Razvrščanje beljakovin v sekretorni poti je bistveno za ohranjanje celične kompartmentalizacije in homeostaze. Poleg razvrščanja, ki ga posreduje lupina, je vloga lipidov pri razvrščanju kinezinov v procesu sekretornega transporta dolgoletno osnovno vprašanje, na katero še ni odgovora. Tukaj izvajamo 3D sočasno večbarvno slikanje visoke ločljivosti v realnem času, da bi in vivo dokazali, da so na novo sintetizirane beljakovine, imobilizirane z glikozilfosfatidilinozitolom, z zelo dolgimi ceramidnimi lipidnimi deli združene v skupine in razvrščene v specializirana izstopna mesta endoplazemske mreže, ki se razlikujejo od tistih, ki jih uporabljajo transmembranski proteini. Poleg tega dokazujemo, da je dolžina verige ceramida v membrani endoplazemskega retikuluma ključnega pomena za to selektivnost razvrščanja. Naša študija zagotavlja prve neposredne in vivo dokaze za razvrščanje beljakovinskih tovorov na podlagi dolžine lipidne verige v selektivna izvozna mesta v sekretorni poti.
V evkariontskih celicah se beljakovine, sintetizirane v endoplazemskem retikulumu (ER), med transportom po sekretorni poti razvrstijo za dostavo do ustreznega celičnega cilja (1). Poleg razvrščanja, ki ga posreduje plašč, se je dolgo časa ugibalo, da lahko nekateri lipidi služijo tudi kot selektivne izhodne točke, saj se združujejo v specifične membranske domene, ki delujejo na specifične beljakovine (2–5). Vendar pa še vedno primanjkuje neposrednih dokazov in vivo, ki bi dokazali ta možen mehanizem, ki temelji na lipidih. Da bi rešili ta osnovni problem, smo pri kvasovkah preučevali, kako se z glikozilfosfatidilinozitolom (GPI) zasidrane beljakovine (GPI-AP) različno izvažajo iz ER. GPI-AP so različne z lipidi povezane celične površinske beljakovine (6, 7). GPI-AP je izločena beljakovina, ki je pritrjena na zunanje lističe plazemske membrane preko glikolipidnega dela (sidro GPI). Sprejemajo sidra GPI kot konzervativne posttranslacijske modifikacije v lumnu ER (8). Po pritrditvi GPI-AP prehaja skozi Golgijev aparat (5, 9) iz ER v plazemsko membrano. Prisotnost sidrov GPI povzroči, da se GPI-AP po sekretorni poti prenaša ločeno od transmembransko izločenih beljakovin (vključno z drugimi beljakovinami plazemske membrane) (5, 9, 10). V kvasnih celicah so GPI-AP ločeni od drugih izločenih beljakovin v endoplazemskem retikulumu in nato zapakirani v edinstvene vezikle, ovite s kompleksom plaščnih beljakovin II (COPII) (6, 7). Determinante tega klasifikacijskega procesa v procesu izvoza ER niso jasne, vendar se domneva, da ta mehanizem morda zahteva lipide, zlasti strukturno preoblikovanje lipidnega dela sidra GPI (5, 8). Pri kvasovkah se preoblikovanje lipidov GPI začne takoj po pritrditvi GPI in v mnogih primerih povzroči, da se ceramid veže na 26-ogljikovo dolgoverižno nasičeno maščobno kislino (C26:0) (11, 12). Ceramid C26 je glavni ceramid, ki ga do sedaj proizvajajo kvasne celice. Sintetizira se v ER in večina se ga preko veziklov COPII izvozi v Golgijev aparat (13). Izvoz GPI-AP iz ER zahteva predvsem stalno sintezo ceramida (14, 15), pretvorba ceramida v inozitol fosfat ceramid (IPC) v Golgijevem aparatu pa je posledično odvisna od sinteze sidra GPI (16). Biofizikalne študije z umetnimi membranami so pokazale, da se lahko zelo dolgi acilni verigi ceramidov združijo v urejene domene z edinstvenimi fizikalnimi lastnostmi (17, 18). Ti podatki vodijo do hipoteze, da ceramid C26 in GPI-AP s ceramidom C26 uporabljata svoje fizikalne lastnosti za združitev v urejena območja ali območja v relativno neurejenem lipidnem okolju membrane ER. Sestavljen je predvsem iz kratkih in nenasičenih glicerolipidov (C16:1 in C18:1) (19, 20). Te regije bodo selektivno usmerjene na specifična izstopna mesta ER (ERES), kjer se lahko ceramid in GPI-AP na osnovi ceramida sočasno prenašata v Golgijev aparat v istem namenskem veziklu COPII (5).
V tej študiji smo ta mehanizem, ki temelji na lipidih, neposredno preizkusili z uporabo superločljivostne konfokalne slikovne mikroskopije v realnem času (SCLIM), ki je najsodobnejša tehnika mikroskopije, s katero je mogoče hkrati opazovati fluorescentno označene beljakovine. Tribarvne in tridimenzionalne (3D) slike imajo v živih celicah izjemno visoko ločljivost in hitrost (21, 22).
Najprej smo uporabili tehnologijo SCLIM, da bi dodatno opredelili, kako se normalni GPI-AP s ceramidno skupino C26 loči od transmembransko izločenih beljakovin po odhodu iz ER pri S. cerevisiae. Da bi preverili klasifikacijo ER, smo uporabili genetski sistem, ki lahko neposredno vizualizira novo sintetiziran tovor, ki in vivo vstopa v ERES (7, 23). Kot tovor smo izbrali GPI-AP Gas1 na osnovi ceramida C26, označen z zelenim fluorescentnim proteinom (GFP), in transmembransko izločen protein Mid2, označen z bližnjeinfrardečim fluorescentnim proteinom (iRFP), ki oba ciljata na plazemsko membrano (24–26). Pri temperaturno občutljivem mutantu sec31-1 ta dva tovora izražata pod galaktozno inducibilnim promotorjem in konstitutivnim markerjem ERES. Pri ekstremni temperaturi (37 °C), ker mutacija sec31-1 vpliva na funkcijo komponente ovojnice COPII Sec31, ki zavira kalitev COPII in izvoz ER, se novo sintetiziran tovor kopiči v ER (23). Po ohladitvi na nizko temperaturo (24 °C) so se mutirane celice sec31-1 opomogle od sekretornega območja, nakopičeni novi sintetični tovor pa se je začel izvažati iz ER. Vizualizacija CLIM je pokazala, da se je večina na novo sintetiziranih Gas1-GFP in Mid2-iRFP po inkubaciji pri 37 °C še vedno kopičila v ER mutiranih celic sec31-1 in nato sproščala pri 24 °C 5 minut (slika 1). Ker je Mid2-iRFP porazdeljen po celotni membrani ER, Gas1-GFP pa je koncentriran in zbran v diskontinuiranem območju membrane ER, je njihova porazdelitev popolnoma drugačna (slika 1, A do C in film S1). Poleg tega, kot je prikazano na sliki 1D, grozd Gas1-GFP nima Mid2-iRFP. Ti rezultati kažejo, da so bili GPI-AP in transmembranski proteini zgodaj ločeni v različna področja membrane ER. Grozd Gas1-GFP je v bližini specifičnega ERES, označenega z mCherryjevim plaščnim proteinom COPII Sec13 (slika 1, E in F ter film S1) (23).
Celice sec31-1 izražajo galaktozo-inducirane izločke, dolgo acilno verigo (C26) ceramida GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, zelena) in transmembranski protein Mid2-iRFP (TMP, modra), in to konstruktivno ERES označevanje Sec13-mCherry (ERES, magenta) je bilo inkubirano pri 37 °C 30 minut, premaknjeno na 24 °C in 5 minut kasneje posneto z SCLIM. (A do C) prikazuje reprezentativno združeno ali enojno 2D sliko ravnine (A), 2D projekcijsko sliko 10 z-presekov (B) ali 3D sliko celične poloble tovora in ERES markerjev (C). Merilna letev 1 μm (A in B). Enota merila je 0,551 μm (C). Gas1-GFP je bil zaznan v diskretnih ER regijah ali grozdih, medtem ko je bil Mid2-iRFP zaznan in porazdeljen po celotni ER membrani (C). (D) Graf prikazuje relativno intenzivnost fluorescence Gas1-GFP in Mid2-iRFP v gruči Gas1-GFP vzdolž bele puščice (levo). AU, poljubna enota. (E in F) predstavljata 3D-sliko, ki združuje oznako blaga in ERES. Grozdi Gas1-GFP so bili zaznani v bližini specifičnega ERES. Enota merila je 0,551 μm. (F) Bela polna puščica označuje gručo Gas1-GFP, povezano z ERES. Srednja in desna plošča prikazujeta združeno povečano 3D-sliko in zasukan pogled izbrane gruče Gas1-GFP.
Tesna prostorska povezava med grozdom Gas1-GFP in specifičnim ERES kaže, da lahko Gas1-GFP vstopi v selektivni ERES, kar se razlikuje od selektivnosti, ki jo Mid2-iRFP uporablja za izstop iz ER. Da bi obravnavali to možnost, smo kvantificirali razmerje ERES za samo eno ali dve vrsti blaga (slika 2, od A do C). Ugotovili smo, da večina ERES (70 %) vsebuje samo eno vrsto tovora. Spodnja slika slike 2C prikazuje dva tipična primera ERES samo z Gas1-GFP (slika 1) ali samo z Mid2-iRFP (slika 2). Nasprotno pa približno 20 % ERES vsebuje dva tovora, ki se prekrivata na istem območju. Ugotovljeno je bilo, da so nekateri ERES (10 %) vsebovali dve vrsti tovora, vendar sta bila izolirana na jasno različnih območjih. Zato ta statistična analiza kaže, da se po izvozu ER GPI-AP Gas1-GFP in transmembranski tovor Mid2-iRFP razdelita na različne ERES (slika 2D). Ta učinkovitost sortiranja je zelo skladna s prejšnjo biokemijsko analizo (6) in morfološko določitvijo (7). Opazujemo lahko tudi obnašanje karantenjskega tovora, ki vstopa v ERES (slika 2E in film S2). Slika 2E kaže, da le majhen del Gas1-GFP (panel 3) ali Mid2-iRFP (panel 4) vstopi v ERES z ene strani in je omejen na ločenem območju. Panel 5 slike 2E kaže, da se Gas1-GFP in Mid2-iRFP včasih nahajata v istem ERES, vendar vstopata z različnih strani in sta koncentrirana v ločenih regijah, ki lahko predstavljajo različne vezikle COPII. Potrdili smo tudi, da je opažena ločitev in klasifikacija GPI-AP Gas1 na osnovi ceramida C26 kot selektivnega ERES specifična, ker drug transmembranski sekrecijski tovor, z GFP označen protein plazemske membrane Axl2 (27), kaže podobno obnašanje kot Mid2-iRFP. (Slika S1 in film S3). Novo sintetizirani Axl2-GFP se porazdeli skozi membrano ER podobno kot Mid2-iRFP (slika S1, A in B) in je v večini ERES kolokaliziran z Mid2-iRFP (slika S1, B do D). Slika 1 in 2 na sliki 1. S1C prikazuje dva tipična primera ERES, kjer se dva transmembranska tovora prekrivata. V teh primerih oba tovora vstopita v ERES skupaj (slika S1E, slika 3 in film S3).
Celice sec31-1, ki izražajo galaktozno inducibilne izločke, Gas1-GFP (GPI-AP, zelena) in Mid2-iRFP (TMP, modra) ter konstitutivno ERES označevanje Sec13-mCherry (ERES, magenta), so bile postavljene pri 37 °C. Po 30-minutni inkubaciji pri °C so bile premaknjene na 24 °C, da se sprosti blokada izločanja, in po 20 minutah posnete s SCLIM. (A do C) Reprezentativne 2D projekcijske slike (A; merilo, 1 μm) ali 3D slike celičnih hemisfer (B in C; merilna enota, 0,456 μm) tovora in 10 z-prerezov, označenih z ERES. Spodnja plošča v (B) in plošča v (C) prikazujeta obdelane slike, ki prikazujejo samo blago, prisotno v ERES (magenta) [Gas1-GFP (siva) in Mid2-iRFP (svetlo modra)]. (C) Odprta puščica: ERES prenaša samo en kos tovora (1 do 4). Siva puščica: ERES vsebuje ločen tovor (5). Bela neprekinjena puščica: ERES vsebuje sočasni tovor. Spodaj: Izbrani posamezni ERES vsebuje samo Gas1-GFP (1) ali Mid2-iRFP (2). Merilna vrstica, 100 nm. (D) Kvantifikacija fotomikrografije, opisane v (C). Povprečni odstotek ERES, ki vsebuje samo en tovor (Gas1-GFP ali Mid2-iRFP), ločen tovor in prekrivajoči se tovor. V treh neodvisnih poskusih je bilo n=432 v 54 celicah. Vrstica napake = SD. Dvostranski neparni t-test. *** P = 0,0002. (E) 3D-slika izbranega ERES karantenskega tovora, označenega z (C). Gas1-GFP (zelena) (3) ali Mid2-iRFP (modra) (4) vstopi v ERES (magenta) z ene strani in je omejen na majhno območje znotraj ERES. Včasih obe vrsti tovora vstopita v isti ERES (5) z iste strani in sta omejeni na izolirano območje znotraj ERES. Merilna lestvica, 100 nm.
Nato smo preizkusili hipotezo, da dolgoacilna veriga ceramida (C26), prisotna v membrani ER, poganja specifično združevanje in razvrščanje Gas1 v selektivne ERES. V ta namen smo uporabili modificiran sev kvasovk GhLag1, v katerem sta bili dve endogeni ceramidni sintazi, Lag1 in Lac1, nadomeščeni z GhLag1 (homologom bombaža Lag1), kar je povzročilo sev kvasovk s celično membrano ceramida, krajšo od divjega tipa (slika 3A) (28). Analiza masne spektrometrije (MS) je pokazala, da je v sevih divjega tipa 95 % celotnega ceramida ceramida z zelo dolgo verigo (C26), medtem ko je v GhLag1 85 % ceramida zelo dolgih (C18 in C16) , le 2 % ceramida ceramida z zelo dolgo verigo (C26). Čeprav sta ceramidi C18 in C16 glavna ceramida, ki sta bila do sedaj zaznana v membrani GhLag1, je MS analiza potrdila tudi, da sidro GPI Gas1-GFP, izraženo v sevu GhLag1, vsebuje ceramid C26, ki je primerljiv z lipidi divjega tipa. Kakovost je enaka (slika 3A) (26). To pomeni, da je encim za preoblikovanje ceramida Cwh43 zelo selektiven za ceramid C26, kot je prikazano na sliki 26, prednostno vključuje sidro GPI iz majhne količine ceramida C26 v sevu GhLag1. S2 (29). Kljub temu celična membrana GhLag1 v osnovi vsebuje le ceramid C18-C16, medtem ko Gas1-GFP še vedno vsebuje ceramid C26. Zaradi tega dejstva je ta sev idealno orodje za specifično reševanje problema dolžine acilne verige membranskega ceramida v ER. Hipotetična vloga razreda in sortiranja. Nato smo najprej s konvencionalno fluorescenčno mikroskopijo preučevali sposobnost C26 Gas1-GFP, da se kopiči v grozdih v GhLag1 s temperaturno občutljivim mutantnim alelom sec31-1, kjer v ceramidu ER membrane obstaja le dolga (C18-C16) veriga (slika 3). Opazili smo, da je bila v sec31-1 večina Gas1-GFP koncentrirana v grozdih, medtem ko Gas1-GFP v sec31-1 GhLag1 z dolgo (C18-C16) ceramidno ER membrano večinoma ni bil združen in je bil porazdeljen po celotni ER membrani. Natančneje, ker je združevanje na osnovi ceramida C26 tesno povezano s specifičnim ERES (slika 1), smo nato raziskali, ali ta proces lahko vključuje tudi funkcijo mehanizma izvoznega proteina ER. GPI-AP uporablja poseben sistem COPII za izvoz ER, ki ga aktivno regulira strukturno preoblikovanje glikanskega dela sidra GPI s strani Ted1 (30, 31). Rekombinantni GPI-glikan nato prepozna transmembranski kompleks receptorja p24, ki nato selektivno rekrutira Lst1, ki je specifična izoforma glavne podenote vezave tovora COPII, Sec24, in tvori vezikle COPII, bogate z GPI-AP (31-33). Zato smo konstruirali dvojni mutant, ki je združil delecijo teh posameznih proteinov (komponente kompleksa p24 Emp24, encima za preoblikovanje GPI-glikana Ted1 in specifične podenote COPII Lst1) z mutantnim sevom sec31-1 in jih preučili. Ali je mogoče tvoriti Gas1-klaster GFP (slika 3). Opazili smo, da je v sec31-1emp24Δ in sec31-1ted1Δ Gas1-GFP večinoma negručen in porazdeljen po celotni membrani ER, kot smo že opazili v sec31-1 GhLag1, medtem ko je v sec31-1lst1Δ Gas1-GFP podoben sec31-1. Ti rezultati kažejo, da se mora poleg prisotnosti ceramida C26 v membrani ER združevanje Gas1-GFP vezati tudi na kompleks p24 in ne zahteva specifičnega rekrutiranja Lst1. Nato smo raziskali možnost, da lahko dolžina verige ceramida v membrani ER uravnava vezavo Gas1-GFP na p24. Vendar smo ugotovili, da prisotnost ceramida C18-C16 v membrani ne vpliva na GPI-glikane, ki jih rekonstruira kompleks p24 (sliki S3 in S4, A in B), ali na vezavo na GPI-AP in sposobnost izvažanja GPI-AP. Rekrutiranje podtipa COPII Lst1 (slika S4C). Zato združevanje, odvisno od ceramida C26, ne zahteva interakcij beljakovin z različnimi mehanizmi izvoza beljakovin ER, temveč podpira alternativni mehanizem sortiranja, ki ga poganja dolžina lipidov. Nato smo analizirali, ali je dolžina acilne verige ceramida v membrani ER pomembna za učinkovito razvrstitev Gas1-GFP kot selektivnega ERES. Ker Gas1 v sevu GhLag1 s kratkoverižnim ceramidom zapusti ER in vstopi v plazemsko membrano (slika S5), menimo, da če je sortiranje pogojeno z dolžino acilne verige ceramida, se lahko Gas1 v sevu GhLag1 preusmeri in križa. ERES izdelki z isto membrano.
(A) Celična membrana GhLag1 vsebuje predvsem krajše ceramide C18-C16, medtem ko ima sidro GPI Gas1-GFP še vedno enak IPC C26 kot celice divjega tipa. Zgoraj: Analiza dolžine acilne verige ceramida v celični membrani sevov divjega tipa (Wt) in GhLag1p z masno spektrometrijo (MS). Podatki predstavljajo odstotek celotnega ceramida. Povprečje treh neodvisnih poskusov. Stolpec napake = SD. Dvorepi neparni t-test. **** P <0,0001. Spodnja plošča: MS analiza dolžine acilne verige IPC, prisotnega v sidru GPI Gas1-GFP (GPI-IPC), izraženem v sevih divjega tipa in GhLag1p. Podatki predstavljajo odstotek celotnega signala IPC. Povprečje petih neodvisnih poskusov. Stolpec napake = SD. Dvorepi neparni t-test. ns, ni pomembno. P = 0,9134. (B) Fluorescenčne mikrografije celic sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ in sec31-1lst1Δ, ki izražajo z galaktozo induciran Gas1-GFP, so bile inkubirane 30 minut pri 37 °C in nato prenesene v rutinsko fluorescenčno mikroskopijo po 24 °C. Bela puščica: grozd ER Gas1-GFP. Odprta puščica: Negručni Gas1-GFP je porazdeljen po celotni membrani ER, kar kaže na značilno obarvanje jedrnega obroča ER. Merilna lestvica, 5 μm. (C) Kvantifikacija fotomikrografije, opisane v (B). Povprečni odstotek celic s pikčasto strukturo Gas1-GFP. V treh neodvisnih poskusih, n ≥ 300 celic. Vrstica napake = SD. Dvostranski neparni t-test. **** P < 0,0001.
Da bi neposredno rešili ta problem, smo izvedli SCLIM vizualizacijo Gas1-GFP in Mid2-iRFP v GhLag1 s temperaturno občutljivim mutantnim alelom sec31-1 (slika 4 in film S4). Potem ko je bil ER zadržan pri 37 °C in nato sproščen pri 24 °C, večina na novo sintetiziranega Gas1-GFP ni bila združena in porazdeljena po membrani ER, kot so opazili s konvencionalnimi mikroskopi (slika 4, A in B). Poleg tega velik odstotek ERES (67 %) vključuje dve vrsti tovora, ki se nahajata v njem (slika 4D). Plošči 1 in 2 na sliki 4C prikazujeta dva tipična primera ERES s prekrivajočima se Gas1-GFP in Mid2-GFP. Poleg tega sta bila oba tovora rekrutirana v isti ERES (slika 4E, plošča 3 in film S4). Zato naši rezultati kažejo, da je dolžina ceramidne acilne verige v membrani ER pomemben dejavnik agregacije in klasifikacije beljakovin ER.
Celice Sec31-1 GhLag1, ki izražajo galaktozo-inducirane izločke, Gas1-GFP (GPI-AP, zelena) in Mid2-iRFP (TMP, modra) ter konstitutivni z ERES označen Sec13-mCherry (ERES, magenta). Inkubirajte pri 37 °C. Nadaljujte 30 minut, temperaturo spustite na 24 °C, da se sprostijo izločki, in po 20 minutah slikajte s SCLIM. (A do C) Reprezentativne 2D projekcijske slike (A; merilo, 1 μm) ali 3D slike celičnih hemisfer (B in C; merilna enota, 0,45 μm) 10 z-prerezov, označenih s tovorom in ERES. Spodnja plošča v (B) in plošča v (C) prikazujeta obdelane slike, ki prikazujejo samo blago, prisotno v ERES (magenta) [Gas1-GFP (siva) in Mid2-iRFP (svetlo modra)]. (C) Bela puščica: ERES, blago se prekriva. Odprta puščica: ERES vsebuje samo en element. Spodnja plošča: Izbrani ERES ima prekrivajoče se blago (1 in 2), označeno v (C). Merilna vrstica, 100 nm. (D) Kvantifikacija fotomikrografije, opisane v (C). V enotah sec31-1 in sec31-1 GhLag1 je vključen samo en tovor (Gas1-GFP ali Mid2-iRFP) in povprečni odstotek ERES za izoliran tovor in prekrivajoči se tovor. V treh neodvisnih poskusih je n = 432 v 54 celicah (sec31-1) in n = 430 v 47 celicah (sec31-1 GhLag1). Vrstica napake = SD. Dvostranski neparni t-test. *** P = 0,0002 (sec31-1) in ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) 3D-slika izbranega ERES s prekrivajočim se tovorom (3), označenim v (C). Gas1-GFP (zelena) in Mid2-iRFP (modra) se približata ERES (magenta) z iste strani in ostaneta v istem omejenem območju ERES. Merilna vrstica, 100 nm.
Ta študija zagotavlja neposredne in vivo dokaze, da se beljakovinski tovori na osnovi lipidov razvrščajo v selektivna izvozna mesta v sekretorni poti, in razkriva pomen dolžine acilne verige za selektivnost klasifikacije. Z uporabo zmogljive in najsodobnejše mikroskopske tehnike, imenovane SCLIM, smo v kvasovkah prikazali novo sintetiziran Gas1-GFP (glavni GPI-AP plazemske membrane z zelo dolgim ​​acilnim verigo (C26) ceramidnim lipidnim delom). Regije, združene v diskretne ER, so povezane s specifičnimi ERES, medtem ko so transmembransko izločene beljakovine porazdeljene po celotni membrani ER (slika 1). Poleg tega ti dve vrsti blaga selektivno vstopata v različne ERES (slika 2). Dolžina acilne verige celičnega ceramida v membrani se zmanjša s C26 na C18-C16, grozd Gas1-GFP se prekine v diskretno regijo ER, Gas1-GFP pa se preusmeri, da zapusti ER s transmembransko beljakovino skozi isti ERES (slika 3 in slika 3). 4).
Čeprav GPI-AP za izstop iz ER uporablja specializiran proteinski mehanizem, smo ugotovili, da ločitev, odvisna od ceramida C26, ne temelji na diferencialnih interakcijah beljakovin, ki bi lahko vodile do specializacije ERES (sliki S4 in S5). Namesto tega naše ugotovitve podpirajo alternativni klasifikacijski mehanizem, ki ga poganja združevanje beljakovin na osnovi lipidov in posledična izključitev drugih tovorov. Naša opažanja kažejo, da regiji ali grozdu Gas1-GFP, povezanemu s specifičnim ERES, manjka transmembransko izločen protein Mid2-iRFP, kar kaže, da bo grozd GPI-AP, odvisen od ceramida C26, olajšal njihov vstop v ustrezni ERES in hkrati izključil transmembransko izločanje. Izločki vstopijo v ta določen ERES (sliki 1 in 2). Nasprotno pa prisotnost ceramidov C18-C16 v membrani ER ne povzroči, da bi GPI-AP tvoril regije ali grozde, zato ne izključujejo ali nadomeščajo transmembransko izločenih beljakovin v istem ERES (sliki 3 in 4). Zato predlagamo, da ceramid C26 poganja ločevanje in klasifikacijo z olajšanjem združevanja beljakovin, povezanih s specifičnimi ERES.
Kako doseči to združevanje C26 ceramida, odvisno od združevanja, v specifično območje ER? Nagnjenost membranskega ceramida k lateralnemu ločevanju lahko povzroči, da GPI-AP in C26 ceramid tvorita majhne in takoj urejene lipide v bolj nepravilnem lipidnem okolju ER membrane, ki vsebuje krajše in nenasičene glicerolipide. Kakovostni grozdi (17, 18). Ti majhni začasni grozdi se lahko po vezavi na kompleks p24 dodatno združijo v večje, stabilnejše grozde (34). V skladu s tem smo pokazali, da mora C26 Gas1-GFP interagirati s kompleksom p24, da tvori večje vidne grozde (slika 3). Kompleks p24 je heterozigotni oligomer, sestavljen iz štirih različnih transmembranskih proteinov p24 v kvasovkah (35), ki zagotavlja večvalentno vezavo, kar lahko vodi do zamreženja majhnih grozdov GPI-AP, s čimer se ustvari večji stabilen grozd (34). Interakcija med proteinskimi ektodomenami GPI-AP lahko prispeva tudi k njihovi agregaciji, kot je prikazano med njihovim Golgijevim transportom v polariziranih epitelijskih celicah sesalcev (36). Ko pa je v membrani ER prisoten ceramid C18-C16 in se kompleks p24 veže na Gas1-GFP, se veliki ločeni skupki ne bodo oblikovali. Osnovni mehanizem je lahko odvisen od specifičnih fizikalnih in kemijskih lastnosti ceramida z dolgo acilno verigo. Biofizikalne študije umetnih membran kažejo, da čeprav lahko tako ceramidi z dolgo (C24) kot kratko (C18-C16) acilno verigo povzročijo ločitev faz, lahko le ceramidi z dolgo acilno verigo (C24) spodbujajo visoko ukrivljenost in upogibanje filma, da ga preoblikujejo. Z medsebojnim sklicevanjem (17, 37, 38) je bilo dokazano, da transmembranska vijačnica TMED2, človeškega homologa Emp24, selektivno interagira s sfingomielinom na osnovi ceramida C18 v citoplazemskih lobulah (39). Z uporabo simulacij molekularne dinamike (MD) smo ugotovili, da se tako ceramidi C18 kot C26 kopičijo okoli citoplazemskih lobulov transmembranske vijačnice Emp24 in da imata podobne preference (slika S6). Omeniti velja, da to kaže, da lahko transmembranska vijačnica Emp24 povzroči asimetrično porazdelitev lipidov v membrani. To je nedaven rezultat, ki temelji na sesalskih celicah. Podobne MD simulacije kažejo tudi prisotnost eterskih lipidov (40). Zato domnevamo, da je ceramid C26 v obeh lobulah ER26 lokalno obogaten. Ko se GPI-AP v luminalnih lobulah neposredno veže na multivalentni p24 in se ceramid C26 kopiči okoli p24 v citoplazemskih lobulah, lahko to spodbudi spremljajočo agregacijo beljakovin in ukrivljenost membrane, ki nastaneta skozi prste (41), zaradi česar se GPI-AP loči na diskretna območja, ki mejijo na ERES, kar daje prednost tudi močno ukrivljenim območjem membrane ER (42). Prejšnja poročila so podpirala predlagani mehanizem (43, 44). Večvalentna vezava oligolektinov, patogenov ali protiteles na glikosfingolipide na osnovi ceramida (GSL) na plazemski membrani sproži veliko agregacijo GSL, poveča ločevanje faz ter povzroči deformacijo in internalizacijo membrane (44). Iwabuchi itd. (43) Ugotovljeno je bilo, da je v prisotnosti dolgih (C24), ne pa kratkih (C16) acilnih verig večvalentni ligand, vezan na laktozilceramid GSL, povzročil nastanek velikih grozdov in invaginacijo membrane, citoplazmatska Lyn-posredovana signalna transdukcija na lističih pa je prepletena z acilnimi verigami v sklopljenih nevtrofilcih.
V sesalskih polariziranih epitelijskih celicah koncentracija anti-Golgijeve mreže (TGN) do ravni apikalne plazemske membrane nadzoruje ločevanje in razvrščanje GPI-AP (10, 45). To agregacijo poganja oligomerizacija GPI-AP (36), lahko pa je odvisna tudi od dolžine ceramidne verige, ki jo najdemo v kvasovkah. Čeprav ima sesalski GPI-AP sidro na osnovi eter lipidov in se njegova kemijska struktura zelo razlikuje od ceramida z zelo dolgo acilno verigo, je nedavna študija pokazala, da imata oba lipida evolucijsko podobne fizikalne in kemijske lastnosti ter funkcijo (40). Zato je lahko eter lipidni del v sesalskih celicah podoben ceramidu C26 v kvasovkah, njegova vloga pa je, da se poveže z dolgoverižnim ceramidom v membrani in tako spodbudi agregacijo in razvrščanje GPI-AP. Čeprav je treba to možnost še neposredno preizkusiti, prejšnje ugotovitve podpirajo, da transport ceramida z dolgo acilno verigo v Golgijevo telo ne poteka s citoplazmatskimi prenosnimi proteini, temveč je odvisen od sinteze sider GPI, kot pri kvasovkah. Zato se zdi, da evolucijski konzervativni mehanizem lahko selektivno sočasno prenaša ceramid z zelo dolgo acilno verigo in GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) v istem transportnem veziklu.
V sistemih polariziranih epitelijskih celic kvasovk in sesalcev se agregacija in ločitev GPI-AP od drugih proteinov plazemske membrane pojavita, še preden dosežeta celično površino. Paladino in sod. (48) so ugotovili, da na TGN sesalskih polariziranih epitelijskih celic združevanje GPI-AP ni potrebno le za selektivno klasifikacijo GPI-AP na apikalno plazemsko membrano, temveč tudi uravnava organizacijo združevanja GPI-AP in njihovo biološko aktivnost. Celična površina. Pri kvasovkah je ta študija pokazala, da lahko od ceramida C26 odvisen grozd GPI-AP na ER uravnava organizacijo grozdov in funkcionalno aktivnost GPI-AP na plazemski membrani (24, 49). V skladu s tem modelom so celice GhLag1 alergične na zaviralce GPI ali zdravila, ki vplivajo na celovitost celične stene (28), potreba po funkcionalnih grozdih Gas1-GFP (49) konice ceramida, projicirane pri parjenju kvasnih celic, pa kaže na G. Možne fiziološke posledice celic hLag1. Napaka GPI-AP. Vendar pa bo nadaljnje testiranje, ali je bila funkcionalna organizacija celične površine programirana iz ER z metodo sortiranja, ki temelji na dolžini lipidov, predmet naših prihodnjih raziskav.
Sevi Saccharomyces cerevisiae, uporabljeni v tem delu, so navedeni v tabeli S1. Seva MMY1583 in MMY1635 gena SCLIM za slikanje živih celic sta bila konstruirana na ozadju W303. Ti sevi, ki izražajo Sec13-mCherry s fluorescentnim proteinskim označevalcem, so bili konstruirani z metodo, ki temelji na verižni reakciji s polimerazo (PCR), s plazmidom pFA6a kot predlogo (23). Sev, ki izraža Mid2-iRFP, označen s fluorescentnim proteinom pod nadzorom promotorja GAL1, je bil konstruiran na naslednji način. PCR amplifikacija zaporedja iRFP-KanMx iz vektorja pKTiRFP-KAN (darilo E. O'Shea, plazmid Addgene številka 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identifikator raziskovalnega vira (RRID): Addgene_64687) in vstavljena v C-terminalni del endogenega Mid2. Potem ko je bilo zaporedje genoma Mid2-iRFP pomnoženo in klonirano v promotor GAL1, je bilo integrirano v mesto Not I-Sac I integracijskega plazmida pRS306. Nastali plazmid pRGS7 je bil lineariziran s Pst I za integracijo v lokus URA3.
Fuzijski gen Gas1-GFP se izraža pod nadzorom promotorja GAL1 v plazmidu centromera (CEN), ki je konstruiran na naslednji način. Zaporedje Gas1-GFP smo pomnožili s PCR iz plazmida pRS416-GAS1-GFP (24) (darilo L. Popolo) in klonirali na mesto Xma I–Xho I plazmida CEN pBEVY-GL LEU2 (darilo C). Miller; številka plazmida Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Nastali plazmid smo poimenovali pRGS6. Fuzijski gen Axl2-GFP se prav tako izraža pod nadzorom promotorja GAL1 vektorja pBEVY-GL LEU2 in njegova konstrukcija je naslednja. Zaporedje Axl2-GFP smo s PCR pomnožili iz plazmida pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) in ga klonirali v mesto Bam HI-Pst I vektorja pBEVY-GL LEU2. Nastali plazmid smo poimenovali pRGS12. Zaporedje oligonukleotidov, uporabljenih v tej študiji, je navedeno v tabeli S2.
Sev je bil dopolnjen z 0,2 % adenina in 2 % glukoze [YP-dekstroza (YPD)], 2 % rafinozo [YP-rafinoza], bogatim gojiščem z ekstraktom kvasovk in beljakovinami p (YP) (1 % ekstrakta kvasovk in 2 % proteina ept). (YPR)] ali 2 % galaktozo [YP-galaktozo (YPG)] kot virom ogljika ali v sintetičnem minimalnem gojišču (0,15 % dušikove baze kvasovk in 0,5 % amonijevega sulfata) za dopolnitev ustreznih aminokislin in baz, potrebnih za prehrano, in ki je vsebovalo 2 % glukoze (sintetični minimalni medij z glukozo) ali 2 % galaktoze (sintetični minimalni medij z galaktozo) kot virom ogljika.
Za slikanje v realnem času so temperaturno občutljive mutirane celice sec31-1, ki izražajo konstrukt pod promotorjem GAL1, gojili v gojišču YPR pri 24 °C čez noč do sredine logaritemske faze. Po indukciji v YPG pri 24 °C 1 uro so celice 30 minut inkubirali v SG pri 37 °C in nato prenesli na 24 °C, da so se sprostile iz sekrecijskega bloka. Konkanavalin A je bil uporabljen za fiksacijo celic na steklenem stekelcu in slikanje z SCLIM. SCLIM je kombinacija inverznega fluorescenčnega mikroskopa Olympus IX-71 in oljne leče z numerično aperturo UPlanSApo 100×1,4 (Olympus), visokohitrostnega konfokalnega skenerja z vrtečim se diskom in visokim razmerjem signal/šum (Yokogawa Electric), prilagojenega spektrometra in prilagojenega hlajenja. Sistemski ojačevalnik slike (Hamamatsu Photonics) lahko zagotovi sistem povečevalnih leč s končno povečavo ×266,7 in kamero z nabojno sklopljeno napravo, ki množi elektrone (Hamamatsu Photonics) (21). Zajem slik se izvaja s programsko opremo po meri (Yokogawa Electric). Za 3D-slike smo uporabili po meri izdelan piezoelektrični aktuator za navpično vibriranje objektiva in zbrali optične dele, oddaljene 100 nm, v sklad. Z-sklad se pretvori v 3D vokselske podatke, teoretična funkcija razpršitve točk, ki se uporablja za konfokalni mikroskop z vrtečim se diskom, pa se uporabi za dekonvolucijsko obdelavo s programsko opremo Volocity (PerkinElmer). Z uporabo programske opreme Volocity za samodejno določanje pragov za analizo kolokacije je bil izmerjen ERES, vključno s tovorom. Analiza linijskega skeniranja je bila izvedena z uporabo programske opreme MetaMorph (Molecular Devices).
Za določitev statistične pomembnosti uporabite programsko opremo GraphPad Prism. Pri dvostranskem Studentovem t-testu in navadni enosmerni analizi variance (ANOVA) se šteje, da imajo razlike med skupinami pomemben vpliv na P < 0,05 (*).
Za fluorescenčno mikroskopijo Gas1-GFP so bile celice v logaritemski fazi gojene čez noč v YPD in zbrane s centrifugiranjem, dvakrat sprane s fosfatno pufrirano fiziološko raztopino in inkubirane na ledu vsaj 15 minut, nato pa so bile obdelane pod mikroskopom, kot je bilo opisano prej (24). Za zajemanje je bil uporabljen mikroskop Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 olje PH3 CS), opremljen z objektivom, filtrom L5 (GFP), kamero Hamamatsu in programsko opremo Application Suite X (LAS X).
Vzorce smo denaturirali z vzorčnim pufrom SDS pri 65 °C 10 minut in nato ločili z elektroforezo v SDS-poliakrilamidnem gelu (PAGE). Za imunobloting analizo smo nanesli 10 μl vzorca na stezo. Primarno protitelo: Uporabili smo kunčje poliklonsko protitelo proti Gas1 v razredčitvi 1:3000, kunčje poliklonsko protitelo proti Emp24 v razredčitvi 1:500 in kunčje poliklonsko protitelo proti GFP (darilo H. Riezmana) v razredčitvi 1:3000. Mišje monoklonsko protitelo proti Pgk1 smo uporabili v razredčitvi 1:5000 (darilo J. de la Cruza). Sekundarno protitelo: S hrenovo peroksidazo (HRP) konjugiran kozji anti-kunčji imunoglobulin G (IgG), uporabljen v razredčitvi 1:3000 (Pierce). S HRP konjugiran kozji anti-mišji IgG smo uporabili v razredčitvi 1:3000 (Pierce). Območje imunskega odziva smo opazovali s kemiluminiscenčno metodo reagenta SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Kot je opisano v (31), je bil na obogateni frakciji ER izveden poskus naravne imunoprecipitacije. Skratka, kvasne celice smo dvakrat sprali s pufrom TNE [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorida in mešanica zaviralcev proteaz) pri 600 nm (OD600) pri 100 optični gostoti. Pufr smo razdrobili s steklenimi kroglicami, nato pa smo celične ostanke in steklene kroglice odstranili s centrifugiranjem. Supernatant smo nato centrifugirali pri 17.000 g 15 minut pri 4 °C. Peleto smo resuspendirali v TNE in dodali digitalis saponin do končne koncentracije 1 %. Suspenzijo smo inkubirali 1 uro z rotacijo pri 4 °C, nato pa smo netopne komponente odstranili s centrifugiranjem pri 13.000 g pri 4 °C 60 minut. Za imunoprecipitacijo z Gas1-GFP najprej vzorec predinkubirajte s praznimi agaroznimi kroglicami (ChromoTek) pri 4 °C 1 uro in nato 3 ure pri 4 °C inkubirajte z GFP-Trap_A (ChromoTek). Imunoprecipitirane kroglice smo petkrat sprali s TNE, ki je vseboval 0,2 % digoksigenina, eluirali z vzorčnim pufrom SDS, ločili na SDS-PAGE in analizirali z imunoblotingom.
Kot je opisano v (31), je bila določitev zamreženja izvedena na obogateni frakciji ER. Na kratko, obogatena frakcija ER je bila inkubirana z 0,5 mM ditiobis(sukcinimidil propionatom) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, ZDA; 20 °C, 20 min). Reakcijo zamreženja smo prekinili z dodatkom glicina (končna koncentracija 50 mM, 5 minut, 20 °C).
Kot je bilo že opisano (50), je bila izvedena MS analiza ceramida v divjem tipu in sevih GhLag1. Skratka, celice so bile vzgojene do eksponentne faze (3 do 4 OD600 enot/ml) v YPD pri 30 °C in pobranih je bilo 25 × 107 celic. Njihov metabolizem je bil ustavljen s trikloroocetno kislino. Uporabljeno je bilo ekstrakcijsko topilo [etanol, voda, eter, piridin in 4,2 N amonijev hidroksid (15:15:5:1:0,018 v/v)] in 1,2 nmol internega standarda C17 ceramida (860517, Avanti polarni lipid) kakovosti). Za izvedbo blage alkalne hidrolize ekstrakta je bil uporabljen monometilaminski reagent [metanol, voda, n-butanol in raztopina metilamina (4:3:1:5 v/v)], nato pa je bil za razsoljevanje uporabljen z vodo nasičen n-butanol. Končno smo ekstrakt resuspendirali v topilu s pozitivnim načinom [kloroform/metanol/voda (2:7:1) + 5 mM amonijev acetat] in vbrizgali v masni spektrometer. Za identifikacijo in kvantifikacijo molekul sfingolipidov smo izvedli večreakcijsko spremljanje (MRM). Terciarni kvadrupolni masni spektrometer TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) je opremljen z robotskim nanoflow ionskim virom Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) za analizo lipidov. Energija trka je optimizirana za vsako kategorijo ceramidov. MS podatki so bili pridobljeni v pozitivnem načinu. Za vsako biološko ponovitev je lipidni signal mediana treh neodvisnih meritev.
Kot je opisano v (31), so bile celice (800 × 107), ki izražajo Gas1-GFP, podvržene naravni imunoprecipitaciji. Prečiščen Gas1-GFP je bil ločen s SDS-PAGE in prenesen na membrano iz poliviniliden fluorida (PVDF). Protein je bil vizualiziran z barvanjem PVDF z amidnim črnim. Trak Gas1-GFP je bil odrezan iz PVDF in 5-krat spran z metanolom in enkrat z vodo kakovosti za tekočinsko kromatografijo-MS (LC-MS). Z inkubacijo membranskega traku s 500 μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), pufrom in 500 μl sveže raztopljene 1 M mešanice natrijevega nitrita pri 37 °C 3 ure se je lipidna frakcija sprostila iz Gas1-GFP in lizirala med glukozaminom in inozitolom (51). Nato je bil membranski trak štirikrat spran z vodo kakovosti LC-MS, posušen pri sobni temperaturi in shranjen v dušikovi atmosferi pri -80 °C do analize. Kot kontrola je bil za vsak poskus uporabljen slepi vzorec PVDF membrane. Lipid, ekstrahiran iz Gas1-GFP, je bil nato analiziran z MS, kot je opisano (50). Skratka, PVDF trakovi, ki vsebujejo GPI-lipid, so bili resuspendirani v 75 μl negativnega topila za plesen [kloroform/metanol (1:2) + 5 mM amonijev acetat] in podvrženi analizi sfingolipidnih vrst z elektrosprejno ionizacijo (ESI)-MRM/MS (TSQ Vantage). V tem primeru so bili podatki MS pridobljeni v načinu negativnih ionov.
Kot smo že omenili, je bil lipidni del sidra GPI ločen od z [3H]-inozitolom označenega GPI-AP (16). Lipide smo ločili s tankoplastno kromatografijo z uporabo sistema topil (55:45:10 kloroform-metanol-0,25 % KCl) in vizualizirali z uporabo FLA-7000 (Fujifilm).
Celice, ki izražajo Gas1-GFP (600 × 107), smo dvakrat sprali s TNE pufrom in jih razdrobili s steklenimi kroglicami, nato pa centrifugirali za odstranitev celičnih ostankov in steklenih kroglic. Supernatant smo nato centrifugirali pri 17.000 g 1 uro pri 4 °C. Peleto smo sprali v TNE in inkubirali z 1 U PI-PLC (Invitrogen) v TNE, ki je vseboval 0,2 % digitalis saponina, 1 uro pri 37 °C. Po obdelavi z encimi smo membrano odstranili s centrifugiranjem pri 17.000 g pri 4 °C 1 uro. Za imunoprecipitacijo Gas1-GFP smo supernatant inkubirali z GFP-Trap_A (ChromoTek) pri 4 °C čez noč. Prečiščen Gas1-GFP, ločen s SDS-PAGE, smo obarvali s Coomassie briljantno modro barvo. Barvni trak Gas1-GFP je bil odrezan od sive barve, ki obdaja akvadukt, nato pa je bila po alkilaciji z jodoacetamidom in redukciji z ditiotreitolom izvedena digestija v gelu s tripsinom. Triptične peptide in peptide smo ekstrahirali in posušili z GPI-glikani. Posušen peptid smo raztopili v 20 μl vode. Delež (8 μl) smo vbrizgali v LC. Za ločevanje peptidov pod specifičnimi gradientnimi pogoji smo uporabili oktadecilsilansko (ODS) kolono (Develosil 300ODS-HG-5; notranji premer 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, prefektura Aichi, Japonska). Mobilna faza je topilo A (0,08 % mravljinčna kislina) in topilo B (0,15 % mravljinčna kislina v 80 % acetonitrilu). Za eluiranje kolone s topilom A v 55 minutah pri pretoku 50 μl min-1 za 5 minut je bil uporabljen sistem Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts), nato pa je bila koncentracija topila B povečana na 40 %. (Združene države Amerike). Eluat je bil neprekinjeno uvajan v ionski vir ESI, triptični peptidi in peptidi z GPI-glikani pa so bili analizirani z LTQ Orbitrap XL (hibridni masni spektrometer z linearno ionsko pastjo in orbitrapom; Thermo Fisher Scientific). V MS nastavitvi je bila napetost kapilarnega vira nastavljena na 4,5 kV, temperatura prenosne kapilare pa je bila vzdrževana pri 300 °C. Napetost kapilare in napetost leče cevi sta bili nastavljeni na 15 V oziroma 50 V. Podatki MS so bili pridobljeni v načinu pozitivnih ionov (ločljivost 60.000; natančnost mase 10 delcev na milijon) v masnem območju 300/m/z razmerja masa/naboj (m/z) 3000. Podatki MS/MS so pridobljeni prek ionske pasti v LTQ Orbitrap XL [prve 3 števke, od katerih so odvisni podatki, disociacija, povzročena s trkom (CID)].
MD simulacije so bile izvedene z uporabo programske opreme GROMACS (52) in silovnega polja MARTINI 2 (53-55). Za izdelavo dvosloja, ki vsebuje dioleoilfosfatidilholin (DOPC) in Cer C18 ali DOPC in Cer C26, je bil nato uporabljen graditelj membran CHARMM GUI (56, 57). Topologija in koordinate Cer C26 so izpeljane iz DXCE z odstranitvijo dodatnih kroglic iz sfingozinskega repa. Za uravnoteženje dvojnega sloja in njegov zagon uporabite spodaj opisani postopek, nato pa z zadnjimi koordinatami sistema zgradite sistem, ki vsebuje Emp24. Transmembranska domena kvasovke Emp24 (ostanki 173 do 193) je bila konstruirana kot α-vijačnica z uporabo orodja Visual MD (VMD) za molekularno strukturo (58). Nato je bil protein po odstranitvi prekrivajočih se lipidov grobo granuliran in vstavljen v dvosloj z uporabo CHARMM GUI. Končni sistem vsebuje 1202 DOPC in 302 Cer C26 ali 1197 DOPC in 295 Cer C18 in Emp24. Sistem ionizirajte do koncentracije 0,150 M. Za dve dvoslojni sestavi so bile narejene štiri neodvisne ponovitve.
Lipidni dvosloj je uravnotežen z uporabo postopka CHARMM GUI, ki vključuje minimiziranje in nato uravnoteženje 405.000 korakov, kjer se omejitve položaja postopoma zmanjšujejo in odpravljajo, časovni korak pa se poveča z 0,005 ps na 0,02 ps. Po uravnoteženju ustvari 6 µs s časovnim korakom 0,02 ps. Po vstavitvi Emp24 uporabite isti postopek CHARMM GUI za minimiziranje in uravnoteženje sistema ter nato zaženite sistem 8 sekund v produkciji.
Pri vseh sistemih tlak med postopkom uravnoteženja nadzoruje Berendsenov barostat (59), med proizvodnim procesom pa tlak nadzoruje Parrinello-Rahmanov barostat (60). V vseh primerih je povprečni tlak 1 bar in uporablja se pol-izotropna shema sklopitve tlaka. V procesu uravnoteženja in proizvodnje se za sklopitev temperature beljakovin, lipidov in delcev topila uporablja termostat (61) s ponovno kalibracijo hitrosti. Med celotnim delovanjem je ciljna temperatura 310 K. Nevezna interakcija se izračuna z ustvarjanjem seznama parov z uporabo Verletove sheme s toleranco pufra 0,005. Coulombov člen se izračuna z uporabo reakcijskega polja in mejne razdalje 1,1 nm. Vander Waalsov člen uporablja mejno shemo z mejno razdaljo 1,1 nm, Verletova mejna shema pa se uporablja za potencialni drift (62).
Z uporabo VMD je mejna valovna dolžina med DOPC fosfatnimi kroglicami ali ceramidnimi AM1 kroglicami in proteinom 0,7 nm, izračunano pa je število lipidov, ki interagirajo z proteinom. Faktor DE (DE) izračunajte po naslednji formuli, kot je prikazano v (63): faktor DE = (količina skupnih lipidov v proteinu 0,7) v proteinu 0,7 (količina Cer v skupnih lipidih)
Poročana vrednost je izračunana kot povprečje, stolpci napak pa so štiri neodvisne kopije SE. Statistična značilnost faktorja DE se izračuna s t-testom [(povprečjeDE-faktor-1)/SE]. Izračunajte vrednost P iz enostranske porazdelitve.
Za izračun 2D lateralnega zemljevida gostote sistema, ki vsebuje Emp24, v zadnjih 250 ns sledi je bilo uporabljeno orodje GROMACS. Za pridobitev zemljevida obogatitve/izčrpanosti ceramida je bil zemljevid gostote Cer deljen z vsoto zemljevida Cer in DOPC, nato pa deljen s koncentracijo Cer v telesu. Uporabljena je bila ista barvna lestvica zemljevida.
Za dodatno gradivo k temu članku glejte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
To je članek z odprtim dostopom, distribuiran pod pogoji licence Creative Commons Priznanje avtorstva-Nekomercialno, ki dovoljuje uporabo, distribucijo in reprodukcijo v katerem koli mediju, če končna uporaba ni namenjena komercialnemu dobičku in če je predpostavka, da je izvirno delo pravilno. Referenca.
Opomba: Prosimo vas, da navedete svoj e-poštni naslov le zato, da oseba, ki jo priporočite strani, ve, da želite, da vidi e-pošto in da ne gre za neželeno pošto. E-poštnih naslovov ne bomo zbirali.
To vprašanje se uporablja za preverjanje, ali ste obiskovalec, in za preprečevanje samodejnega pošiljanja neželene pošte.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio) Lopez), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D slikanje visoke ločljivosti v realnem času razkriva pomen dolžine ceramidne verige za razvrščanje beljakovin na selektivnih izhodnih mestih.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio) Lopez), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D slikanje visoke ločljivosti v realnem času razkriva pomen dolžine ceramidne verige za razvrščanje beljakovin na selektivnih izhodnih mestih.
©2020 Ameriško združenje za napredek znanosti. vse pravice pridržane. AAAS je partner HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef in COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.