Hvala, ker ste obiskali nature.com. Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS. Za najboljšo izkušnjo priporočamo uporabo najnovejše različice brskalnika (ali izklop načina združljivosti v Internet Explorerju). Poleg tega za zagotovitev nadaljnje podpore to spletno mesto ne bo vključevalo slogov ali JavaScripta.
Vodikov sulfid (H2S) ima številne fiziološke in patološke učinke na človeško telo. Natrijev hidrosulfid (NaHS) se pogosto uporablja kot farmakološko orodje za ocenjevanje učinkov H2S v bioloških poskusih. Čeprav izguba H2S iz raztopin NaHS traja le nekaj minut, so bile raztopine NaHS v nekaterih študijah na živalih uporabljene kot donorske spojine za H2S v pitni vodi. Ta študija je preučevala, ali lahko pitna voda s koncentracijo NaHS 30 μM, pripravljena v steklenicah za podgane/miši, ostane stabilna vsaj 12–24 ur, kot predlagajo nekateri avtorji. Pripravite raztopino NaHS (30 μM) v pitni vodi in jo takoj nalijte v steklenice za vodo za podgane/miši. Vzorce smo odvzeli s konice in notranjosti steklenice za vodo po 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 in 24 urah, da smo izmerili vsebnost sulfida z metodo metilenskega modrega. Poleg tega so samcem in samicam podgan dva tedna injicirali NaHS (30 μM), koncentracije sulfida v serumu pa so merili vsak drugi dan v prvem tednu in na koncu drugega tedna. Raztopina NaHS v vzorcu, odvzetem s konice plastenke za vodo, je bila nestabilna; po 12 oziroma 24 urah se je zmanjšala za 72 % oziroma 75 %. V vzorcih, odvzetih iz notranjosti plastenk za vodo, zmanjšanje NaHS v 2 urah ni bilo pomembno; vendar se je po 12 oziroma 24 urah zmanjšalo za 47 % oziroma 72 %. Injekcija NaHS ni vplivala na raven sulfida v serumu pri samcih in samicah podgan. Skratka, raztopin NaHS, pripravljenih iz pitne vode, se ne sme uporabljati za darovanje H2S, ker je raztopina nestabilna. Ta način dajanja bo živali izpostavil neenakomernim in manjšim količinam NaHS od pričakovanih.
Vodikov sulfid (H2S) se kot toksin uporablja že od leta 1700; vendar sta njegovo možno vlogo kot endogene biosignalne molekule opisala Abe in Kimura leta 1996. V zadnjih treh desetletjih so bile pojasnjene številne funkcije H2S v različnih človeških sistemih, kar je privedlo do spoznanja, da imajo lahko donorske molekule H2S klinično uporabo pri zdravljenju ali obvladovanju določenih bolezni; za nedavni pregled glej Chirino et al.
Natrijev hidrosulfid (NaHS) se pogosto uporablja kot farmakološko orodje za oceno učinkov H2S v številnih študijah celičnih kultur in na živalih5,6,7,8. Vendar NaHS ni idealen donor H2S, ker se v raztopini hitro pretvori v H2S/HS-, se zlahka kontaminira s polisulfidi ter zlahka oksidira in izhlapi4,9. V številnih bioloških poskusih se NaHS raztopi v vodi, kar povzroči pasivno izhlapevanje in izgubo H2S10,11,12, spontano oksidacijo H2S11,12,13 in fotolizo14. Sulfid v prvotni raztopini se zaradi izhlapevanja H2S11 zelo hitro izgubi. V odprti posodi je razpolovna doba (t1/2) H2S približno 5 minut, njegova koncentracija pa se zmanjša za približno 13 % na minuto10. Čeprav izguba vodikovega sulfida iz raztopin NaHS traja le nekaj minut, so nekatere študije na živalih uporabljale raztopine NaHS kot vir vodikovega sulfida v pitni vodi 1–21 tednov, pri čemer so raztopino, ki vsebuje NaHS, zamenjale vsakih 12–24 ur.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Ta praksa ni skladna z načeli znanstvenega raziskovanja, saj bi morali odmerki zdravil temeljiti na njihovi uporabi pri drugih vrstah, zlasti pri ljudeh.27
Predklinične raziskave v biomedicini si prizadevajo izboljšati kakovost oskrbe pacientov ali izidov zdravljenja. Vendar pa rezultati večine študij na živalih še niso bili preneseni na ljudi28,29,30. Eden od razlogov za to neuspeh pri prevajanju je pomanjkanje pozornosti, namenjene metodološki kakovosti študij na živalih30. Zato je bil cilj te študije raziskati, ali lahko 30 μM raztopine NaHS, pripravljene v steklenicah za vodo za podgane/miši, ostanejo stabilne v pitni vodi 12–24 ur, kot trdijo ali predlagajo nekatere študije.
Vsi poskusi v tej študiji so bili izvedeni v skladu z objavljenimi smernicami za oskrbo in uporabo laboratorijskih živali v Iranu31. Vsa poročila o poskusih v tej študiji so sledila tudi smernicam ARRIVE32. Etični odbor Inštituta za endokrine znanosti Univerze medicinskih znanosti Shahid Beheshti je odobril vse eksperimentalne postopke v tej študiji.
Cinkov acetat dihidrat (CAS: 5970-45-6) in brezvodni železov klorid (CAS: 7705-08-0) sta bila kupljena pri podjetju Biochem, Chemopahrama (Cosne-sur-Loire, Francija). Natrijev hidrosulfid hidrat (CAS: 207683-19-0) in N,N-dimetil-p-fenilendiamin (DMPD) (CAS: 535-47-0) sta bila kupljena pri podjetju Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ZDA). Izofluran je bil kupljen pri podjetju Piramal (Bethlehem, PA, ZDA). Klorovodikova kislina (HCl) je bila kupljena pri podjetju Merck (Darmstadt, Nemčija).
Pripravite raztopino NaHS (30 μM) v pitni vodi in jo takoj nalijte v steklenice za vodo za podgane/miši. Ta koncentracija je bila izbrana na podlagi številnih publikacij, ki uporabljajo NaHS kot vir H2S; glejte razdelek Razprava. NaHS je hidrirana molekula, ki lahko vsebuje različne količine hidratacijske vode (tj. NaHS•xH2O); po navedbah proizvajalca je bil odstotek NaHS, uporabljenega v naši študiji, 70,7 % (tj. NaHS•1,3 H2O) in to vrednost smo upoštevali pri naših izračunih, kjer smo uporabili molekulsko maso 56,06 g/mol, kar je molekulska masa brezvodnega NaHS. Hidratacijska voda (imenovana tudi kristalizacijska voda) so molekule vode, ki sestavljajo kristalno strukturo33. Hidrati imajo drugačne fizikalne in termodinamične lastnosti v primerjavi z anhidrati34.
Preden v pitno vodo dodate NaHS, izmerite pH in temperaturo topila. Raztopino NaHS takoj vlijte v steklenico za vodo za podgane/miši v živalski kletki. Vzorce smo odvzeli s konice in iz notranjosti steklenice za vodo po 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 in 24 urah za merjenje vsebnosti sulfidov. Meritve sulfidov so bile opravljene takoj po vsakem vzorčenju. Vzorce smo odvzeli s konice epruvete, ker so nekatere študije pokazale, da lahko majhna velikost por v epruveti zmanjša izhlapevanje H2S15,19. Zdi se, da se ta težava nanaša tudi na raztopino v steklenici. Vendar to ni veljalo za raztopino v vratu steklenice za vodo, ki je imela višjo hitrost izhlapevanja in je avtooksidirala; pravzaprav so živali to vodo najprej popile.
V študiji so bili uporabljeni samci in samice podgan Wistar. Podgane so bile nameščene v polipropilenskih kletkah (2–3 podgane na kletko) v standardnih pogojih (temperatura 21–26 °C, vlažnost 32–40 %) z 12 urami svetlobe (od 7.00 do 19.00) in 12 urami teme (od 19.00 do 7.00). Podgane so imele prost dostop do vode iz pipe in so bile hranjene s standardno hrano (Khorak Dam Pars Company, Teheran, Iran). Starostno primerljive (6 mesecev) samice (n=10, telesna teža: 190–230 g) in samci (n=10, telesna teža: 320–370 g) podgane Wistar so bile naključno razdeljene v kontrolno skupino in skupino, tretirano z NaHS (30 μM) (n=5 na skupino). Za določitev velikosti vzorca smo uporabili pristop KISS (Keep It Simple, Stupid), ki združuje predhodne izkušnje in analizo moči35. Najprej smo izvedli pilotno študijo na treh podganah in določili povprečno raven skupnega sulfida v serumu in standardni odklon (8,1 ± 0,81 μM). Nato smo ob upoštevanju 80-odstotne moči in ob predpostavki dvostranske 5-odstotne stopnje pomembnosti določili predhodno velikost vzorca (n = 5 na podlagi prejšnje literature), ki je ustrezala standardizirani velikosti učinka 2,02 z vnaprej določeno vrednostjo, ki jo je predlagal Festing za izračun velikosti vzorca poskusnih živali35. Po množenju te vrednosti s standardnim odklonom (2,02 × 0,81) je bila predvidena zaznavna velikost učinka (1,6 μM) 20 %, kar je sprejemljivo. To pomeni, da je n = 5/skupina zadostna za zaznavanje 20-odstotne povprečne spremembe med skupinami. Podgane so bile naključno razdeljene v kontrolno skupino in skupino, zdravljeno z NaSH, z uporabo naključne funkcije programske opreme Excel36 (dodatna slika 1). Zaslepitev je bila izvedena na ravni izida, raziskovalci, ki so izvajali biokemične meritve, pa niso bili seznanjeni z razporeditvijo skupin.
Skupini obeh spolov, ki sta prejemali NaHS, sta bili 2 tedna zdravljeni s 30 μM raztopino NaHS, pripravljeno v pitni vodi; sveža raztopina je bila dovajana vsakih 24 ur, med tem časom pa je bila izmerjena telesna teža. Vzorci krvi so bili odvzeti z repnih konic vseh podgan pod izofluransko anestezijo vsak drugi dan ob koncu prvega in drugega tedna. Vzorce krvi so centrifugirali pri 3000 g 10 minut, serum so ločili in shranili pri –80 °C za nadaljnje meritve serumske sečnine, kreatinina (Cr) in skupnega sulfida. Serumsko sečnino so določili z encimsko ureazno metodo, serumski kreatinin pa s fotometrično Jaffejevo metodo z uporabo komercialno dostopnih kompletov (Man Company, Teheran, Iran) in avtomatskega analizatorja (Selectra E, serijska številka 0-2124, Nizozemska). Znotraj- in medanalitski koeficienti variacije za sečnino in Cr so bili manjši od 2,5 %.
Metoda z metilenskim modrim (MB) se uporablja za merjenje celotnega sulfida v pitni vodi in serumu, ki vsebuje NaHS; MB je najpogosteje uporabljena metoda za merjenje sulfida v raztopinah in bioloških vzorcih11,37. Metodo MB je mogoče uporabiti za oceno celotne količine sulfida38 in merjenje anorganskih sulfidov v obliki H2S, HS- in S2 v vodni fazi39. Pri tej metodi se žveplo obori kot cinkov sulfid (ZnS) v prisotnosti cinkovega acetata11,38. Obarjanje s cinkovim acetatom je najpogosteje uporabljena metoda za ločevanje sulfidov od drugih kromoforjev11. ZnS je bil ponovno raztopljen z uporabo HCl11 v močno kislih pogojih. Sulfid reagira z DMPD v stehiometričnem razmerju 1:2 v reakciji, ki jo katalizira železov klorid (Fe3+ deluje kot oksidant), da nastane barvilo MB, ki se spektrofotometrično zazna pri 670 nm40,41. Meja zaznavnosti metode MB je približno 1 μM11.
V tej študiji je bilo v epruveto dodanih 100 μL vsakega vzorca (raztopine ali seruma); nato je bilo dodanih 200 μL cinkovega acetata (1 % m/v v destilirani vodi), 100 μL DMPD (20 mM v 7,2 M HCl) in 133 μL FeCl3 (30 mM v 1,2 M HCl). Zmes je bila 30 minut inkubirana pri 37 °C v temi. Raztopina je bila 10 minut centrifugirana pri 10.000 g, absorbanca supernatanta pa je bila odčitana pri 670 nm z uporabo čitalnika mikroplošč (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, ZDA). Koncentracije sulfidov so bile določene z uporabo umeritvene krivulje NaHS (0–100 μM) v ddH2O (dodatna slika 2). Vse raztopine, uporabljene za meritve, so bile sveže pripravljene. Koeficient variacije znotraj in med analizami za meritve sulfidov je bil 2,8 % oziroma 3,4 %. Določili smo tudi skupni sulfid, pridobljen iz vzorcev pitne vode in seruma, ki vsebujejo natrijev tiosulfat, z uporabo metode obogatenega vzorca42. Izkoristki za vzorce pitne vode in seruma, ki vsebujejo natrijev tiosulfat, so bili 91 ± 1,1 % (n = 6) oziroma 93 ± 2,4 % (n = 6).
Statistična analiza je bila izvedena z uporabo programske opreme GraphPad Prism različice 8.0.2 za Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, ZDA, www.graphpad.com). Za primerjavo temperature in pH pitne vode pred in po dodatku NaHS je bil uporabljen parni t-test. Izguba H2S v raztopini, ki je vsebovala NaHS, je bila izračunana kot odstotek zmanjšanja od izhodiščne vrednosti privzema, za oceno, ali je bila izguba statistično pomembna, pa smo izvedli enosmerno ANOVA s ponavljajočimi se meritvami, ki ji je sledil Dunnettov test večkratne primerjave. Telesno težo, sečnino v serumu, kreatinin v serumu in skupni sulfid v serumu skozi čas smo primerjali med kontrolnimi in z NaHS tretiranimi podganami različnih spolov z uporabo dvosmerne mešane (med-znotraj) ANOVA, ki ji je sledil Bonferronijev post hoc test. Dvostranske vrednosti P < 0,05 so bile ocenjene kot statistično pomembne.
pH pitne vode je bil pred dodatkom NaHS 7,60 ± 0,01 in po dodatku NaHS 7,71 ± 0,03 (n = 13, p = 0,0029). Temperatura pitne vode je bila 26,5 ± 0,2 in se je po dodatku NaHS znižala na 26,2 ± 0,2 (n = 13, p = 0,0128). Pripravite 30 μM raztopino NaHS v pitni vodi in jo shranite v steklenici za vodo. Raztopina NaHS je nestabilna in njena koncentracija se sčasoma zmanjšuje. Pri vzorčenju iz vratu steklenice za vodo je bilo v prvi uri opaženo znatno zmanjšanje (68,0 %), vsebnost NaHS v raztopini pa se je po 12 oziroma 24 urah zmanjšala za 72 % oziroma 75 %. V vzorcih, pridobljenih iz steklenic za vodo, zmanjšanje NaHS do 2 ur ni bilo pomembno, po 12 oziroma 24 urah pa se je zmanjšalo za 47 % oziroma 72 %. Ti podatki kažejo, da se je odstotek NaHS v 30 μM raztopini, pripravljeni v pitni vodi, po 24 urah zmanjšal na približno četrtino začetne vrednosti, ne glede na lokacijo vzorčenja (slika 1).
Stabilnost raztopine NaHS (30 μM) v pitni vodi v stekleničkah za podgane/miši. Po pripravi raztopine so bili odvzeti vzorci s konice in notranjosti stekleničke za vodo. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SD (n = 6/skupina). * in #, P < 0,05 v primerjavi s časom 0. Fotografija stekleničke za vodo prikazuje konico (z odprtino) in telo stekleničke. Prostornina konice je približno 740 μL.
Koncentracija NaHS v sveže pripravljeni 30 μM raztopini je bila 30,3 ± 0,4 μM (razpon: 28,7–31,9 μM, n = 12). Vendar se je po 24 urah koncentracija NaHS zmanjšala na nižjo vrednost (povprečje: 3,0 ± 0,6 μM). Kot je prikazano na sliki 2, koncentracije NaHS, ki so jim bile podgane izpostavljene, med obdobjem študije niso bile konstantne.
Telesna teža podganjih samic se je sčasoma znatno povečala (z 205,2 ± 5,2 g na 213,8 ​​± 7,0 g v kontrolni skupini in z 204,0 ± 8,6 g na 211,8 ± 7,5 g v skupini, zdravljeni z NaHS); vendar zdravljenje z NaHS ni imelo vpliva na telesno težo (slika 3). Telesna teža podganjih samcev se je sčasoma znatno povečala (z 338,6 ± 8,3 g na 352,4 ± 6,0 g v kontrolni skupini in z 352,4 ± 5,9 g na 363,2 ± 4,3 g v skupini, zdravljeni z NaHS); vendar zdravljenje z NaHS ni imelo vpliva na telesno težo (slika 3).
Spremembe telesne teže pri samicah in samcih podgan po dajanju NaHS (30 μM). Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SEM in so bili primerjani z dvosmerno mešano (vmesno) analizo variance z Bonferronijevim post hoc testom. n = 5 vsakega spola v vsaki skupini.
Koncentracije sečnine in kreatin fosfata v serumu so bile pri kontrolnih podganah in podganah, zdravljenih z NaSH, primerljive. Poleg tega zdravljenje z NaSH ni vplivalo na koncentracije sečnine in kreatin kroma v serumu (tabela 1).
Izhodiščne koncentracije skupnega sulfida v serumu so bile primerljive med kontrolnimi podganami in podganami, zdravljenimi z NaHS, samci (8,1 ± 0,5 μM v primerjavi z 9,3 ± 0,2 μM) in samicami (9,1 ± 1,0 μM v primerjavi s 6,1 ± 1,1 μM). 14-dnevna uporaba NaHS ni vplivala na raven skupnega sulfida v serumu niti pri samcih niti pri samicah podgan (slika 4).
Spremembe koncentracij skupnega sulfida v serumu pri samcih in samicah podgan po dajanju NaHS (30 μM). Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SEM in so bili primerjani z dvosmerno mešano (znotraj-znotraj) analizo variance z Bonferronijevim post hoc testom. Vsak spol, n = 5/skupina.
Glavni sklep te študije je, da je pitna voda, ki vsebuje NaHS, nestabilna: 24 ur po vzorčenju z vrha in notranjosti steklenic za vodo za podgane/miši je mogoče zaznati le približno četrtino začetne skupne vsebnosti sulfidov. Poleg tega so bile podgane izpostavljene nestabilnim koncentracijam NaHS zaradi izgube H2S v raztopini NaHS, dodatek NaHS v pitno vodo pa ni vplival na telesno težo, sečnino v serumu in kreatin krom ali skupni serumski sulfid.
V tej študiji je bila stopnja izgube H2S iz 30 μM raztopin NaHS, pripravljenih v pitni vodi, približno 3 % na uro. V puferirani raztopini (100 μM natrijevega sulfida v 10 mM PBS, pH 7,4) se je koncentracija sulfida sčasoma v 8 urah zmanjšala za 7 %11. Predhodno smo zagovarjali intraperitonealno dajanje NaHS s poročanjem, da je bila stopnja izgube sulfida iz 54 μM raztopine NaHS v pitni vodi približno 2,3 % na uro (4 %/uro v prvih 12 urah in 1,4 %/uro v zadnjih 12 urah po pripravi)8. Prejšnje študije43 so pokazale konstantno izgubo H2S iz raztopin NaHS, predvsem zaradi izhlapevanja in oksidacije. Tudi brez dodajanja mehurčkov se sulfid v osnovni raztopini hitro izgubi zaradi izhlapevanja H2S11. Študije so pokazale, da se med postopkom redčenja, ki traja približno 30–60 sekund, zaradi izhlapevanja izgubi približno 5–10 % H2S6. Da bi preprečili izhlapevanje H2S iz raztopine, so raziskovalci sprejeli več ukrepov, vključno z nežnim mešanjem raztopine12, prekrivanjem osnovne raztopine s plastično folijo6 in zmanjšanjem izpostavljenosti raztopine zraku, saj je hitrost izhlapevanja H2S odvisna od vmesnika zrak-tekočina.13 Spontana oksidacija H2S se pojavi predvsem zaradi ionov prehodnih kovin, zlasti železovega(III), ki so nečistoče v vodi.13 Oksidacija H2S povzroči nastanek polisulfidov (atomi žvepla, povezani s kovalentnimi vezmi)11. Da bi se izognili njeni oksidaciji, se raztopine, ki vsebujejo H2S, pripravijo v deoksigeniranih topilih44,45 in nato 20–30 minut prepihujejo z argonom ali dušikom, da se zagotovi deoksigenacija.11,12,37,44,45,46 Dietilentriaminpentaocetna kislina (DTPA) je kelator kovin (10–4 M), ki preprečuje avtooksidacijo HS v aerobnih raztopinah. V odsotnosti DTPA je stopnja avtooksidacije HS- približno 50 % v približno 3 urah pri 25 °C37,47. Poleg tega je treba raztopino shranjevati na ledu in zaščititi pred svetlobo11, ker oksidacijo 1e-sulfida katalizira ultravijolična svetloba.
Kot je prikazano na sliki 5, se NaHS pri raztapljanju v vodi disociira na Na+ in HS-6; to disociacijo določa pK1 reakcije, ki je odvisen od temperature: pK1 = 3,122 + 1132/T, kjer se T giblje od 5 do 30 °C in se meri v stopinjah Kelvina (K), K = °C + 273,1548. HS- ima visok pK2 (pK2 = 19), zato pri pH < 96,49 S2- ne nastaja ali pa nastaja v zelo majhnih količinah. Nasprotno pa HS- deluje kot baza in sprejema H+ iz molekule H2O, H2O pa deluje kot kislina in se pretvori v H2S in OH-.
Nastanek raztopljenega plina H2S v raztopini NaHS (30 µM). aq, vodna raztopina; g, plin; l, tekočina. Vsi izračuni predpostavljajo, da je pH vode = 7,0 in temperatura vode = 20 °C. Ustvarjeno z BioRender.com.
Kljub dokazom, da so raztopine NaHS nestabilne, je več študij na živalih uporabilo raztopine NaHS v pitni vodi kot donorsko spojino H2S15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 s trajanjem intervencije od 1 do 21 tednov (tabela 2). Med temi študijami se je raztopina NaHS obnavljala vsakih 12 ur, 15, 17, 18, 24, 25 ur ali 24 ur, 19, 20, 21, 22, 23 ur. Naši rezultati so pokazali, da so bile podgane izpostavljene nestabilnim koncentracijam zdravila zaradi izgube H2S iz raztopine NaHS, vsebnost NaHS v pitni vodi podgan pa je znatno nihala v 12 ali 24 urah (glej sliko 2). Dve od teh študij sta poročali, da so ravni H2S v vodi ostale stabilne v 24 urah22 ali da so bile v 12 urah15 opažene le 2–3 % izgube H2S, vendar nista zagotovili podpornih podatkov ali podrobnosti meritev. Dve študiji sta pokazali, da lahko majhen premer steklenic za vodo zmanjša izhlapevanje H2S15,19. Vendar pa so naši rezultati pokazali, da lahko to izgubo H2S iz steklenice za vodo odloži le za 2 uri in ne za 12–24 ur. Obe študiji ugotavljata, da predpostavljamo, da se raven NaHS v pitni vodi ni spremenila, ker nismo opazili spremembe barve vode; zato oksidacija H2S z zrakom ni bila pomembna19,20. Presenetljivo je, da ta subjektivna metoda ocenjuje stabilnost NaHS v vodi in ne meri spremembe njegove koncentracije skozi čas.
Izguba H2S v raztopini NaHS je povezana s pH in temperaturo. Kot je bilo ugotovljeno v naši študiji, raztapljanje NaHS v vodi povzroči nastanek alkalne raztopine50. Ko se NaHS raztopi v vodi, je tvorba raztopljenega plina H2S odvisna od vrednosti pH6. Nižji kot je pH raztopine, večji je delež NaHS, prisotnega kot molekule plina H2S, in več sulfida se izgubi iz vodne raztopine11. Nobena od teh študij ni poročala o pH pitne vode, ki se uporablja kot topilo za NaHS. V skladu s priporočili SZO, ki jih sprejema večina držav, mora biti pH pitne vode v območju 6,5–8,551. V tem območju pH se hitrost spontane oksidacije H2S poveča približno desetkrat13. Raztapljanje NaHS v vodi v tem območju pH bo povzročilo koncentracijo raztopljenega plina H2S od 1 do 22,5 μM, kar poudarja pomen spremljanja pH vode pred raztapljanjem NaHS. Poleg tega bi temperaturno območje, o katerem poročamo v zgornji študiji (18–26 °C), povzročilo spremembo koncentracije raztopljenega plina H2S v raztopini za približno 10 %, saj temperaturne spremembe spremenijo pK1, majhne spremembe pK1 pa lahko pomembno vplivajo na koncentracijo raztopljenega plina H2S48. Poleg tega to težavo še poslabša dolgo trajanje nekaterih študij (5 mesecev)22, med katerimi se pričakuje velika temperaturna variabilnost.
V vseh študijah, razen ene21, je bila uporabljena 30 μM raztopina NaHS v pitni vodi. Da bi pojasnili uporabljeni odmerek (tj. 30 μM), so nekateri avtorji poudarili, da NaHS v vodni fazi proizvede popolnoma enako koncentracijo plina H2S in da je fiziološki razpon H2S od 10 do 100 μM, zato je ta odmerek znotraj fiziološkega razpona15,16. Drugi so pojasnili, da lahko 30 μM NaHS vzdržuje raven H2S v plazmi znotraj fiziološkega razpona, tj. 5–300 μM19,20. Upoštevamo koncentracijo NaHS v vodi 30 μM (pH = 7,0, T = 20 °C), ki je bila uporabljena v nekaterih študijah za preučevanje učinkov H2S. Izračunamo lahko, da je koncentracija raztopljenega plina H2S 14,7 μM, kar je približno 50 % začetne koncentracije NaHS. Ta vrednost je podobna vrednosti, ki so jo izračunali drugi avtorji pod enakimi pogoji13,48.
V naši študiji dajanje NaHS ni spremenilo telesne teže; ta rezultat je skladen z rezultati drugih študij pri miših samcih22,23 in podganah18; Vendar pa sta dve študiji poročali, da je NaSH obnovil zmanjšano telesno težo pri nefrektomiranih podganah24,26, medtem ko druge študije niso poročale o učinku dajanja NaSH na telesno težo15,16,17,19,20,21,25. Poleg tega v naši študiji dajanje NaSH ni vplivalo na raven sečnine in kreatin-kroma v serumu, kar je skladno z rezultati drugega poročila25.
Študija je pokazala, da dodajanje NaHS v pitno vodo 2 tedna ni vplivalo na skupne koncentracije sulfidov v serumu pri samcih in samicah podgan. Ta ugotovitev je skladna z rezultati Sen in sodelavcev (16): 8 tednov zdravljenja s 30 μM NaHS v pitni vodi ni vplivalo na raven sulfidov v plazmi pri kontrolnih podganah; vendar so poročali, da je ta poseg obnovil znižane ravni H2S v plazmi nefrektomiranih miši. Li in sodelavci (22) so prav tako poročali, da je zdravljenje s 30 μM NaHS v pitni vodi 5 mesecev povečalo raven prostega sulfida v plazmi pri starih miših za približno 26 %. Druge študije niso poročale o spremembah v sulfidu v krvnem obtoku po dodatku NaHS v pitno vodo.
Sedem študij je poročalo o uporabi Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23, vendar niso navedle dodatnih podrobnosti o hidratacijski vodi, pet študij pa ni omenilo vira NaHS, uporabljenega v njihovih metodah priprave17,18,24,25,26. NaHS je hidrirana molekula in njena vsebnost hidratacijske vode se lahko spreminja, kar vpliva na količino NaHS, potrebno za pripravo raztopine določene molarnosti. Na primer, vsebnost NaHS v naši študiji je bila NaHS•1,3 H2O. Zato so lahko dejanske koncentracije NaHS v teh študijah nižje od tistih, ki so bile navedene.
»Kako ima lahko tako kratkotrajna spojina tako dolgotrajen učinek?« so to vprašanje postavili Pozgay in sodelavci21 pri ocenjevanju učinkov NaHS na kolitis pri miših. Upajo, da bodo prihodnje študije lahko odgovorile na to vprašanje in domnevajo, da lahko raztopine NaHS poleg H2S in disulfidov, ki posredujejo učinek NaHS21, vsebujejo tudi stabilnejše polisulfide. Druga možnost je, da imajo lahko zelo nizke koncentracije NaHS, ki ostanejo v raztopini, prav tako koristen učinek. Pravzaprav so Olson in sodelavci predložili dokaze, da mikromolarne ravni H2S v krvi niso fiziološke in bi morale biti v nanomolarnem območju ali pa sploh odsotne13. H2S lahko deluje prek sulfacije beljakovin, reverzibilne posttranslacijske modifikacije, ki vpliva na delovanje, stabilnost in lokalizacijo mnogih beljakovin52,53,54. Pravzaprav je v fizioloških pogojih približno 10 % do 25 % mnogih jetrnih beljakovin sulfiliranih53. Obe študiji priznavata hitro uničenje NaHS19,23, vendar presenetljivo navajata, da »smo koncentracijo NaHS v pitni vodi nadzorovali z dnevnim nadomeščanjem«.23 V eni študiji je bilo pomotoma navedeno, da je »NaHS standardni donor H2S in se v klinični praksi pogosto uporablja za nadomeščanje samega H2S«.18
Zgornja razprava kaže, da se NaHS iz raztopine izgublja z izhlapevanjem, oksidacijo in fotolizo, zato je podan nekaj predlogov za zmanjšanje izgube H2S iz raztopine. Prvič, izhlapevanje H2S je odvisno od vmesnika plin-tekočina13 in pH raztopine11; zato je za zmanjšanje izhlapevanja mogoče vrat steklenice za vodo narediti čim manjši, kot je bilo opisano že prej15,19, pH vode pa prilagoditi na sprejemljivo zgornjo mejo (tj. 6,5–8,551), da se zmanjša izhlapevanje11. Drugič, spontana oksidacija H2S nastane zaradi učinkov kisika in prisotnosti ionov prehodnih kovin v pitni vodi13, zato lahko deoksigenacija pitne vode z argonom ali dušikom44,45 in uporaba kelatorjev kovin37,47 zmanjšata oksidacijo sulfidov. Tretjič, za preprečevanje fotorazgradnje H2S lahko steklenice za vodo ovijemo z aluminijasto folijo; ta praksa velja tudi za svetlobno občutljive materiale, kot je streptozotocin55. Končno se lahko anorganske sulfidne soli (NaHS, Na2S in CaS) dajejo z gavažo namesto raztopljene v pitni vodi, kot je bilo že poročano56,57,58; študije so pokazale, da se radioaktivni natrijev sulfid, ki se podganam daje z gavažo, dobro absorbira in porazdeli v praktično vsa tkiva59. Do danes je večina študij anorganske sulfidne soli dajala intraperitonealno; vendar se ta pot v kliničnih okoljih redko uporablja60. Po drugi strani pa je peroralna pot najpogostejša in najprimernejša pot dajanja pri ljudeh61. Zato priporočamo, da se učinki donorjev H2S pri glodavcih ocenijo z oralno gavažo.
Omejitev je, da smo sulfid v vodni raztopini in serumu merili z metodo MB. Metode za merjenje sulfida vključujejo titracijo z jodom, spektrofotometrijo, elektrokemijsko metodo (potenciometrija, amperometrija, kulometrična metoda in amperometrična metoda) in kromatografijo (plinska kromatografija in visokozmogljiva tekočinska kromatografija), med katerimi je najpogosteje uporabljena metoda spektrofotometrična metoda MB62. Omejitev metode MB za merjenje H2S v bioloških vzorcih je, da meri vse spojine, ki vsebujejo žveplo, in ne prostega H2S63, ker se izvaja v kislih pogojih, kar povzroči ekstrakcijo žvepla iz biološkega vira64. Vendar pa je po podatkih Ameriškega združenja za javno zdravje MB standardna metoda za merjenje sulfida v vodi65. Zato ta omejitev ne vpliva na naše glavne rezultate o nestabilnosti raztopin, ki vsebujejo NaHS. Poleg tega je bila v naši študiji izkoristek meritev sulfida v vzorcih vode in seruma, ki vsebujejo NaHS, 91 % oziroma 93 %. Te vrednosti so v skladu s prej objavljenimi razponi (77–92)66, kar kaže na sprejemljivo analitično natančnost42. Omeniti velja, da smo v skladu s smernicami Nacionalnega inštituta za zdravje (NIH) uporabili tako samce kot samice podgan, da bi se v predkliničnih študijah izognili pretiranemu zanašanju na študije na živalih samo na samcih67 in da bi, kadar koli je to mogoče, vključili tako samce kot samice podgan68. To točko so poudarili tudi drugi69,70,71.
Skratka, rezultati te študije kažejo, da raztopin NaHS, pripravljenih iz pitne vode, ni mogoče uporabiti za proizvodnjo H2S zaradi njihove nestabilnosti. Ta način dajanja bi živali izpostavil nestabilnim in nižjim od pričakovanih ravni NaHS; zato ugotovitve morda ne veljajo za ljudi.
Nabori podatkov, uporabljeni in/ali analizirani med trenutno študijo, so na voljo pri ustreznem avtorju na razumno zahtevo.
Szabo, K. Časovnica raziskav vodikovega sulfida (H2S): od okoljskega toksina do biološkega mediatorja. Biokemija in farmakologija 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Abe, K. in Kimura, H. Možna vloga vodikovega sulfida kot endogenega nevromodulatorja. Journal of Neuroscience, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Chirino, G., Szabo, C. in Papapetropoulos, A. Fiziološka vloga vodikovega sulfida v celicah, tkivih in organih sesalcev. Reviews in Physiology and Molecular Biology 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Dillon, KM, Carrazzone, RJ, Matson, JB in Kashfi, K. Razvijajoča se obljuba celičnih sistemov za dajanje dušikovega oksida in vodikovega sulfida: nova doba personalizirane medicine. Biokemija in farmakologija 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X. in sod. Dolgotrajno dajanje donorja vodikovega sulfida s počasnim sproščanjem lahko prepreči miokardno ishemijo/reperfuzijsko poškodbo. Znanstvena poročila 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Sitdikova, GF, Fuchs, R., Kainz, W., Weiger, TM in Hermann, A. Fosforilacija BK kanalov uravnava občutljivost na vodikov sulfid (H2S). Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Sitdikova, GF, Weiger, TM in Hermann, A. Vodikov sulfid poveča aktivnost kalcijevih (BK) kanalov, aktiviranih s kalcijem, v tumorskih celicah hipofize podgan. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Jeddy, S. in sod. Vodikov sulfid poveča zaščitni učinek nitrita proti poškodbam miokarda zaradi ishemije in reperfuzije pri podganah s sladkorno boleznijo tipa 2. Dušikov oksid 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Corvino, A. in sod. Trendi v kemiji donorjev H2S in njen vpliv na srčno-žilne bolezni. Antioxidants 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
DeLeon, ER, Stoy, GF in Olson, KR (2012). Pasivne izgube vodikovega sulfida v bioloških poskusih. Analytical Biochemistry 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Nagy, P. in sod. Kemijski vidiki meritev vodikovega sulfida v fizioloških vzorcih. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Kline, LL.D. Spektrofotometrično določanje vodikovega sulfida v naravnih vodah. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Olson, KR (2012). Praktično usposabljanje iz kemije in biologije vodikovega sulfida. »Antioksidanti.« Redoks signalizacija. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).