Javascript je v vašem brskalniku trenutno onemogočen. Nekatere funkcije tega spletnega mesta ne bodo delovale, če je javascript onemogočen.
Registrirajte se s svojimi specifičnimi podatki in specifičnim zdravilom, ki vas zanima, in vaše podatke bomo uskladili s članki v naši obsežni bazi podatkov ter vam takoj poslali kopijo v PDF obliki.
Granule Ban-Lan-Gen oslabijo kronični recidivni kolitis, ki ga povzroča dekstran natrijev sulfat, pri miših z moduliranjem črevesne mikrobiote in obnavljanjem črevesne produkcije SCFA, pridobljenega iz GLP-1.
Jiao Peng,1-3,*Li Xi,4,*Zheng Lin,3,5 Duan Lifang,1 Gao Zhengxian,2,5 Diehu,1 Li Jie,6 Li Xiaofeng,6 Shen Xiangchun,5 Xiao Haitao21Oddelek za farmacijo Bolnišnice Shenzhen Univerze v Pekingu, Shenzhen, Ljudska republika Kitajska; 2Zdravstveno-znanstveni center Univerze v Shenzhenu, Farmacevtska fakulteta, Shenzhen, Ljudska republika Kitajska; 3Raziskovalni center za inženirsko tehnologijo etnične in tradicionalne kitajske medicine Medicinske univerze v Guizhouju, Razvoj in uporaba Ministrstva za izobraževanje, Ključni laboratorij za farmacijo province Guizhou, Medicinska univerza v Guizhouju, Guiyang, Ljudska republika Kitajska; 4 Oddelek za gastroenterologijo, Bolnišnica Shenzhen Univerze v Pekingu, Shenzhen, Ljudska republika Kitajska; 5 Farmacevtska fakulteta, Medicinska univerza v Guizhouju, Državni ključni laboratorij za delovanje in uporabo zdravilnih rastlin, Guiyang; 6 Oddelek za laboratorijsko medicino, Bolnišnica Pekinške univerze Shenzhen, Shenzhen, Kitajska [email protected] Shen Xiangchun, Farmacevtska fakulteta, Medicinska univerza Guizhou, Guizhou, Ljudska republika Kitajska, 550004, E-pošta [email protected] Cilj: Terapija na osnovi GLP-1 je nova možnost zdravljenja vnetne črevesne bolezni. Granule Ban-Lan-Gen (BLG) so znana protivirusna formulacija TCM, ki kaže potencialno protivnetno delovanje pri zdravljenju različnih vnetnih stanj. Vendar pa njen protivnetni učinek na kolitis in mehanizem delovanja še vedno nista jasna. METODE: Določiti kronični recidivni kolitis, ki ga povzroča dekstran natrijev sulfat (DSS), pri miših. Za oceno zaščitnega učinka BLG so bili izvedeni indeksi aktivnosti bolezni, histološki markerji poškodb in ravni provnetnih citokinov. Učinke BLG na črevesno mikrobioto in črevesje so okarakterizirali z ravnmi GLP-1 v serumu in izražanjem Gcg, GPR41 in GRP43 v debelem črevesu, sestavo črevesne mikrobiote, ravnmi SCFA v blatu in sproščanjem GLP-1 iz Primarne mišje epitelijske celice debelega črevesa, ki jih proizvajajo SCFA, proizvajajo GLP-1. Rezultati: Zdravljenje z BLG je znatno zmanjšalo izgubo telesne teže, DAI, skrajšanje debelega črevesa, poškodbe tkiva debelega črevesa in ravni provnetnih citokinov TNF-α, IL-1β in IL-6 v tkivu debelega črevesa. Poleg tega lahko zdravljenje z BLG znatno obnovi izražanje Gcg, GPR41 in GRP43 v debelem črevesu ter ravni GLP-1 v serumu pri miših s kolitisom, in sicer s povečanjem bakterij, ki proizvajajo SCFA, kot sta Akkermansia in Prevotellaceae_UCG-001, ter zmanjšanjem številčnosti bakterij, kot so Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas in Oscillibacter. Poleg tega lahko zdravljenje z BLG znatno poveča raven SCFA v blatu miši s kolitisom. Hkrati so poskusi in vitro pokazali tudi, da lahko fekalni ekstrakt miši, zdravljenih z BLG, močno spodbudi izločanje GLP-1 v primarnih majhnih mišjih epitelijskih celicah debelega črevesa. Zaključki: Te ugotovitve kažejo, da ima BLG učinek proti kolitisu. BLG ima potencial za razvoj kot terapija, vsaj delno z moduliranjem črevesne mikrobiote in obnavljanjem črevesne proizvodnje GLP-1, ki jo izločajo SCFA. Obetavna zdravila za kronični recidivni kolitis. Ključne besede: kolitis, granule Ban-Lan-Gen, črevesna mikrobiota, kratkoverižne maščobne kisline, GLP-1
Ulcerozni kolitis (UK) je dolgotrajna vnetna bolezen debelega črevesa in danke, za katero so značilni ponavljajoča se driska, bolečine v trebuhu, izguba teže in mukopurulentno krvavo blato.1 V zadnjem času se je razširjenost UK v državah s prej nizko incidenco, vključno s Kitajsko, povečala, zaradi vse večje priljubljenosti zahodnega načina življenja.2 To povečanje predstavlja velike težave za javno zdravje in ima resne posledice za sposobnost bolnikov za delo in kakovost življenja. Omeniti velja, da patogeneza UK ostaja v veliki meri nejasna, vendar je splošno sprejeto, da genetika, okoljski dejavniki, črevesna mikrobiota in imunski sistem prispevajo k razvoju UK.3 Še vedno ni zdravila za UK, cilj zdravljenja pa je klinično nadzorovati klinične simptome, sprožiti in vzdrževati remisijo, spodbujati celjenje sluznice in zmanjšati ponovitev. Klasična zdravljenja vključujejo aminosalicilate, kortikosteroide, imunosupresive in biološka zdravila. Vendar pa ta zdravila zaradi različnih stranskih učinkov ne morejo doseči želenega učinka.4 Nedavno so številne študije primerov pokazale, da je tradicionalna kitajska medicina (TKM) pokazala velik potencial pri lajšanju UK. z nizko toksičnostjo, kar kaže na to, da je razvoj novih terapij tradicionalne kitajske medicine obetavna strategija zdravljenja ulceroznega kolitisa.5-7
Banlangen granule (BLG) so tradicionalni kitajski medicinski pripravek, narejen iz vodnega izvlečka korenine Banlangen.8 Poleg protivirusne učinkovitosti BLG kaže potencialno protivnetno delovanje pri zdravljenju različnih vnetnih stanj.9,10 Poleg tega so bili iz vodnih izvlečkov Radix isatidis izolirani in identificirani glukozinolati (R,S-goitrin, progoitrin, epiprorubin in glukozid) ter nukleozidi (hipoksantin, adenozin, uridin in gvanozin) ter indigo alkaloidi, kot sta indigo in indirubin.11,12 Prejšnje študije so dobro dokumentirale, da spojine adenozin, uridin in indirubin kažejo močne učinke proti kolitisu pri različnih živalskih modelih kolitisa.13-17 Vendar pa niso bile izvedene nobene študije, ki bi temeljile na dokazih, za oceno učinkovitosti BLG pri kolitisu. V tej študiji smo raziskali zaščitni učinek BLG na kronični recidivni kolitis, ki ga povzroča dekstran natrijev sulfat (DSS), pri miših C57BL/6 in ugotovili da je peroralna uporaba BLG znatno oslabila kronično recidivno vnetje debelega črevesa, ki ga povzroča DSS, pri miših, njegovi regulatorni mehanizmi pa so povezani z modulacijo črevesne mikrobiote in obnavljanjem proizvodnje glukagonu podobnega peptida-1 (GLP-1), ki izvira iz črevesja.
Granule BLG (brez sladkorja, odobrene s strani NMPA Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Peking, Kitajska; številka serije: 20110966) so bile kupljene v lekarnah. DSS (molekulska masa: 36.000–50.000 daltonov) je bil kupljen pri MP Biologicals (Santa Ana, ZDA). Sulfasalazin (SASP) (≥ 98 % čistost), hematoksilin in eozin so bili kupljeni pri Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ZDA). Mišji kompleti za testiranje TNF-α, IL-1β in IL-6 luminex Elisa so bili kupljeni pri R&D systems (Minneapolis, MN, ZDA). Ocetna kislina, propionska kislina in maslena kislina so bile kupljene pri Aladdin Industries (Šanghaj, Kitajska). 2-etilmaslena kislina je bila kupljena pri Merck KGaA (Darmstadt, Nemčija).
6–8 tednov stare samce miši C57BL/6 (telesna teža 18–22 g) smo kupili pri podjetju Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Peking, Kitajska) in jih namestili v okolje s temperaturo 22 ± 2 °C z 12-urnim ciklom svetlobe/teme. Miši smo en teden hranili s standardno prehrano za glodavce in imeli prosti dostop do pitne vode, da so se privadile na novo okolje. Miši smo nato naključno razdelili v štiri skupine: kontrolno skupino, modelno skupino DSS, skupino, zdravljeno s SASP (200 mg/kg, peroralno), in skupino, zdravljeno z BLG (1 g/kg, peroralno). Kot je prikazano na sliki 1A, je bil v skladu z našo prejšnjo študijo eksperimentalni kronični recidivni kolitis pri miših povzročen s tremi cikli 1,8 % DSS 5 dni, nato pa z destilirano vodo 7 dni, v skladu z našo prejšnjo študijo.18 Miši v skupinah, zdravljenih s SASP in BLG, smo zdravili s SASP oziroma BLG vsak dan, začenši z dnem 0. V skladu s predhodnimi poskusi je bil odmerek BLG nastavljen na 1 g/kg. Medtem je bil odmerek SASP v skladu z literaturo nastavljen na 200 mg/kg.4 Kontrolna skupina in skupina z modelom DSS sta ves čas poskusa prejemali enako količino vode.
Slika 1 BLG izboljša kronični recidivni kolitis, ki ga povzroča DSS, pri miših. (A) Eksperimentalna zasnova kroničnega recidivnega kolitisa in zdravljenje, (B) sprememba telesne teže, (C) indeks aktivnosti bolezni (DAI), (D) dolžina debelega črevesa, (E) reprezentativna slika debelega črevesa, (F) barvanje H&E Debelo črevo (povečava, ×100) in (G) histološki rezultat. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SEM (n = 6).##p < 0,01 ali ###p < 0,001 v primerjavi s kontrolno (Con) skupino; *p < 0,05 ali **p < 0,01 ali ***p < 0,001 v primerjavi s skupino DSS.
Telesna teža, konsistenca blata in rektalna krvavitev so bili zabeleženi dnevno. Indeks aktivnosti bolezni (DAI) je bil določen z združevanjem rezultatov telesne teže, konsistence blata in rektalne krvavitve, kot je bilo opisano že prej.19 Na koncu poskusa so bile vse miši evtanazirane, kri, blato in debelo črevo pa so bili zbrani za nadaljnje poskuse.
Tkivo debelega črevesa je bilo fiksirano s formalinom in vgrajeno v parafin. Izdelani so bili 5-mikronski rezi, obarvani s hematoksilin-eozinom (H&E), nato pa so bili zaslepljeni in ocenjeni, kot je bilo opisano prej.19
Celotno RNK tkiva debelega črevesa smo ekstrahirali z reagentom Trizol (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija), nato pa smo ekstrahirali cDNA z reverzno transkriptazo (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Japonska). Kvantitativna PCR je bila izvedena z uporabo sistema PCR v realnem času s SYBR Green Master (Roche, Basel, Švica). Transkripti ciljnih genov so bili normalizirani na β-aktin in podatki so bili analizirani z metodo 2-ΔΔCT. Zaporedja primerjev genov so prikazana v tabeli 1.
Primarna izolacija in gojenje mišjih epitelijskih celic debelega črevesa sta bila izvedena, kot je bilo opisano že prej.20 Na kratko, debelo črevo 6-8 tednov starih miši je bilo po žrtvovanju z dislokacijo vratne hrbtenice najprej izrezano, nato vzdolžno odprto, obdelano s Hanksovo uravnoteženo solno raztopino (HBSS, brez kalcija in magnezija) in razrezano na 0,5-1 mm majhne koščke. Nato so bila tkiva prebavljena z 0,4 mg/mL kolagenaze XI (Sigma, Poole, Združeno kraljestvo) v prostem mediju DMEM in centrifugirana pri 300 xg 5 minut pri sobni temperaturi. Peleto resuspendirajte v mediju DMEM (dopolnjenem z 10 % fetalnim govejim serumom, 100 enotami/mL penicilina in 100 µg/mL streptomicina) pri 37 °C in precedite skozi najlonsko mrežico (velikost por ~250 µm). Alikvote epitelijskih celic debelega črevesa so dali v posode s steklenim dnom in inkubirali z ocetno kislino, propionsko kislino, masleno kislino in mišjimi fekalnimi ekstrakti 2 uri pri 37 °C, 5 % CO2.
Tkivo debelega črevesa smo homogenizirali s PBS, ravni citokinov IL-6, TNF-α in IL-1β v tkivu debelega črevesa pa smo določili z uporabo kompletov za testiranje luminex ELISA (R&D systems, Minneapolis, MN, ZDA). Prav tako smo ravni GLP-1 v serumu in gojišču primarnih mišjih epitelijskih celic debelega črevesa določili z uporabo kompleta ELISA (Bioswamp, Wuhan, Kitajska) v skladu z navodili proizvajalca.
Celotna DNK iz blata je bila ekstrahirana z uporabo kompleta za ekstrakcijo DNK (Tiangen, Kitajska). Kakovost in količina DNK sta bili izmerjeni pri razmerjih 260 nm/280 nm oziroma 260 nm/230 nm. Nato sta bila vsaka ekstrahirana DNK kot predloga uporabljena s specifičnimi primerji 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) in 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) za amplifikacijo regij V3-V4 gena 16S rRNA v različnih regijah. Produkti PCR so bili očiščeni z uporabo kompleta za ekstrakcijo z gelom QIAquick (QIAGEN, Nemčija), kvantificirani s PCR v realnem času in sekvencirani z uporabo platforme za sekvenciranje IlluminaMiseq PE300 (Illumina Inc., Kalifornija, ZDA). Za bioinformatsko analizo je bila obdelava podatkov izvedena po predhodno objavljenih protokolih.21,22 Skratka, za filtriranje surovih ekspresnih datotek je bil uporabljen Cutadapt (V1.9.1). OTU-ji so bili združeni v skupine z uporabo UPARSE (različica 7.0.1001) z mejo podobnosti 97 %, za odstranitev himernih zaporedij pa je bil uporabljen UCHIME. Analiza in klasifikacija sestave skupnosti sta bili izvedeni z uporabo klasifikatorja RDP (http://rdp.cme.msu.edu/), ki temelji na podatkovni bazi genov ribosomske RNA SILVA.
Ravni kratkoverižnih maščobnih kislin (ocetne kisline, propionske kisline in maslene kisline) so bile izmerjene, kot so predhodno opisali Tao in sod., z nekaj spremembami.23 Na kratko, 100 mg blata so najprej suspendirali v 0,4 ml deionizirane vode, nato v 0,1 ml 50 % žveplove kisline in 0,5 ml 2-etilmaslene kisline (interni standard), nato homogenizirali in segreli pri 4 °C. Centrifugirajte pri 12.000 vrt/min 15 minut pri 50 °C. Supernatant smo ekstrahirali z 0,5 ml etra in vbrizgali v plinski kromatograf (GC) za analizo. Za analizo s plinsko kromatografijo (GC) smo vzorce analizirali z uporabo plinskega kromatografa GC-2010 Plus (Shimadzu, Inc.), opremljenega s plamensko ionizacijskim detektorjem (FID). Ločevanje smo dosegli z uporabo kolone ZKAT-624, 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., Kitajska). Podatki so bili pridobljeni z uporabo programske opreme za GC raztopine (Shimadzu, Inc.). Razmerje delitve je bilo 10:1, nosilni plin je bil dušik, pretok pa 6 ml/min. Volumen vbrizga je bil 1 μL. Temperatura injektorja in detektorja je bila 300 °C. Temperatura pečice je bila 13,5 minute vzdrževana pri 140 °C, nato pa se je povečala na 250 °C s hitrostjo 120 °C/min; temperatura se je vzdrževala 5 minut.
Podatki so predstavljeni kot povprečje ± standardna napaka povprečja (SEM). Pomembnost podatkov je bila ocenjena z enosmerno ANOVA, ki ji je sledil Duncanov test večkratnih območij. Za vse izračune je bila uporabljena programska oprema GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, Kalifornija, ZDA), vrednost p < 0,05 pa je bila ocenjena kot statistično pomembna.
Dobro je znano, da je ulcerozni kolitis kronična recidivna kolitisna bolezen s hudimi bolečinami v trebuhu, drisko in krvavitvami. Zato je bil za oceno učinkovitosti BLG proti kolitisu pri miših vzpostavljen kronični recidivni kolitis, ki ga povzroča DSS (slika 1A). V primerjavi s kontrolno skupino so imele miši v modelni skupini DSS znatno zmanjšano telesno težo in višji DAI, te spremembe pa so se po 24 dneh zdravljenja z BLG znatno odpravile (slika 1B in C). Skrajšanje debelega črevesa je pomemben znak ulceroznega kolitisa. Kot je prikazano na slikah 1D in E, se je dolžina debelega črevesa pri miših, ki so prejemale DSS, znatno skrajšala, vendar jo je zdravljenje z BLG olajšalo. Nato je bila opravljena histopatološka analiza za oceno vnetja debelega črevesa. Slike, obarvane s H&E, in patološki rezultati so pokazali, da je dajanje DSS znatno motilo arhitekturo debelega črevesa in povzročilo uničenje kript, medtem ko je zdravljenje z BLG znatno zmanjšalo uničenje kript in patološke rezultate (slika 1F in G). Omeniti velja, da je bil zaščitni učinek BLG v odmerku 1 g/kg primerljiv z zaščitnim učinkom SASP v odmerku ... 200 mg/kg. Te ugotovitve skupaj kažejo, da je BLG učinkovit pri zmanjševanju resnosti kroničnega recidivnega kolitisa, ki ga povzroča DSS, pri miših.
TNF-α, IL-1β in IL-6 so pomembni vnetni označevalci vnetja debelega črevesa. Kot je prikazano na sliki 2A, je DSS povzročil znatno povečanje izražanja genov TNF-α, IL-1β in IL-6 v debelem črevesu v primerjavi s kontrolno skupino. Uporaba BLG lahko znatno obrne te spremembe, ki jih povzroča DSS. Nato smo z ELISA testom določili ravni vnetnih citokinov TNF-α, IL-1β in IL-6 v tkivu debelega črevesa. Rezultati so tudi pokazali, da so bile ravni TNF-α, IL-1β in IL-6 v debelem črevesu znatno povečane pri miših, zdravljenih z DSS, medtem ko je zdravljenje z BLG to povečanje ublažilo (slika 2B).
Slika 2 BLG zavira izražanje genov in nastajanje provnetnih citokinov TNF-α, IL-1β in IL-6 v debelem črevesu miši, zdravljenih z DSS. (A) Izražanje genov TNF-α, IL-1β in IL-6 v debelem črevesu; (B) ravni beljakovin TNF-α, IL-1β in IL-6 v debelem črevesu. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SEM (n = 4–6). #p < 0,05 ali ##p < 0,01 ali ###p < 0,001 v primerjavi s kontrolno (Con) skupino; *p < 0,05 ali **p < 0,01 v primerjavi s skupino DSS.
Črevesna disbioza je ključnega pomena pri patogenezi ulceroznega kolitisa.24 Da bi raziskali, ali BLG modulira črevesno mikrobioto miši, zdravljenih z DSS, je bilo izvedeno sekvenciranje 16S rRNA za analizo bakterijske skupnosti črevesne vsebine. Vennov diagram kaže, da si tri skupine delijo 385 OTU-jev. Hkrati je imela vsaka skupina edinstvene OTU-je (slika 3A). Poleg tega sta indeks Chao1 in Shannonov indeks, prikazana na sliki 3B in C, pokazala, da se je raznolikost skupnosti črevesne mikrobiote pri miših, zdravljenih z BLG, zmanjšala, saj se je Shannonov indeks v skupini, zdravljeni z BLG, znatno zmanjšal. Za določitev vzorcev združevanja med tremi skupinami sta bili uporabljeni analiza glavnih komponent (PCA) in analiza glavnih koordinat (PCoA), ki sta pokazali, da je bila struktura skupnosti miši, zdravljenih z DSS, po zdravljenju z BLG jasno ločena (slika 3D in E). Ti podatki kažejo, da je zdravljenje z BLG pomembno vplivalo na strukturo skupnosti miši s kolitisom, ki ga povzroča DSS.
Slika 3 BLG spreminja raznolikost črevesne mikrobiote pri miših s kolitisom, povzročenim z DSS. (A) Vennov diagram OTU, (B) indeks Chao1, (C) Shannonov indeks bogastva, (D) graf rezultatov analize glavnih komponent (PCA) OTU, (E) rezultat analize glavnih koordinat (PCoA) OTU. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SEM (n = 6).**p < 0,01 v primerjavi s skupino DSS.
Za oceno specifičnih sprememb v fekalni mikrobioti smo analizirali sestavo črevesne mikrobiote na vseh taksonomskih ravneh. Kot je prikazano na sliki 4A, so bile glavne debla v vseh skupinah Firmicutes in Bacteroidetes, sledili pa so jim Verrucomicrobia. Relativna številčnost Firmicutes in razmerja Firmicutes/Bacteroidetes so se v fekalnih mikrobnih združbah miši, zdravljenih z DSS, znatno povečala v primerjavi s kontrolnimi mišmi, te spremembe pa so se po zdravljenju z BLG znatno obrnile. Zlasti zdravljenje z BLG je znatno povečalo relativno številčnost Verrucobacterium v ​​blatu miši s kolitisom, povzročenim z DSS. Na ravni gospodinjstev so fekalne mikrobne združbe zasedale Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae in Prevotellaceae (slika 4B). V primerjavi s skupino DSS je izčrpavanje BLG povečalo številčnost Akkermansiaceae, vendar zmanjšalo številčnost Lachnospiraceae in Ruminococcaceae. Na ravni rodu je bilo Fekalno mikrobioto so zasedale Lachnospira_NK4A136_group, Akkermansia in Prevotellaceae_UCG-001 (slika 4C). Ta ugotovitev je tudi pokazala, da je zdravljenje z BLG učinkovito odpravilo neravnovesje mikrobiote kot odziv na izziv DSS, za katerega je značilno zmanjšanje skupine Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas in Oscillibacter ter povečanje Akkermansia in Prevotellaceae_UCG-001.
Slika 4 BLG spremeni številčnost črevesne mikrobiote pri miših s kolitisom, povzročenim z DSS. (A) Številčnost črevesne mikrobiote na ravni debla; (B) Številčnost črevesne mikrobiote na ravni družine; (C) Številčnost črevesne mikrobiote na ravni rodu. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SEM (n = 6). #p < 0,05 ali ###p < 0,001 v primerjavi s kontrolno (Con) skupino; *p < 0,05 ali **p < 0,01 ali ***p < 0,001 v primerjavi s kontrolno (Con) skupino.
Glede na to, da so kratkoverižne maščobne kisline (SCFA) glavni presnovki Akkermansie in Prevotellaceae_UCG-001, medtem ko so acetat, propionat in butirat najpogostejše SCFA v črevesnem lumnu,25-27 smo še vedno v naši študiji. Kot je prikazano na sliki 5, so bile koncentracije acetata, propionata in butirata v blatu v skupini, zdravljeni z DSS, znatno zmanjšane, medtem ko je zdravljenje z BLG lahko to zmanjšanje v veliki meri zavrlo.
Slika 5. BLG zviša raven kratkolančnih maščobnih kislin v blatu miši s kolitisom, povzročenim z DSS. (A) Vsebnost ocetne kisline v blatu; (B) vsebnost propionske kisline v blatu; (C) vsebnost maslene kisline v blatu. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SEM (n = 6). #p < 0,05 ali ##p < 0,01 v primerjavi s kontrolno (Con) skupino; *p < 0,05 ali **p < 0,01 v primerjavi s skupino DSS.
Nadalje smo izračunali Pearsonov korelacijski koeficient med diferencialnimi kratkolančnimi maščobnimi kislinami na ravni rodu in fekalno mikrobioto. Kot je prikazano na sliki 6, je bila Akkermansia pozitivno povezana s proizvodnjo propionske kisline (Pearson = 0,4866) in maslene kisline (Pearson = 0,6192). Nasprotno pa sta bila tako Enteromonas kot Oscillobacter negativno povezana s proizvodnjo acetata, s Pearsonovim koeficientom 0,4709 oziroma 0,5104. Podobno je bila Ruminococcaceae_UCG-014 negativno povezana s proizvodnjo propionske kisline (Pearson = 0,4508) oziroma maslene kisline (Pearson = 0,5842).
Slika 6 Pearsonova korelacijska analiza med diferencialnimi kratkolančnimi maščobnimi kislinami (SCFA) in kolonskimi mikrobi. (A) Enteromonas z ocetno kislino; (B) Bacil pretresa možganov z ocetno kislino; (C) Akkermansia proti propionski kislini; (D) Ruminococcus_UCG-014 s propionsko kislino; (E) Akkermansia z masleno kislino; (F) Ruminococcus _UCG-014 z masleno kislino.
Glukagonu podoben peptid-1 (GLP-1) je celično specifičen posttranslacijski produkt proglukagona (Gcg) s protivnetnimi lastnostmi.28 Kot je prikazano na sliki 7, je DSS povzročil znatno zmanjšanje izražanja mRNA Gcg. Zdravljenje z debelim črevesom in BLG je lahko znatno obrnilo zmanjšanje Gcg, ki ga je povzročil DSS, v primerjavi s kontrolno skupino (slika 7A). Hkrati se je raven GLP-1 v serumu v skupini, zdravljeni z DSS, znatno zmanjšala, zdravljenje z BLG pa je lahko v veliki meri preprečilo to zmanjšanje (slika 7B). Ker lahko kratkoverižne maščobne kisline stimulirajo izločanje GLP-1 z aktivacijo receptorja 43, sklopljenega z G-proteinom (GRP43), in receptorja 41, sklopljenega z G-proteinom (GRP41), smo preučili tudi GPR41 in GRP43 v debelem črevesu miši s kolitisom in ugotovili, da se je izražanje mRNA GRP43 in GPR41 v debelem črevesu po izzivu z DSS znatno zmanjšalo, zdravljenje z BLG pa je lahko učinkovito rešilo ta zmanjšanja (slika 7C in D).
Slika 7 BLG poveča raven GLP-1 v serumu in izražanje mRNA Gcg, GPR41 in GRP43 v debelem črevesu pri miših, zdravljenih z DSS. (A) Izražanje mRNA Gcg v tkivu debelega črevesa; (B) Raven GLP-1 v serumu; (C) Izražanje mRNA GPR41 v tkivu debelega črevesa; (D) Izražanje mRNA GPR43 v tkivu debelega črevesa. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SEM (n = 5–6). #p < 0,05 ali ##p < 0,01 v primerjavi s kontrolno (Con) skupino; *p < 0,05 v primerjavi s skupino DSS.
Ker je zdravljenje z BLG lahko povečalo raven GLP-1 v serumu, izražanje mRNA Gcg v debelem črevesu in raven SCFA v blatu pri miših, zdravljenih z DSS, smo nadalje preučili sproščanje GLP-1 iz primarnih mišjih epitelijskih celic debelega črevesa in pri miših, zdravljenih z DSS, ter pri miših s kolitisom DSS (F-Con) in miših s kolitisom, zdravljenih z BLG (F-BLG). Kot je prikazano na sliki 8A, so primarne mišje epitelijske celice debelega črevesa, zdravljene z 2 mM ocetno kislino, propionsko kislino oziroma masleno kislino, znatno spodbudile sproščanje GLP-1, kar je skladno s prejšnjimi študijami.29,30 Prav tako so vse F-Con, F-DSS in F-BLG (kar ustreza 0,25 g blata) močno spodbudile sproščanje GLP-1 iz primarnih mišjih epitelijskih celic debelega črevesa. Omeniti velja, da je bila količina GLP-1, ki so jo sprostile primarne mišje epitelijske celice debelega črevesa, zdravljene z F-DSS, veliko nižja kot pri primarnih miših, zdravljenih z F-Con in F-BLG. epitelijske celice debelega črevesa (slika 8B). Ti podatki kažejo, da je zdravljenje z BLG znatno obnovilo črevesno proizvodnjo GLP-1, ki izvira iz SCFA.
Slika 8 SCFA, pridobljene iz BLG, spodbujajo sproščanje GLP-1 iz primarnih mišjih epitelijskih celic debelega črevesa. (A) Ocetna kislina, propionska kislina in maslena kislina so spodbudile sproščanje GLP-1 iz primarnih mišjih epitelijskih celic debelega črevesa; (B) fekalni ekstrakti F-Con, F-DSS in F-BLG so stimulirali primarne mišje epitelijske celice debelega črevesa. Količina sproščenega GLP-1. Alikvote kolonskih epitelijskih celic smo dali v petrijevke s steklenim dnom in obdelali z 2 mM ocetno kislino, propionsko kislino, masleno kislino in fekalnimi ekstrakti F-Con, F-DSS in F-BLG (kar ustreza 0,25 g blata). 2 uri pri 37 °C, 5 % CO2. Količina GLP-1, sproščenega iz primarnih mišjih epitelijskih celic debelega črevesa, je bila zaznana z ELISA. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SEM (n = 3). #p < 0,05 ali ##p < 0,01 v primerjavi s slepo vrednostjo ali F-Con; *p < 0,05 v primerjavi z F-DSS.
Okrajšave: Ace, ocetna kislina; Pro, propionska kislina; vendar maslena kislina; F-Con, fekalni izvleček kontrolnih miši; F-DSS, fekalni izvleček miši s kolitisom; F-BLG, iz BLG-obdelanega debelega črevesa; fekalni izvlečki vnetnih miši.
Ulcerozni kolitis, ki ga je Svetovna zdravstvena organizacija uvrstila med odporne bolezni, postaja globalna nevarnost; Vendar pa so učinkovite metode za napovedovanje, preprečevanje in zdravljenje bolezni še vedno omejene. Zato je nujno treba raziskati in razviti nove varne in učinkovite terapevtske strategije za ulcerozni kolitis. Pripravki tradicionalne kitajske medicine so obetavna možnost, saj se je za številne pripravke tradicionalne kitajske medicine skozi stoletja izkazalo, da so učinkoviti pri zdravljenju ulceroznega kolitisa pri kitajski populaciji, vsi pa so biološke organske snovi in ​​naravni materiali, ki so večinoma neškodljivi za ljudi in živali.31,32 Namen te študije je bil najti varen in učinkovit pripravek tradicionalne kitajske medicine za zdravljenje ulceroznega kolitisa in raziskati njegov mehanizem delovanja. BLG je dobro znana kitajska zeliščna formula, ki se uporablja za zdravljenje gripe.8,33 Delo v našem laboratoriju in drugih je pokazalo, da indigo, predelan izdelek tradicionalne kitajske medicine iz iste surovine kot BLG, kaže znatno učinkovitost pri zdravljenju ulceroznega kolitisa pri ljudeh in živalih.4,34 Vendar pa učinki BLG proti kolitisu in njegov mehanizem niso jasni. V trenutni študiji naši rezultati kažejo, da BLG učinkovito zmanjšuje vnetje debelega črevesa, ki ga povzroča DSS, kar je povezano z modulacijo črevesne mikrobiote. in obnova proizvodnje GLP-1, ki izvira iz črevesja.
Dobro je znano, da je za ulcerozni kolitis značilna obdobja recidivov s tipičnimi kliničnimi značilnostmi, kot so izguba teže, driska, krvavitev iz rektuma in obsežna poškodba sluznice debelega črevesa.35 Tako so kronični recidivni kolitis dajali s tremi cikli 1,8 % DSS pet dni, ki jim je sledilo sedem dni pitja vode. Kot je prikazano na sliki 1B, so nihajoča izguba teže in rezultati DAI kazali na uspešno indukcijo kroničnega recidivnega kolitisa. Miši v skupini, zdravljeni z BLG, so od 8. dne pokazale okrevanje navzgor, kar se je bistveno razlikovalo od 24. dne. Iste spremembe so bile opažene tudi pri rezultatu DAI, kar kaže na izboljšanje kliničnega stanja kolitisa. Kar zadeva poškodbo debelega črevesa in vnetno stanje, so se po zdravljenju z BLG močno izboljšali tudi dolžina debelega črevesa, poškodba tkiva debelega črevesa ter izražanje in proizvodnja genov provnetnih citokinov TNF-α, IL-1β in IL-6 v tkivu debelega črevesa. Ti rezultati skupaj jasno kažejo, da je BLG učinkovit pri zdravljenju kroničnega recidivnega kolitisa pri miših.
Kako BLG izvaja svoje farmakološke učinke? Številne predhodne študije so pokazale, da ima črevesna mikrobiota ključno vlogo pri patogenezi ulceroznega kolitisa, terapije, ki temeljijo na mikrobiomu in so usmerjene na mikrobiom, pa so se izkazale kot zelo privlačna strategija za zdravljenje ulceroznega kolitisa. V tej študiji smo pokazali, da je zdravljenje z BLG povzročilo pomembne spremembe v sestavi črevesne mikrobiote, kar kaže na to, da je zaščitni učinek BLG proti kolitisu, ki ga povzroča DSS, povezan z modulacijo črevesne mikrobiote. To opažanje je skladno z idejo, da je reprogramiranje homeostaze črevesne mikrobiote pomemben pristop k razumevanju učinkovitosti pripravkov TCM.36,37 Predvsem je Akkermansia gramnegativna in strogo anaerobna bakterija, ki živi v sluzni plasti črevesja, razgrajuje mucine, proizvaja propionsko kislino, spodbuja diferenciacijo vrčastih celic in vzdržuje funkcijo celovitosti pregrade sluznice.26 Več kliničnih in živalskih podatkov kaže, da je Akkermansia močno povezana z zdravo sluznico,38 in peroralno dajanje Akkermansia spp. lahko znatno izboljša vnetje sluznice.39 Naši trenutni podatki kažejo, da se relativna številčnost Akkermansie po zdravljenju z BLG znatno poveča. Poleg tega je Prevotellaceae_UCG-001 bakterija, ki proizvaja SCFA.27 Več študij je pokazalo, da je bil Prevotellaceae_UCG-001 prisoten v nizki relativni številčnosti v blatu živali s kolitisom.40,41 Naši trenutni podatki kažejo tudi, da lahko zdravljenje z BLG znatno poveča relativno številčnost Prevotellaceae_UCG-001 v debelem črevesu miši, zdravljenih z DSS. Nasprotno pa je Oscillibacter mezofilna, strogo anaerobna bakterija.42 je poročal, da se je relativna številčnost Oscillibacterja znatno povečala pri miših z UC in je bila pomembno pozitivno korelirana z ravnmi IL-6 in IL-1β ter patološkimi rezultati.43,44 Omeniti velja, da je zdravljenje z BLG znatno zmanjšalo relativno številčnost Oscillibacterja v blatu miši, zdravljenih z DSS. Omeniti velja, da so bile te bakterije, spremenjene z BLG, najbolj bakterije, ki proizvajajo SCFA. Številne prejšnje študije so pokazale potencialne koristne učinke SCFA. na vnetje debelega črevesa in zaščito celovitosti črevesnega epitelija.45,46 Naši trenutni podatki so tudi pokazali, da so se koncentracije acetata, propionata in butirata SCFA v blatu, zdravljenem z DSS, močno povečale pri miših, zdravljenih z BLG. Skupaj te ugotovitve jasno kažejo, da lahko zdravljenje z BLG učinkovito poveča bakterije, ki proizvajajo SCFA, ki jih povzroča DSS, pri miših s kroničnim recidivnim kolitisom.
GLP-1 je inkretin, ki se proizvaja predvsem v ileumu in debelem črevesu ter ima pomembno vlogo pri odlašanju praznjenja želodca in zniževanju postprandialne glukoze v krvi.47 Dokazi kažejo, da lahko dipeptidil peptidaza (DPP)-4, agonist receptorja GLP-1, in nanomedicina GLP-1 učinkovito ublažijo vnetje črevesja pri miših.48-51 Kot je bilo poročano v prejšnjih študijah, so bile visoke koncentracije SCFA povezane z ravnmi GLP-1 v plazmi pri ljudeh in miših.52 Naši trenutni podatki kažejo, da so se po zdravljenju z BLG serumske ravni GLP-1 in izražanje mRNA Gcg znatno povečale. Prav tako se je izločanje GLP-1 znatno povečalo v kulturah debelega črevesa po stimulaciji z izvlečki blata miši s kolitisom, zdravljenih z BLG, v primerjavi s stimulacijo z izvlečki blata miši s kolitisom, zdravljenih z DSS.Kako SCFA vplivajo na sproščanje GLP-1?Gwen Tolhurst et al. poročali, da lahko SCFA stimulirajo izločanje GLP-1 preko GRP43 in GPR41.29 Naši trenutni podatki tudi kažejo, da zdravljenje z BLG znatno poveča izražanje mRNA GRP43 in GPR41 v debelem črevesu miši, zdravljenih z DSS. Ti podatki kažejo, da lahko zdravljenje z BLG obnovi proizvodnjo GLP-1, ki jo spodbuja SCFA, z aktivacijo GRP43 in GPR41.
BLG je dolgoročno zdravilo brez recepta (OTC) na Kitajskem. Največji tolerirani odmerek BLG pri miših iz Kunminga je 80 g/kg, akutne toksičnosti pa niso opazili.53 Trenutno je priporočeni odmerek BLG (brez sladkorja) pri ljudeh 9–15 g/dan (3-krat na dan). Naša študija je pokazala, da je BLG v odmerku 1 g/kg izboljšal kronični recidivni kolitis, ki ga je povzročil DSS, pri miših. Ta odmerek je blizu odmerku BLG, ki se uporablja klinično. Naša študija je tudi ugotovila, da njegov mehanizem delovanja vsaj delno posredujejo spremembe v črevesni mikrobioti, zlasti bakterije, ki proizvajajo SCFA, kot sta Akkermansia in Prevotellaceae_UCG-001, da se obnovi proizvodnja GLP-1 iz črevesja. Te ugotovitve kažejo, da si BLG zasluži nadaljnjo obravnavo kot potencialno terapevtsko sredstvo za klinično zdravljenje kolitisa. Vendar pa natančen mehanizem, s katerim modulira črevesno mikrobioto, še ni potrjen z mišmi s pomanjkanjem mikrobiote in presaditvijo fekalnih bakterij.
Ace, ocetna kislina; but, maslena kislina; BLG, pandan; DSS, dekstran natrijev sulfat; DAI, indeks aktivnosti bolezni; DPP, dipeptidil peptidaza; FID, plamensko-ionizacijski detektor; F-Con, kontrola; Fekalni ekstrakti miši; F-DSS, fekalni ekstrakti miši s kolitisom DSS; F-BLG, fekalni ekstrakti miši s kolitisom, zdravljenih z BLG; GLP-1, glukagonu podoben peptid-1; Gcg, glukagon; plinska kromatografija, plinska kromatografija; GRP43, receptor, sklopljen z G proteinom 43; GRP41, receptor, sklopljen z G proteinom 41; H&E, hematoksilin-eozin; HBSS, Hanksova uravnotežena solna raztopina; OTC, OTC; PCA, analiza glavnih komponent; PCoA, analiza glavnih koordinat; Pro, propionska kislina; SASP, sulfasalazin; SCFA, kratkoverižne maščobne kisline; kitajska medicina, tradicionalna kitajska medicina; UC, ulcerozni kolitis.
Vse eksperimentalne protokole je odobril Odbor za etiko živali Univerze v Pekingu, Medicinskega centra za znanost in tehnologijo Univerze v Shenzhenu v Hong Kongu (Shenzhen, Kitajska) v skladu z institucionalnimi smernicami in predpisi o živalih (etika številka A2020157).
Vsi avtorji so pomembno prispevali k zasnovi in ​​oblikovanju, pridobivanju podatkov ali analizi in interpretaciji podatkov; sodelovali so pri pisanju osnutka članka ali kritični reviziji pomembne intelektualne vsebine; strinjali so se z oddajo rokopisa v trenutno revijo; končno so odobrili različico za objavo; bili so odgovorni za vse vidike dela.
To delo so podprli Nacionalna fundacija za naravoslovje Kitajske (81560676 in 81660479), prvovrstni projekt Univerze v Shenzhenu (86000000210), Sklad odbora za inovacije v znanosti in tehnologiji v Shenzhenu (JCYJ20210324093810026) in Sklad za raziskave v medicinski znanosti in tehnologiji province Guangdong (A2020157 in A2020272), Lekarna Medicinske univerze Guizhou province Guizhou, ki jo financira Key Laboratory (YWZJ2020-01), in Bolnišnica Pekinške univerze v Shenzhenu (JCYJ2018009).
1. Tang B, Zhu J, Zhang B in sod. Terapevtski potencial triptolida kot protivnetnega sredstva pri eksperimentalnem kolitisu, povzročenem z dekstran natrijevim sulfatom, pri miših. pre-immune.2020;11:592084.doi: 10.3389/fimmu.2020.592084
2. Kaplan GG. Globalno breme KVČB: od 2015 do 2025. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2015; 12: 720–727. doi: 10.1038/nrgastro.2015.150
3. Peng J, Zheng TT, Li Xue in sod. Rastlinski alkaloidi: obetavni modifikatorji bolezni pri vnetni črevesni bolezni. Prepharmacology. 2019; 10: 351. doi: 10.3389/fphar. 2019.00351
4. Xiao Haiteng, Peng Jie, Wen B in sod. Indigo Naturalis zavira oksidativni stres v debelem črevesu in odzive Th1/Th17 pri kolitisu, ki ga povzroča DSS pri miših. Oxid Med Cell Longev. 2019; 2019: 9480945. doi: 10.1155/2019/9480945
5. Chen M, Ding Y, Tong Z. Učinkovitost in varnost kitajskega zeliščnega zdravila Sophora flavescens (Sophora flavescens) pri zdravljenju ulceroznega kolitisa: klinični dokazi in možni mehanizmi. Prepharmacology.2020;11:603476.doi:10.3389/fphar.2020.603476
6. Cao Fang, Liu Jie, Sha Benxing, Pan HF. Naravni izdelki: eksperimentalno učinkovita zdravila za zdravljenje vnetne črevesne bolezni. Curr Pharmaceuticals. 2019; 25: 4893–4913. doi: 10.2174/1381612825666191216154224
7. Zhang C, Jiang M, Lu A. Razmišljanja o adjuvantnem zdravljenju ulceroznega kolitisa s tradicionalno kitajsko medicino. Clinical Rev Allergy Immunization. 2013;44:274–283.doi: 10.1007/s12016-012-8328-9
8. Li Zhongteng, Li Li, Chen TT in sod. Učinkovitost in varnost granul Banlangen pri zdravljenju sezonske gripe: protokol študije za randomizirano kontrolirano preskušanje. trial.2015;16:126.doi: 10.1186/s13063-015-0645-x