med bariatrično operacijo odvzeli in histološko ocenili izkušeni patologi v skladu s predhodno opisanimi merili [17, 18]. Merila za ocenjevanje so povzeta v dodatni tabeli S1 in so bila opisana že prej [19].
Vzorce seruma na tešče smo analizirali z neciljno tekočinsko kromatografijo-masno spektrometrijo (LC-MS) za metabolomsko analizo (n = 116). Vzorce smo analizirali z uporabo sistema UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Nemčija), kot je bilo opisano že prej19. Identifikacija izopropilnega alkohola (IPA) je temeljila na retencijskem času in primerjavi MS/MS spektra s čistimi standardi. Intenzivnost signala IPA (površina vrha) je bila upoštevana v vseh nadaljnjih analizah [20].
Sekvenciranje celotne jetrne RNA je bilo izvedeno z uporabo Illumina HiSeq 2500, podatki pa so bili predhodno obdelani, kot je bilo opisano že prej [19, 21, 22]. Izvedli smo ciljno analizo diferencialne ekspresije transkriptov, ki vplivajo na mitohondrijsko delovanje/biogenezo, z uporabo 1957 genov, izbranih iz baze podatkov MitoMiner 4.0 [23]. Analiza metilacije jetrne DNK je bila izvedena z uporabo Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, ZDA) po isti metodologiji, kot je opisana že prej [24, 25].
Človeške jetrne zvezdaste celice (LX-2) je prijazno zagotovil prof. Stefano Romeo in so bile gojene ter vzdrževane v mediju DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1 % Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2 % FBS; Gibco, 10270-106). Za izbiro delovnega odmerka IPA so bile celice LX-2 24 ur obdelane z različnimi koncentracijami IPA (10 μM, 100 μM in 1 mM; Sigma, 220027) v mediju DMEM/F12. Poleg tega so za raziskavo sposobnosti IPA za inaktivacijo HSC celice LX-2 24 ur sočasno obdelali s 5 ng/ml TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) in 1 mM IPA v mediju brez seruma. Za ustrezne kontrolne vehikle smo za zdravljenje s TGF-β1 uporabili 4 nM HCl, ki je vseboval 0,1 % BSA, za zdravljenje s IPA pa 0,05 % DMSO, za kombinirano zdravljenje pa smo oba uporabili skupaj.
Apoptozo smo ocenili z uporabo kompleta FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit s 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, ZDA, kat. št. 640922) v skladu z navodili proizvajalca. Na kratko, LX-2 (1 × 105 celic/vdolbinico) smo gojili čez noč v 12-vdolbinskih ploščah in nato obdelali z večkratnimi odmerki IPA ali IPA in TGF-β1. Naslednji dan smo zbrali plavajoče in adherentne celice, jih tripsinizirali, sprali s PBS, resuspendirali v vezavnem pufru za aneksin V in 15 minut inkubirali s FITC-Annexin V in 7-AAD.
Mitohondrije v živih celicah smo obarvali za oksidativno aktivnost z uporabo Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, Kalifornija). Za teste MTR smo celice LX-2 inkubirali pri enakih gostotah z IPA in TGF-β1. Po 24 urah smo žive celice tripsinizirali, sprali s PBS in nato 20 minut inkubirali s 100 μM MTR v mediju brez seruma pri 37 °C, kot je bilo opisano že prej [26]. Za analizo morfologije živih celic smo analizirali velikost celic in citoplazemsko kompleksnost z uporabo parametrov direktnega razprševanja (FSC) oziroma stranskega razprševanja (SSC).
Vsi podatki (30.000 dogodkov) so bili pridobljeni z uporabo programa NovoCyte Quanteon (Agilent) in analizirani s programsko opremo NovoExpress® 1.4.1 ali FlowJo V.10.
Stopnjo porabe kisika (OCR) in stopnjo zunajcelične zakisljenosti (ECAR) smo merili v realnem času z analizatorjem zunajceličnega toka Seahorse (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornija), opremljenim s sistemom Seahorse XF Cell Mito Stress, v skladu z navodili proizvajalca. Na kratko, 2 × 104 celic LX-2/vdolbinico smo zasejali na plošče za celične kulture XF96. Po nočni inkubaciji smo celice obdelali z izopropanolom (IPA) in TGF-β1 (dodatne metode 1). Analiza podatkov je bila izvedena z uporabo programske opreme Seahorse XF Wave, ki vključuje generator poročil o fenotipu celične energije Seahorse XF. Na podlagi tega je bil izračunan indeks bioenergetskega zdravja (BHI) [27].
Celotna RNA je bila prepisana v cDNA. Za specifične metode glejte referenco [15]. Kot konstitutivni kontrolni geni so bile uporabljene ravni mRNA človeškega 60S ribosomskega kislega proteina P0 (RPLP0) in ciklofilina A1 (PPIA). Uporabljen je bil sistem QuantStudio 6 pro Real-Time PCR (Thermo Fisher, Landsmeer, Nizozemska) s kompletom TaqMan™ Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) ali kompletom Sensifast SYBR Lo-ROX (Bioline, BIO 94050), relativna kratnost izražanja genov pa je bila izračunana z uporabo primerjalnih parametrov cikliranja vrednosti Ct (ΔΔCt) in metode ∆∆Ct. Podrobnosti o začetnih oligonukleotidih so navedene v dodatnih tabelah S2 in S3.
Jedrna DNK (ncDNA) in mitohondrijska DNK (mtDNA) sta bili ekstrahirani z uporabo kompleta DNeasy blood and tissue kit (Qiagen), kot je bilo opisano že prej [28]. Relativna količina mtDNA je bila izračunana z izračunom razmerja med vsako ciljno regijo mtDNA in geometrijsko sredino treh regij jedrne DNK (mtDNA/ncDNA), kot je podrobno opisano v Dodatnih metodah 2. Podrobnosti o začetnih oligonukleotidih za mtDNA in ncDNA so navedene v Dodatni tabeli S4.
Žive celice smo obarvali z Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, Kalifornija) za vizualizacijo medceličnih in znotrajceličnih mitohondrijskih omrežij. Celice LX-2 (1 × 104 celic/vdolbinico) smo gojili na steklenih stekelcih v ustreznih ploščah s steklenim dnom (Ibidi GmbH, Martinsried, Nemčija). Po 24 urah smo žive celice LX-2 inkubirali s 100 μM MTR 20 minut pri 37 °C, celična jedra pa smo obarvali z DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich), kot je bilo opisano že prej [29]. Mitohondrijska omrežja smo vizualizirali z inverznim mikroskopom Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Nemčija), opremljenim s konfokalnim modulom Zeiss LSM 800, pri 37 °C v vlažni atmosferi s 5 % CO2 z objektivom 63×NA 1,3. Za vsako vrsto vzorca smo pridobili deset slik serije Z. Vsaka serija Z vsebuje 30 rezin, vsaka z debelino 9,86 μm. Za vsak vzorec so bile z uporabo programske opreme ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Nemčija) pridobljene slike desetih različnih vidnih polj, analiza mitohondrijske morfologije pa je bila izvedena z uporabo programske opreme ImageJ (v1.54d) [30, 31] v skladu s parametri, podrobno opisanimi v Dodatnih metodah 3.
Celice so bile fiksirane z 2 % glutaraldehidom v 0,1 M fosfatnem pufru, nato fiksirane z 1 % raztopino osmijevega tetroksida (Sigma Aldrich, MO, ZDA), postopoma dehidrirane z acetonom (Merck, Darmstadt, Nemčija) in na koncu vdelane v epoksidno smolo. Pripravljeni so bili ultra tanki rezi in obarvani z 1 % uranil acetatom (Merck, Darmstadt, Nemčija) in 1 % svinčevim citratom (Merck, Darmstadt, Nemčija). Ultrastrukturne slike so bile pridobljene z uporabo transmisijskega elektronskega mikroskopa JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokio, Japonska) pri pospeševalni napetosti 80 kV.
Morfologijo celic LX-2, zdravljenih z IPA 24 ur, smo analizirali s faznokontrastno mikroskopijo pri 50-kratni povečavi z uporabo inverznega svetlobnega mikroskopa Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 in AxioCam MRm, Jena, Nemčija).
Klinični podatki so bili izraženi kot povprečje ± standardni odklon ali mediana (interkvartilni razpon: IQR). Za primerjavo razlik med tremi študijskimi skupinami je bila uporabljena enosmerna analiza variance (kontinuirane spremenljivke) ali χ² test (kategorične spremenljivke). Za korekcijo večkratnega testiranja je bila uporabljena stopnja lažno pozitivnih rezultatov (FDR), geni s FDR < 0,05 pa so bili obravnavani kot statistično pomembni. Za korelacijo metilacije CpG DNA z intenzivnostjo IPA signala je bila uporabljena Spearmanova korelacijska analiza, pri čemer so bile navedene nominalne vrednosti p (p < 0,05).
Analiza poti je bila izvedena z uporabo spletnega orodja za analizo genskih naborov (WebGestalt) za 268 transkriptov (nominalni p < 0,01), 119 transkriptov, povezanih z mitohondriji (nominalni p < 0,05) in 4350 CpG od 3093 jetrnih transkriptov, ki so bili povezani z ravnmi IPA v krvnem obtoku. Za iskanje prekrivajočih se genov je bilo uporabljeno prosto dostopno orodje Venny DB (različica 2.1.0), za vizualizacijo interakcij med proteini pa StringDB (različica 11.5).
Za poskus LX-2 so bili vzorci testirani na normalnost z uporabo D'Agostino-Pearsonovega testa. Podatki so bili pridobljeni iz vsaj treh bioloških ponovitev in podvrženi enosmerni ANOVA z Bonferronijevim post hoc testom. Vrednost p manjša od 0,05 je bila ocenjena kot statistično pomembna. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SD, število poskusov pa je navedeno na vsaki sliki. Vse analize in grafi so bili izvedeni z uporabo statistične programske opreme GraphPad Prism 8 za Windows (GraphPad Software Inc., različica 8.4.3, San Diego, ZDA).
Najprej smo raziskali povezavo med serumskimi ravnmi IPA in transkripti v jetrih, celem telesu in mitohondrijih. V celotnem profilu transkriptov je bil najmočnejši gen, povezan s serumskimi ravnmi IPA, MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; mitogenom aktivirana proteinska kinaza 3); v profilu transkriptov, povezanih z mitohondriji, je bil najmočnejši gen, povezan z mitohondriji.
Nato smo analizirali globalne transkripte (n = 268; p < 0,01) in transkripte, povezane z mitohondriji (n = 119; p < 0,05), pri čemer smo apoptozo na koncu opredelili kot najpomembnejšo kanonično pot (p = 0,0089). Pri mitohondrijskih transkriptih, povezanih s serumskimi ravnmi IPA, smo se osredotočili na apoptozo (FDR = 0,00001), mitofagijo (FDR = 0,00029) in signalne poti TNF (FDR = 0,000006) (slika 1A, tabela 2 in dodatne slike 1A-B).
Analiza prekrivanja globalnih, z mitohondriji povezanih transkriptov in metilacije DNA v človeških jetrih v povezavi z ravnmi IPA v serumu. A predstavlja 268 globalnih transkriptov, 119 z mitohondriji povezanih transkriptov in metiliranih transkriptov DNA, ki so preslikani na 3092 mest CpG, povezanih z ravnmi IPA v serumu (vrednosti p < 0,01 za globalne transkripte in metilirano DNA ter vrednosti p < 0,05 za mitohondrijske transkripte). Glavni prekrivajoči se transkripti so prikazani na sredini (AKT1 in YKT6). B Interakcijski zemljevid 13 genov z najvišjim rezultatom interakcije (0,900) z drugimi geni je bil zgrajen iz 56 prekrivajočih se genov (območje črne črte), ki so bili pomembno povezani z ravnmi IPA v serumu, z uporabo spletnega orodja StringDB. Zelena: Geni, preslikani na celično komponento Gene Ontology (GO): mitohondrije (GO:0005739). AKT1 je protein z najvišjo oceno (0,900) za interakcije z drugimi proteini na podlagi podatkov (na podlagi besedilnega rudarjenja, poskusov, podatkovnih baz in soizražanja). Vozlišča omrežja predstavljajo proteine, robovi pa povezave med proteini.
Ker lahko presnovki črevesne mikrobiote uravnavajo epigenetsko sestavo z metilacijo DNK [32], smo raziskali, ali so ravni IPA v serumu povezane z metilacijo DNK v jetrih. Ugotovili smo, da sta dve glavni mesti metilacije, povezani s serumskimi ravnmi IPA, blizu regije 3, bogate s prolinom in serinom (C19orf55), in člana 6 družine proteinov toplotnega šoka B (majhen) (HSPB6) (dodatna datoteka 3). Metilacija DNK 4350 CpG (p < 0,01) je bila povezana s serumskimi ravnmi IPA in je bila obogatena z regulatornimi potmi dolgoživosti (p = 0,006) (slika 1A, tabela 2 in dodatna slika 1C).
Da bi razumeli biološke mehanizme, ki so podlaga za povezave med serumskimi ravnmi IPA, globalnimi transkripti, transkripti, povezanimi z mitohondriji, in metilacijo DNK v človeških jetrih, smo izvedli analizo prekrivanja genov, identificiranih v prejšnji analizi poti (slika 1A). Rezultati analize obogatitve poti 56 prekrivajočih se genov (znotraj črne črte na sliki 1A) so pokazali, da je pot apoptoze (p = 0,00029) izpostavila dva gena, skupna trem analizam: AKT1 in YKT6 (homolog YKT6 v-SNARE), kot je prikazano na Vennovem diagramu (dodatna slika 2 in slika 1A). Zanimivo je, da smo ugotovili, da sta bila AKT1 (cg19831386) in YKT6 (cg24161647) pozitivno povezana s serumskimi ravnmi IPA (dodatna datoteka 3). Za identifikacijo potencialnih interakcij beljakovin med genskimi produkti smo kot vhodne podatke izbrali 13 genov z najvišjo oceno skupne regije (0,900) med 56 prekrivajočimi se geni in izdelali zemljevid interakcij. Glede na stopnjo zaupanja (mejna stopnja zaupanja) je bil gen AKT1 z najvišjo oceno (0,900) na vrhu (slika 1B).
Na podlagi analize poti smo ugotovili, da je apoptoza glavna pot, zato smo raziskali, ali bi zdravljenje z IPA vplivalo na apoptozo HSC in vitro. Predhodno smo dokazali, da različni odmerki IPA (10 μM, 100 μM in 1 mM) niso toksični za celice LX-2 [15]. Ta študija je pokazala, da je zdravljenje z IPA pri 10 μM in 100 μM povečalo število živih in nekrotičnih celic. Vendar pa se je v primerjavi s kontrolno skupino živih celic pri koncentraciji 1 mM IPA zmanjšala živih celic, medtem ko je stopnja nekroze celic ostala nespremenjena (slika 2A, B). Nato smo za iskanje optimalne koncentracije za indukcijo apoptoze v celicah LX-2 24 ur testirali 10 μM, 100 μM in 1 mM IPA (slika 2A-E in dodatna slika 3A-B). Zanimivo je, da sta IPA 10 μM in 100 μM zmanjšala stopnjo apoptoze (%), vendar je IPA 1 mM povečal pozno apoptozo in stopnjo apoptoze (%) v primerjavi s kontrolo in je bil zato izbran za nadaljnje poskuse (sliki 2A–D).
IPA inducira apoptozo celic LX-2. Za kvantifikacijo stopnje apoptoze in morfologije celic s pretočno citometrijo je bila uporabljena metoda dvojnega barvanja z aneksinom V in 7-AAD. Celice BA so bile inkubirane z 10 μM, 100 μM in 1 mM IPA 24 ur ali z F–H TGF-β1 (5 ng/ml) in 1 mM IPA v mediju brez seruma 24 ur. A: žive celice (aneksin V -/ 7AAD-); B: nekrotične celice (aneksin V -/ 7AAD+); C, F: zgodnje (aneksin V +/ 7AAD-); D, G: pozne (aneksin V+/7AAD.+); E, H: odstotek vseh zgodnjih in poznih apoptotičnih celic v stopnji apoptoze (%). Podatki so izraženi kot povprečje ± SD, n = 3 neodvisni poskusi. Statistične primerjave so bile izvedene z enosmerno ANOVA z Bonferronijevim post hoc testom. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Kot smo že pokazali, lahko 5 ng/ml TGF-β1 inducira aktivacijo HSC s povečanjem izražanja klasičnih markernih genov [15]. Celice LX-2 so bile zdravljene s 5 ng/ml TGF-β1 in 1 mM IPA v kombinaciji (slika 2E–H). Zdravljenje s TGF-β1 ni spremenilo stopnje apoptoze, vendar je sočasno zdravljenje z IPA povečalo pozno apoptozo in stopnjo apoptoze (%) v primerjavi z zdravljenjem s TGF-β1 (slika 2E–H). Ti rezultati kažejo, da lahko 1 mM IPA spodbuja apoptozo v celicah LX-2 neodvisno od indukcije TGF-β1.
Nadalje smo raziskali vpliv IPA na mitohondrijsko dihanje v celicah LX-2. Rezultati so pokazali, da je 1 mM IPA zmanjšal parametre stopnje porabe kisika (OCR): nemitohondrijsko dihanje, bazalno in maksimalno dihanje, uhajanje protonov in proizvodnjo ATP v primerjavi s kontrolno skupino (slika 3A, B), medtem ko se bioenergetski indeks zdravja (BHI) ni spremenil.
IPA zmanjšuje mitohondrijsko dihanje v celicah LX-2. Krivulja mitohondrijskega dihanja (OCR) je predstavljena kot parametri mitohondrijskega dihanja (nemitohondrijsko dihanje, bazalno dihanje, maksimalno dihanje, uhajanje protonov, tvorba ATP, SRC in BHI). Celici A in B sta bili 24 ur inkubirani z 10 μM, 100 μM oziroma 1 mM IPA. Celici C in D sta bili 24 ur inkubirani s TGF-β1 (5 ng/ml) oziroma 1 mM IPA v mediju brez seruma. Vse meritve so bile normalizirane na vsebnost DNK z uporabo kompleta CyQuant. BHI: bioenergetski indeks zdravja; SRC: dihalna rezervna kapaciteta; OCR: stopnja porabe kisika. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± standardni odklon (SD), n = 5 neodvisnih poskusov. Statistične primerjave so bile izvedene z enosmerno ANOVA in Bonferronijevim post hoc testom. *p < 0,05; **p < 0,01; in ***p < 0,001
Za celovitejše razumevanje vpliva IPA na bioenergetski profil celic LX-2, aktiviranih s TGF-β1, smo analizirali mitohondrijsko oksidativno fosforilacijo z OCR (slika 3C,D). Rezultati so pokazali, da lahko zdravljenje s TGF-β1 zmanjša maksimalno dihanje, dihalno rezervno kapaciteto (SRC) in BHI v primerjavi s kontrolno skupino (slika 3C,D). Poleg tega je kombinirano zdravljenje zmanjšalo bazalno dihanje, uhajanje protonov in proizvodnjo ATP, vendar sta bila SRC in BHI bistveno višja kot pri tistih, zdravljenih s TGF-β1 (slika 3C,D).
Izvedli smo tudi »test fenotipa celične energije«, ki ga zagotavlja programska oprema Seahorse (dodatna slika 4A–D). Kot je prikazano na dodatni sliki 3B, sta se po zdravljenju s TGF-β1 zmanjšala tako metabolni potencial OCR kot ECAR, vendar v skupinah s kombiniranim zdravljenjem in zdravljenjem z IPA v primerjavi s kontrolno skupino ni bilo opaziti razlike. Poleg tega sta se po kombiniranem zdravljenju in zdravljenju z IPA v primerjavi s kontrolno skupino zmanjšali tako bazalna kot stresna raven OCR (dodatna slika 4C). Zanimivo je, da je bil podoben vzorec opažen pri kombiniranem zdravljenju, kjer ni bilo opaziti spremembe v bazalnih in stresnih ravneh ECAR v primerjavi z zdravljenjem s TGF-β1 (dodatna slika 4C). V HSC zmanjšanje mitohondrijske oksidativne fosforilacije in sposobnost kombiniranega zdravljenja za obnovitev SCR in BHI po izpostavljenosti zdravljenju s TGF-β1 nista spremenila metabolnega potenciala (OCR in ECAR). Skupaj ti rezultati kažejo, da lahko IPA zmanjša bioenergetiko v HSC, kar kaže na to, da lahko IPA povzroči nižji energijski profil, ki premakne fenotip HSC proti inaktivaciji (dodatna slika 4D).
Vpliv IPA na dinamiko mitohondrijev so raziskovali z uporabo tridimenzionalne kvantifikacije mitohondrijske morfologije in omrežnih povezav ter MTR barvanja (slika 4 in dopolnilna slika 5). Slika 4 kaže, da je zdravljenje s TGF-β1 v primerjavi s kontrolno skupino zmanjšalo povprečno površino, število vej, skupno dolžino vej in število stikov vej (slika 4A in B) ter spremenilo delež mitohondrijev iz sferične v vmesno morfologijo (slika 4C). Samo zdravljenje z IPA je zmanjšalo povprečni volumen mitohondrijev in spremenilo delež mitohondrijev iz sferične v vmesno morfologijo v primerjavi s kontrolno skupino (slika 4A). Nasprotno pa so sferičnost, povprečna dolžina vej in mitohondrijska aktivnost, ocenjena z MTR, odvisnim od mitohondrijskega membranskega potenciala (slika 4A in E), ostale nespremenjene in se ti parametri med skupinami niso razlikovali. Skupaj ti rezultati kažejo, da zdravljenje s TGF-β1 in IPA očitno modulirata obliko in velikost mitohondrijev ter kompleksnost omrežja v živih celicah LX-2.
IPA spreminja mitohondrijsko dinamiko in številčnost mitohondrijske DNA v celicah LX-2. A. Reprezentativne konfokalne slike živih celic LX-2, inkubiranih s TGF-β1 (5 ng/ml) in 1 mM IPA 24 ur v mediju brez seruma, ki prikazujejo mitohondrijske mreže, obarvane z Mitotracker™ Red CMXRos, in jedra, obarvana modro z DAPI. Vsi podatki so vsebovali vsaj 15 slik na skupino. Za vsako vrsto vzorca smo pridobili 10 slik Z-stack. Vsako zaporedje Z-osi je vsebovalo 30 rezin, vsaka z debelino 9,86 μm. Merilna vrstica: 10 μm. B. Reprezentativni objekti (samo mitohondrije), identificirani z uporabo prilagodljivega praga na sliki. Kvantitativna analiza in primerjava povezav mitohondrijskih morfoloških mrež sta bili izvedeni za vse celice v vsaki skupini. C. Pogostost razmerij oblik mitohondrijev. Vrednosti blizu 0 označujejo sferične oblike, vrednosti blizu 1 pa nitaste oblike. D Vsebnost mitohondrijske DNA (mtDNA) je bila določena, kot je opisano v poglavju Materiali in metode. Analiza E Mitotracker™ Red CMXRos je bila izvedena s pretočno citometrijo (30.000 dogodkov), kot je opisano v poglavju Materiali in metode. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SD, n = 3 neodvisni poskusi. Statistične primerjave so bile izvedene z uporabo enosmerne ANOVA in Bonferronijevega post hoc testa. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Nato smo analizirali vsebnost mtDNA v celicah LX-2 kot indikator števila mitohondrijev. V primerjavi s kontrolno skupino se je vsebnost mtDNA v skupini, zdravljeni s TGF-β1, povečala (slika 4D). V primerjavi s skupino, zdravljeno s TGF-β1, se je vsebnost mtDNA v skupini s kombiniranim zdravljenjem zmanjšala (slika 4D), kar kaže na to, da lahko IPA zmanjša vsebnost mtDNA in morda število mitohondrijev ter mitohondrijsko dihanje (slika 3C). Poleg tega se zdi, da je IPA v kombiniranem zdravljenju zmanjšal vsebnost mtDNA, vendar ni vplival na mitohondrijsko aktivnost, ki jo posreduje MTR (sliki 4A–C).
Raziskali smo povezavo IPA z ravnmi mRNA genov, povezanih s fibrozo, apoptozo, preživetjem in mitohondrijsko dinamiko v celicah LX-2 (slika 5A–D). V primerjavi s kontrolno skupino je skupina, zdravljena s TGF-β1, pokazala povečano izražanje genov, kot so veriga kolagena tipa I α2 (COL1A2), α-gladkomišični aktin (αSMA), matrična metaloproteinaza 2 (MMP2), tkivni zaviralec metaloproteinaze 1 (TIMP1) in gen, podoben dinaminu 1 (DRP1), kar kaže na povečano fibrozo in aktivacijo. Poleg tega je zdravljenje s TGF-β1 v primerjavi s kontrolno skupino zmanjšalo ravni mRNA jedrskega receptorja za pregnan X (PXR), kaspaze 8 (CASP8), MAPKAPK3, zaviralca B-celic α, ojačevalca lahkega peptida gena jedrskega faktorja κ (NFκB1A) in zaviralca podenote β kinaze jedrskega faktorja κB (IKBKB) (slika 5A–D). V primerjavi z zdravljenjem s TGF-β1 je kombinirano zdravljenje s TGF-β1 in IPA zmanjšalo izražanje COL1A2 in MMP2, vendar je povečalo ravni mRNA PXR, TIMP1, B-celičnega limfoma-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β in IKBKB. Zdravljenje z IPA je znatno zmanjšalo izražanje MMP2, proteina X, povezanega z Bcl-2 (BAX), AKT1, proteina optične atrofije 1 (OPA1) in mitohondrijskega fuzijskega proteina 2 (MFN2), medtem ko se je izražanje CASP8, NFκB1A, NFκB1B in IKBKB povečalo v primerjavi s kontrolno skupino. Vendar pa ni bilo ugotovljene razlike v izražanju kaspaze-3 (CASP3), faktorja aktivacije apoptotične peptidaze 1 (APAF1), mitohondrijskega fuzijskega proteina 1 (MFN1) in fisijskega proteina 1 (FIS1). Ti rezultati skupaj kažejo, da zdravljenje z IPA modulira izražanje genov, povezanih s fibrozo, apoptozo, preživetjem in mitohondrijsko dinamiko. Naši podatki kažejo, da zdravljenje z IPA zmanjšuje fibrozo v celicah LX-2; hkrati pa spodbuja preživetje s premikom fenotipa proti inaktivaciji.
IPA modulira izražanje fibroblastnih, apoptotičnih, viabilnostnih in mitohondrijskih dinamičnih genov v celicah LX-2. Histogrami prikazujejo izražanje mRNA glede na endogeni nadzor (RPLP0 ali PPIA) po 24-urni indukciji celic LX-2 s TGF-β1 in IPA v mediju brez seruma. A označuje fibroblaste, B označuje apoptotične celice, C označuje preživele celice in D označuje izražanje genov mitohondrijske dinamike. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± standardni odklon (SD), n = 3 neodvisni poskusi. Statistične primerjave so bile izvedene z enosmerno ANOVA in Bonferronijevim post hoc testom. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Nato so bile spremembe v velikosti celic (FSC-H) in citoplazemski kompleksnosti (SSC-H) ocenjene s pretočno citometrijo (slika 6A,B), spremembe v morfologiji celic po zdravljenju z IPA pa s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) in fazno kontrastno mikroskopijo (dodatna slika 6A-B). Kot je bilo pričakovano, so se celice v skupini, zdravljeni s TGF-β1, povečale v primerjavi s kontrolno skupino (slika 6A,B), kar kaže na klasično ekspanzijo hrapavega endoplazemskega retikuluma (ER*) in fagolizosomov (P), kar kaže na aktivacijo hematopoetskih matičnih celic (HSC) (dodatna slika 6A). Vendar pa so se v primerjavi s skupino, zdravljeno s TGF-β1, velikost celic, citoplazemska kompleksnost (slika 6A,B) in vsebnost ER* zmanjšale v skupini, zdravljeni s kombinacijo TGF-β1 in IPA (dodatna slika 6A). Poleg tega je zdravljenje z IPA zmanjšalo velikost celic, citoplazemsko kompleksnost (sliki 6A,B), vsebnost P in ER* (dodatna slika 6A) v primerjavi s kontrolno skupino. Poleg tega se je vsebnost apoptotičnih celic po 24 urah zdravljenja z IPA povečala v primerjavi s kontrolno skupino (bele puščice, dopolnilna slika 6B). Ti rezultati skupaj kažejo, da lahko 1 mM IPA spodbudi apoptozo HSC in obrne spremembe morfoloških parametrov celic, ki jih povzroča TGF-β1, s čimer uravnava velikost in kompleksnost celic, kar je lahko povezano z inaktivacijo HSC.
IPA spreminja velikost celic in citoplazemsko kompleksnost v celicah LX-2. Reprezentativne slike pretočne citometrične analize. Analiza je uporabila strategijo prehodnosti, specifično za celice LX-2: SSC-A/FSC-A za opredelitev celične populacije, FSC-H/FSC-A za identifikacijo dvojnikov in SSC-H/FSC-H za analizo velikosti in kompleksnosti celic. Celice so bile 24 ur inkubirane s TGF-β1 (5 ng/ml) in 1 mM IPA v mediju brez seruma. Celice LX-2 so bile porazdeljene v spodnji levi kvadrant (SSC-H-/FSC-H-), zgornji levi kvadrant (SSC-H+/FSC-H-), spodnji desni kvadrant (SSC-H-/FSC-H+) in zgornji desni kvadrant (SSC-H+/FSC-H+) za analizo velikosti celic in citoplazemske kompleksnosti. B. Morfologijo celic smo analizirali s pretočno citometrijo z uporabo FSC-H (direktni razpršenost, velikost celic) in SSC-H (stranski razpršenost, citoplazemska kompleksnost) (30.000 dogodkov). Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SD, n = 3 neodvisni poskusi. Statistične primerjave smo izvedli z enosmerno ANOVA in Bonferronijevim post hoc testom. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 in ****p < 0,0001
Črevesni presnovki, kot je IPA, so postali vroča tema raziskav, kar kaže na možnost odkritja novih tarč v črevesni mikrobioti. Zato je zanimivo, da se je IPA, presnovek, ki smo ga povezali z jetrno fibrozo pri ljudeh [15], v živalskih modelih izkazal za potencialno antifibrotično spojino [13, 14]. Tukaj prvič dokazujemo povezavo med serumskim IPA in globalno jetrno transkriptomiko ter metilacijo DNK pri debelih posameznikih brez sladkorne bolezni tipa 2 (T2D), pri čemer poudarjamo apoptozo, mitofagijo in dolgoživost, pa tudi morebitni kandidatni gen AKT1, ki uravnava homeostazo jeter. Druga novost naše študije je, da smo pokazali interakcijo zdravljenja z IPA z apoptozo, celično morfologijo, mitohondrijsko bioenergetiko in dinamiko v celicah LX-2, kar kaže na nižji energijski spekter, ki premakne fenotip HSC proti inaktivaciji, zaradi česar je IPA potencialni kandidat za izboljšanje jetrne fibroze.
Ugotovili smo, da so apoptoza, mitofagija in dolgoživost najpomembnejše kanonične poti, obogatene z jetrnimi geni, povezanimi z IPA v krvnem obtoku. Motnje v sistemu za nadzor kakovosti mitohondrijev (MQC) lahko vodijo do mitohondrijske disfunkcije, mitofagije in apoptoze, s čimer spodbujajo pojav MASLD [33, 34]. Zato lahko domnevamo, da je IPA morda vključen v ohranjanje celične dinamike in integritete mitohondrijev prek apoptoze, mitofagije in dolgoživosti v jetrih. Naši podatki so pokazali, da sta bila v treh testih skupna dva gena: YKT6 in AKT1. Omeniti velja, da je YKT6 protein SNARE, ki sodeluje v procesu fuzije celične membrane. Igra vlogo pri avtofagiji in mitofagiji tako, da na avtofagosomu tvori iniciacijski kompleks s STX17 in SNAP29, s čimer spodbuja fuzijo avtofagosomov in lizosomov [35]. Poleg tega izguba funkcije YKT6 povzroči oslabljeno mitofagijo [36], medtem ko je povečana regulacija YKT6 povezana z napredovanjem hepatocelularnega karcinoma (HCC), kar kaže na povečano preživetje celic [37]. Po drugi strani pa je AKT1 najpomembnejši interagirajoči gen in igra pomembno vlogo pri boleznih jeter, vključno s signalno potjo PI3K/AKT, celičnim ciklom, migracijo celic, proliferacijo, fokalno adhezijo, mitohondrijsko funkcijo in izločanjem kolagena [38–40]. Aktivirana signalna pot PI3K/AKT lahko aktivira hematopoetske matične celice (HSC), ki so celice, odgovorne za proizvodnjo zunajceličnega matriksa (ECM), njena disregulacija pa lahko prispeva k pojavu in napredovanju jetrne fibroze [40]. Poleg tega je AKT eden ključnih dejavnikov preživetja celic, ki zavira apoptozo celic, odvisno od p53, aktivacija AKT pa je lahko povezana z zaviranjem apoptoze jetrnih celic [41, 42]. Pridobljeni rezultati kažejo, da je IPA lahko vključen v apoptozo, povezano z mitohondriji jeter, tako da vpliva na odločitev hepatocitov med vstopom v apoptozo ali preživetjem. Te učinke lahko uravnavata kandidatna gena AKT in/ali YKT6, ki sta ključna za homeostazo jeter.
Naši rezultati so pokazali, da je 1 mM IPA povzročil apoptozo in zmanjšalo mitohondrijsko dihanje v celicah LX-2 neodvisno od zdravljenja s TGF-β1. Omeniti velja, da je apoptoza glavna pot za razrešitev fibroze in aktivacijo hematopoetskih matičnih celic (HSC) ter je tudi ključni dogodek v reverzibilnem fiziološkem odzivu na jetrno fibrozo [4, 43]. Poleg tega je obnovitev BHI v celicah LX-2 po kombiniranem zdravljenju ponudila nov vpogled v potencialno vlogo IPA pri regulaciji mitohondrijske bioenergetike. V mirovanju in neaktivnih pogojih hematopoetske celice običajno uporabljajo mitohondrijsko oksidativno fosforilacijo za proizvodnjo ATP in imajo nizko presnovno aktivnost. Po drugi strani pa aktivacija HSC izboljša mitohondrijsko dihanje in biosintezo, da kompenzira energijske potrebe za vstop v glikolitično stanje [44]. Dejstvo, da IPA ni vplival na presnovni potencial in ECAR, kaže, da je glikolitična pot manj prednostna. Podobno je druga študija pokazala, da je 1 mM IPA lahko moduliral aktivnost mitohondrijske dihalne verige v kardiomiocitih, človeški celični liniji hepatocitov (Huh7) in endotelijskih celicah človeške popkovnične vene (HUVEC); Vendar pa ni bil ugotovljen noben učinek IPA na glikolizo v kardiomiocitih, kar kaže na to, da bi IPA lahko vplival na bioenergetiko drugih vrst celic [45]. Zato domnevamo, da lahko 1 mM IPA deluje kot blag kemični razdelilec, saj lahko znatno zmanjša izražanje fibrogenih genov, morfologijo celic in mitohondrijsko bioenergetiko, ne da bi pri tem spremenil količino mtDNA [46]. Mitohondrijski razdelilci lahko zavirajo fibrozo, ki jo povzroča kultura, in aktivacijo HSC [47] ter zmanjšajo proizvodnjo mitohondrijskega ATP, ki jo regulirajo ali inducirajo določene beljakovine, kot so razdelilne beljakovine (UCP) ali adenin nukleotidna translokaza (ANT). Glede na vrsto celice lahko ta pojav zaščiti celice pred apoptozo in/ali spodbudi apoptozo [46]. Vendar pa so potrebne nadaljnje študije, da bi razjasnili vlogo IPA kot mitohondrijskega razdelilca pri inaktivaciji hematopoetskih matičnih celic.
Nato smo raziskali, ali se spremembe v mitohondrijskem dihanju odražajo v mitohondrijski morfologiji v živih celicah LX-2. Zanimivo je, da zdravljenje s TGF-β1 spremeni delež mitohondrijev iz sferičnega v vmesno obliko, z zmanjšanim razvejanjem mitohondrijev in povečanim izražanjem DRP1, ključnega dejavnika pri mitohondrijski fisiji [48]. Poleg tega je fragmentacija mitohondrijev povezana s splošno kompleksnostjo omrežja, prehod iz fuzije v fisijo pa je ključnega pomena za aktivacijo hematopoetskih matičnih celic (HSC), medtem ko zaviranje mitohondrijske fisije vodi do apoptoze HSC [49]. Tako naši rezultati kažejo, da lahko zdravljenje s TGF-β1 povzroči zmanjšanje kompleksnosti mitohondrijske mreže z zmanjšanim razvejanjem, kar je pogostejše pri mitohondrijski fisiji, povezani z aktiviranimi hematopoetskimi matičnimi celicami (HSC). Poleg tega so naši podatki pokazali, da lahko IPA spremeni delež mitohondrijev iz sferične v vmesno obliko, s čimer zmanjša izražanje OPA1 in MFN2. Študije so pokazale, da lahko znižana regulacija OPA1 povzroči zmanjšanje potenciala mitohondrijske membrane in sproži apoptozo celic [50]. Znano je, da MFN2 posreduje pri mitohondrijski fuziji in apoptozi [51]. Pridobljeni rezultati kažejo, da indukcija celic LX-2 s TGF-β1 in/ali IPA modulira obliko in velikost mitohondrijev, pa tudi stanje aktivacije in kompleksnost omrežja.
Naši rezultati kažejo, da lahko kombinirano zdravljenje s TGFβ-1 in IPA zmanjša mtDNA in morfološke parametre celic z uravnavanjem izražanja mRNA genov za fibrozo, apoptozo in preživetje, povezanih s preživetjem, v celicah, ki se izogibajo apoptozi. IPA je dejansko zmanjšal raven izražanja mRNA AKT1 in pomembnih genov za fibrozo, kot sta COL1A2 in MMP2, vendar je povečal raven izražanja CASP8, ki je povezan z apoptozo. Naši rezultati so pokazali, da se je po zdravljenju z IPA izražanje BAX zmanjšalo in izražanje mRNA podenot družine TIMP1, BCL-2 in NF-κB povečalo, kar kaže na to, da bi IPA lahko spodbudil signale preživetja v hematopoetskih matičnih celicah (HSC), ki se izogibajo apoptozi. Te molekule lahko delujejo kot signali za preživetje v aktiviranih hematopoetskih matičnih celicah, kar je lahko povezano s povečanim izražanjem antiapoptotičnih proteinov (kot je Bcl-2), zmanjšanim izražanjem proapoptotičnega BAX in kompleksnim medsebojnim delovanjem med TIMP in NF-κB [5, 7]. IPA učinkuje prek PXR in ugotovili smo, da je kombinirano zdravljenje s TGF-β1 in IPA povečalo raven izražanja mRNA PXR, kar kaže na zaviranje aktivacije HSC. Znano je, da aktivirana signalizacija PXR zavira aktivacijo HSC tako in vivo kot in vitro [52, 53]. Naši rezultati kažejo, da lahko IPA sodeluje pri odstranjevanju aktiviranih HSC s spodbujanjem apoptoze, zmanjšanjem fibroze in mitohondrijske presnove ter izboljšanjem signalov preživetja, ki so tipični procesi, ki pretvorijo aktivirani fenotip HSC v inaktiviranega. Druga možna razlaga za potencialni mehanizem in vlogo IPA pri apoptozi je, da odstranjuje disfunkcionalne mitohondrije predvsem prek mitofagije (intrinzična pot) in ekstrinzične signalne poti TNF (tabela 1), ki je neposredno povezana s signalno potjo preživetja NF-κB (dodatna slika 7). Zanimivo je, da lahko obogateni geni, povezani z IPA, inducirajo proapoptotične in pro-preživetvene signale v apoptotični poti [54], kar kaže na to, da lahko IPA inducira apoptotično pot ali preživetje z interakcijo s temi geni. Vendar pa ostaja nejasno, kako IPA povzroča apoptozo ali preživetje med aktivacijo HSC in njene mehanistične poti.
IPA je mikrobni presnovek, ki nastane iz prehranskega triptofana prek črevesne mikrobiote. Študije so pokazale, da ima protivnetne, antioksidativne in epigenetske regulativne lastnosti v črevesnem okolju.[55] Študije so pokazale, da lahko IPA modulira delovanje črevesne pregrade in zmanjša oksidativni stres, kar lahko prispeva k njegovim lokalnim fiziološkim učinkom.[56] Pravzaprav se IPA prenaša do ciljnih organov prek krvnega obtoka, in ker ima IPA podobno strukturo glavnih presnovkov kot triptofan, serotonin in derivati ​​indola, IPA izvaja presnovne učinke, ki povzročijo konkurenčno presnovno usodo.[52] IPA lahko tekmuje s presnovki, pridobljenimi iz triptofana, za vezavna mesta na encimih ali receptorjih, kar lahko moti normalne presnovne poti. To poudarja potrebo po nadaljnjih študijah njegove farmakokinetike in farmakodinamike, da bi bolje razumeli njegovo terapevtsko okno.[57] Še vedno ni jasno, ali se to lahko zgodi tudi v hematopoetskih matičnih celicah (HSC).
Priznavamo, da ima naša študija nekaj omejitev. Da bi posebej preučili povezave, povezane z IPA, smo izključili bolnike s sladkorno boleznijo tipa 2 (T2DM). Priznavamo, da to omejuje široko uporabnost naših ugotovitev pri bolnikih s sladkorno boleznijo tipa 2 in napredovalo boleznijo jeter. Čeprav je fiziološka koncentracija IPA v človeškem serumu 1–10 μM [11, 20], je bila koncentracija 1 mM IPA izbrana na podlagi najvišje netoksične koncentracije [15] in najvišje stopnje apoptoze, brez razlike v odstotku populacije nekrotičnih celic. Čeprav so bile v tej študiji uporabljene suprafiziološke ravni IPA, trenutno ni soglasja glede učinkovitega odmerka IPA [52]. Čeprav so naši rezultati pomembni, širša presnovna usoda IPA ostaja aktivno področje raziskav. Poleg tega so bile naše ugotovitve o povezavi med serumskimi ravnmi IPA in metilacijo DNA jetrnih transkriptov pridobljene ne le iz hematopoetskih matičnih celic (HSC), temveč tudi iz jetrnih tkiv. Za uporabo človeških celic LX-2 smo se odločili na podlagi naših prejšnjih ugotovitev iz transkriptomske analize, da je IPA povezana z aktivacijo hematopoetskih matičnih celic (HSC) [15] in da so HSC glavne celice, ki sodelujejo pri napredovanju jetrne fibroze. Jetra so sestavljena iz več tipov celic, zato je treba za preučevanje vloge IPA in njene interakcije z drugimi tipi jetrnih celic upoštevati tudi druge celične modele, kot je sistem sokulture hepatocitov-HSC-imunskih celic v kombinaciji z aktivacijo kaspaze in fragmentacijo DNK, pa tudi mehanizem delovanja, vključno z ravnijo beljakovin.