Hvala, ker ste obiskali Nature.com. Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS. Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali izklopite način združljivosti v Internet Explorerju). Medtem bomo za zagotovitev nadaljnje podpore spletno mesto prikazali brez slogov in JavaScripta.
Za razliko od vretenčarjev velja splošno prepričanje, da žuželke nimajo spolnih steroidnih hormonov, ki so odvisni od samcev. Pri Anopheles gambiae se zdi, da se je ekdizonski steroid 20-hidroksiekdizon (20E) razvil tako, da nadzoruje razvoj jajčec, ko ga sintetizirajo samice2, in da sproži obdobje parjenja, ko ga samci spolnijo3. Ker sta razvoj jajčec in parjenje bistveni reproduktivni lastnosti, bi lahko razumevanje, kako samice komarjev Anopheles integrirajo te hormonske signale, olajšalo oblikovanje novih programov za nadzor malarije. Tukaj razkrivamo, da te reproduktivne funkcije uravnavajo različni spolni steroidi prek kompleksne mreže encimov, ki aktivirajo/inaktivirajo ekdisteroide. Identificirali smo oksidiran ekdizon, specifičen za samce, 3-dehidro-20E (3D20E), ki ščiti starševstvo tako, da po spolnem prenosu in aktivaciji z defosforilacijo izklopi spolno receptivnost samic. Omeniti velja, da je prenos 3D20E povzročil tudi izražanje reproduktivnih genov, ki ohranjajo razvoj jajčec med okužbo s plazmodijem, kar zagotavlja zdravje okuženih samic. 20E, ki ga pridobivajo samice, ne povzroča spolnega odziva. vendar omogoča parjenju posameznikov, da odložijo jajčeca, potem ko so kinaze, ki zavirajo 20E, inhibirane. Identifikacija tega samčevo specifičnega insekticidnega hormona in njegova vloga pri uravnavanju spolne dovzetnosti samic, plodnosti in interakcije s plazmodijem kaže na potencial za zmanjšanje reproduktivnega uspeha komarjev, ki prenašajo malarijo.
Število primerov in smrti zaradi malarije ponovno narašča4 zaradi razširjene odpornosti na insekticide pri komarjih vrste Anopheles, edinih prenašalcev malarije pri ljudeh. Biologija parjenja teh komarjev je še posebej privlačna tarča za nove ukrepe za nadzor malarije, saj se samice parijo le enkrat5; če bi bil ta enkratni paritveni dogodek sterilni, bi to imelo velik potencial za zmanjšanje populacij komarjev na terenu.
Ženske postanejo spolno nesposobne po prejemu visokih titrov steroidnih hormonov od moških. Študije so pokazale, da je sprožilec težav pri nadaljnjem parjenju 20-hidroksiekdizon (20E), steroidni hormon, bolj znan kot regulator cikla levitve v larvalni fazi. Sposobnost samcev za sintezo in prenos 20E se je razvila posebej pri vrstah Anopheles, ki spadajo v podrod Cellia7, ki je razširjen v Afriki in vključuje najnevarnejše prenašalce malarije, vključno z Anopheles gambiae. To je še posebej omembe vredno, ker pri teh vrstah samice po vsakem obroku krvi proizvajajo tudi 20E, 20E pa poganja cikel oogeneze (glej ref. 8). Vendar pa je malo znanega o tem, kako samice integrirajo signale iz dveh različnih virov ekdizona (prenos samcev in indukcija hranjenja s krvjo), ne da bi pri tem ogrozile svojo sposobnost parjenja. Pravzaprav, če 20E, ki ga proizvajajo samice, sproži spolno intoleranco, bo to pri posameznikih, ki se hranijo device, povzročilo neplodnost, kar je zelo pogosto vedenje pri teh komarjih5.
Možna razlaga je, da samci A. gambiae prenašajo modificiran ekdizon, specifičen za samce, ki aktivira signalno kaskado v ženskem reproduktivnem traktu, kar povzroči nestabilnost pri parjenju. Vendar pa imajo vretenčarji, čeprav imajo več steroidnih hormonov, kot sta estrogen in androgen (pregledano v ref. 9), po našem vedenju pri žuželkah niso odkrili steroidov, ki bi bili pod vplivom androgenov.
Odločili smo se za določitev repertoarja steroidnih hormonov v moški pomožni žlezi (MAG) spolno zrele A. gambiae, da bi našli morebitne modificirajoče steroide. Z uporabo visokozmogljive tekočinske kromatografije v kombinaciji s tandemsko masno spektrometrijo (HPLC-MS/MS) namesto manj specifične metode, ki smo jo uporabljali prej, smo v tem tkivu odkrili ekdizon (E) in 20E, kar je potrdilo prejšnji rezultat. Vendar pa so v vzorcu prevladovali oksidirani fosforilirani steroidi, ki so skladni s formulo 3-dehidro-20E-22-fosfat (3D20E22P)12 (slika 1). Druge oblike vključujejo 3-dehidro-20E (3D20E) in 20E-22-fosfat (20E22P). Intenzivnost signala HPLC-MS/MS 3D20E22P je bila za dva velikostna reda višja od njegove defosforilirane oblike, 3D20E, in za tri velikostne rede višja od intenzivnosti E in 20E (slika 1). Čeprav je bila v drugih delih telesa in spodnjem reproduktivnem traktu (LRT; razširjeni podatki, slika 1a). Analizirali smo tudi ekdisteroide pri novo zaprtih (<1 dan starih) samcih in samicah ter odkrili 3D20E in 3D20E22P samo v MAG; E, 20E in 20E22P so bili prisotni pri obeh spolih (razširjeni podatki, slika 1b). Ti podatki kažejo, da odrasli samci A. gambiae proizvajajo visoke titre modificirajočih hormonov v svojih MAG, ki jih samice ne sintetizirajo.
MAG in samice LRT (vključno s preddvori, semenskimi mehurčki in parovarijem) so bile secirane iz 4 dni starih (4 dni starih) deviških samcev in deviških ter parjenih samic (0,5, 3 in 12 hpm). Ekdizon v teh tkivih je bil analiziran s HPLC-MS/MS (povprečje ± sem; neparni t-test, dvostranski, popravljen za stopnjo lažnih odkritij (FDR); NS, ni statistično značilno; *P < 0,05, **P < 0,01). 3D20E: 3 ure v primerjavi z 0,5 ure, P = 0,035; 12 ur v primerjavi s 3 urami, P = 0,0015; 12 ur v primerjavi z 0,5 ure, P = 0,030. 3D20E22P: 3 ure v primerjavi z 0,5 ure, P = 0,25; 12 ur v primerjavi s 3 urami, P = 0,0032; 12 ur v primerjavi z 0,5 ure, P = 0,015). Podatki so iz treh bioloških ponovitev. Površina vrha za vsak ekdizon, ki nas zanima, je bila izračunana in normalizirana glede na število komarjev. Ekdizon je predstavljen z naslednjimi barvami: E, zelena; 20E, oranžna; 20E22P, vijolična; 3D20E, modra; 3D20E22P, roza. Vstavljeni del poveča lestvico na osi y, da prikaže nižje ravni ekdizona.
Da bi raziskali, ali se 3D20E22P in 3D20E prenašata med parjenjem, smo secirali ženske LRT v različnih časovnih točkah po parjenju. Čeprav ekdizona pri devicah nismo našli, smo v LRT takoj po parjenju (0,5 ure po parjenju, hpm) opazili znatne količine 3D20E22P, ki so se sčasoma zmanjševale, medtem ko so se ravni 3D20E znatno povečale (slika 1). Z uporabo kemično sintetiziranega 3D20E kot standarda smo ugotovili, da so bile ravni tega steroidnega hormona v parjenih LRT vsaj 100-krat višje od 20E (razširjena tabela podatkov 1). Tako je 3D20E22P glavni moški ekdizon, ki se med parjenjem prenese v ženski LRT, njegova defosforilirana oblika, 3D20E, pa postane zelo obilna kmalu po parjenju. To kaže na pomembno vlogo slednjega ekdizona v biologiji samic po parjenju.
Po ustvarjanju novega nabora podatkov za sekvenciranje RNA (RNA-seq) (slika 2a) smo z uporabo posebej izdelanega bioinformatičnega cevovoda iskali gen za ekdizon kinazo (EcK), ekdizon oksidazo (EO) in ekdizon, ki kodira 20E-modificirano fosfatazo. EPP) se izraža v reproduktivnih tkivih. Identificirali smo en kandidatni gen za EPP in dva potencialna gena za EcK (EcK1 in EcK2), vendar nismo mogli najti dobrega kandidatnega gena za EO. Omeniti velja, da so bili posamezni geni EPP izraženi v visokih ravneh (98,9. percentil) v gambijskih MAG, ne pa tudi v ženskih LRT (slika 2b), kar je v nasprotju z našimi pričakovanji, saj je v tem ženskem tkivu prišlo do defosforilacije 3D20E22P. Zato menimo, da se moški EPP lahko prenese med parjenjem. Dejansko smo uporabili označevanje s stabilnimi izotopi in vivo, da bi prikrili ženski protein po parjenju, encim, ki ga je MS identificiral v ženskem atriju (slika 2c in dodatna tabela 1). Prisotnost EPP pri MAG in parjenih (vendar ne deviških) samicah LRT je bil potrjen tudi z uporabo specifičnih protiteles (slika 2d).
a, Po meri zgrajen bioinformatični cevovod za iskanje genov, ki kodirajo EcK, EO in EPP, v reproduktivnih tkivih vsakega spola. Številke poleg puščic označujejo število moških in ženskih kandidatov v vsakem koraku. Ta analiza je identificirala en gen EPP (EPP) in en gen EcK (EcK1), ki se izražata pri samcih, ter en gen EcK (EcK2), ki se izraža pri obeh spolih, vendar ne daje kandidatnega gena EO.b, Toplotni zemljevid, ki primerja izražanje kandidatnih genov v deviških (V) in parjenih (M) tkivih Anopheles gambiae in Anopheles albicans. Spca, oploditev; MAG, pomožne žleze pri samcih; drugi deli telesa, vključno s prsmi, krili, nogami, maščobnimi telesi in notranjimi organi pri obeh spolih ter jajčniki pri samicah. EcK2 je močno izražen tako v MAG kot v atrijih Gambije, medtem ko EPP najdemo le v MAG.c, Proteomska analiza translokacije moške ejakulatne skupine v ženske atrije pri 3, 12 in 24 hpm, ki kaže 67 najpogostejših beljakovin. Samice so bile vzrejene na dieti, ki je vsebovala 15N za označevanje (in maskiranje) vseh beljakovin. Neoznačeni samci so bili parjeni z označenimi samicami, ženske LRT pa so bile secirane pri 3, 12 in 24 hpm za proteomsko analizo (za celoten seznam ejakulacijskih beljakovin glejte dodatno tabelo 1). Vstavljena slika: EPP, Eck1 in EcK2 so bili odkriti v MAG deviških samcev s proteomsko analizo teh tkiv.d, EPP je bil odkrit z Western blotom v MAG in LRT parjenih samic, ne pa pri deviških samicah ali samcih ali preostalem delu ženskega telesa. Membrane so bile hkrati testirani z anti-aktinskim (kontrola obremenitve) in anti-EPP protitelesi. Vsi samci so devici. Za podatke o viru gela glejte dodatno sliko 1. Western bloti so bili izvedeni dvakrat s podobnimi rezultati.
Aktivnost ekdisteroidne fosfofosfataze EPP je bila po inkubaciji potrjena s HPLC-MS/MS s 3D20E22P, izoliranim iz MAG (razširjeni podatki, slika 2a). Poleg tega smo pri utišanju EPP z interferenco, posredovano z RNA (RNAi), zaznali močno zmanjšanje aktivnosti fosfataze v reproduktivnih tkivih teh samcev (slika 3a), samice, parjene s samci, pri katerih je bil utišan EPP, pa so kljub delnemu utišanju genov pokazale znatno nižji delež defosforiliranega 3D20E (slika 3b) (razširjeni podatki, slika 2b,c). Nasprotno pa pri istih komarjih nismo zaznali pomembnih sprememb v razmerju 20E22P/20E, kar bi lahko nakazovalo, da je encim specifičen za 3D20E22P (slika 3b).
a, Zmanjšana aktivnost fosfataze v MAG, ki jo povzroča utišanje EPP z uporabo kontrol z dvoverižno EPP RNA (dsEPP) ali dvoverižno GFP RNA (dsGFP). V vsaki ponovitvi je bilo uporabljenih dvajset MAG skupin (P = 0,0046, parni t-test, dvostranski), predstavljenih z ločenimi pikami.b, Samice, parjene s samci z utišanim EPP, so imele bistveno nižji delež defosforiliranega 3D20E pri 3 hpm (P = 0,0043, neparni t-test, dvostranski), medtem ko ravni 20E niso bile prizadete (P = 0,063, neparni). t-test, dvostranski). Podatki so predstavljeni kot povprečje ± standardna vrednost (SEM) iz treh skupin po 13, 16 in 19 samic. c, Samice, parjene s samci, pri katerih je bil EPP utišan, so imele bistveno višje stopnje ponovnega parjenja (P = 0,0002, Fisherjev natančen test, dvostranski). Samice so bile najprej prisiljene v parjenje, da bi zagotovile svoj paritveni status; Dva dni kasneje so jih kontaktirali z drugimi samci, ki so nosili transgeno spermo, da bi s kvantitativno PCR detekcijo transgena ocenili stopnjo ponovnega parjenja.d Samice, hranjene s krvjo in parjene s samci, pri katerih je bil EPP utišan, so imele znatno zmanjšano plodnost (P < 0,0001; Mann-Whitneyjev test, dvostranski) in nekoliko zmanjšano število jajčec (P = 0,088, Mann-Whitneyjev test, dvostranski), medtem ko stopnja drstenja ni bila prizadeta (P = 0,94, Fisherjev natančen test, dvostranski). V vseh panelih n predstavlja število biološko neodvisnih vzorcev komarjev.NS, ni statistično pomembno.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Nato smo ocenili, ali je defosforilacija ekdizona pomembna za povzročanje odpornosti na parjenje pri samicah. Omeniti velja, da so se samice, ki so se parile s samci z zmanjšanim EPP, ponovno parile veliko pogosteje (44,9 %) kot kontrolne samice (10,4 %), ko so bile izpostavljene dodatnim (transgenim) samcem (slika 3c). Opazili smo tudi znatno zmanjšanje plodnosti (slika 3d, levo) in rahlo zmanjšanje števila jajčec, ki so jih te samice odložile (slika 3d, sredina), medtem ko odstotek jajčec, ki so jih samice odložile (še en odziv, ki ga je pri samicah sprožilo parjenje), ni bil prizadet (slika 3d, desno). Glede na opaženo specifičnost EPP za 3D20E22P ti rezultati kažejo, da ima lahko aktivacija 3D20E z EPP, prenesenim med parjenjem, pomembno vlogo pri izklopu dovzetnosti samic za nadaljnje parjenje, kar je bilo prej pripisano spolnemu prenosu 20E. Zato ta moški specifični hormon močno vpliva tudi na plodnost samic.
Nato smo primerjali aktivnosti 20E in 3D20E v poskusih z injiciranjem pri spolno zrelih devicah z uporabo kemično sintetiziranega 3D20E (slika 4a–c) in komercialno dostopnega 20E. Opazili smo, da je bil 3D20E bistveno učinkovitejši od 20E pri izklopu občutljivosti samic na parjenje pri obeh koncentracijah (slika 4d). Omeniti velja, da je polovica fiziološke ravni 3D20E v LRT (1.066 pg po injiciranju v primerjavi z 2.022 pg po parjenju) povzročila delež neodzivnih samic, ki je bil 20-krat višji od fiziološke ravni 20E (361 pg po injiciranju) 24 ur po injiciranju pri najvišji koncentraciji 18 pg po parjenju; Razširjeni podatki (tabela 1). Ta rezultat je skladen z idejo, da spolni prenos 20E ne povzroča refraktornih obdobij parjenja, in nadalje kaže na 3D20E kot pomemben dejavnik pri zagotavljanju odnosa med staršem in otrokom. 3D20E je bil tudi bistveno bolj aktiven kot 20E v testih odlaganja jajčec pri deviških samicah (slika 4e), kar kaže na to, da je bila normalna stopnja odlaganja jajčec, ki smo jo opazili po delnem utišanju EPP, posledica prisotnosti preostale aktivnosti 3D20E, ki jo še vedno povzročajo dejavniki, ki jih povzročajo samice.
(a,b) 3D20E kemično sintetiziran iz 20E (a) z zelo visoko konverzijsko/učinkovitostjo (podatki predstavljeni kot povprečje ± standardna vrednost iz treh neodvisnih sinteznih reakcij) (b).c, Masni spekter (spodnja polovica) se natančno ujema z ekdizonom, ki ga najdemo v parjenih samicah LRT (zgornja polovica).d, V primerjavi z 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisherjev natančen test, dvostranski) in 10 % etanolom (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisherjev natančen test, dvostranski), medtem ko je bil 20E bistveno višji od kontrole le pri višjih odmerkih (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; Fisherjev natančen test, dvostranski).e, Injekcija 3D20E je povzročila pomembno višje stopnje drstenja pri deviških samicah kot pri kontrolah z 10 % etanolom (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; Fisherjev natančen test, dvostranski), medtem ko je 20E v primerjavi s kontrolami le pri višjih odmerkih (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; Fisherjev natančen test, dvostranski).3D20E je povzročil bistveno višje stopnje drstenja kot 20E pri višjih odmerkih (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; Fisherjev natančen test, dvostranski).V vseh panelih n predstavlja število biološko neodvisnih vzorcev komarjev.NS, ni statistično pomembno.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.Podatki so iz treh ponovitve.
V prejšnjih študijah smo ugotovili, da spolni prenos steroidnih hormonov sproži izražanje MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), ženskega reproduktivnega gena, ki ščiti samice A. gambiae pred okužbo s P. falciparum. Zdravstveni stroški, ki jih povzroča 13, najsmrtonosnejši človeški malarijski parazit. Glede na pomen MISO za reproduktivno sposobnost Anophelesa na območjih, endemičnih za malarijo, smo se odločili ugotoviti, kateri hormon, 3D20E ali 20E, sproži izražanje tega gena. Ugotovili smo, da je injekcija 20E specifično ali močneje sprožila nekatere jedrske hormonske receptorje (HR), kot sta HR3 in HR4, ter tipične steroidne tarče v smeri toka, kot so yolkogeni geni Vg14, 15, 16, medtem ko je 3D20E močneje sprožil MISO (razširjeni podatki, slika 3). Tako se zdi, da spolni prenos tega androgenega steroidnega hormona sproži mehanizme, ki ščitijo samice pred stroški, ki jih povzroča parazitska okužba. Poleg tega 3D20E različno vpliva na obe izoobliki E receptor EcR, ki inducira EcR-A in zavira EcR-B, ter močneje sproži druge gene, ki inducirajo parjenje, vključno s HPX15, ki vpliva na plodnost samic. To bi lahko pojasnilo znatno neplodnost, opaženo pri samicah, parjenih s samci, pri katerih je utišan EPP (razširjeni podatki, slika 3). Ti podatki kažejo na obstoj poti navzdol, ki jih prednostno aktivirata dva ekdizonska hormona, ki sta lahko osnova za spolno specifično funkcijo.
Nato smo testirali delovanje dveh genov EcK, identificiranih v našem bioinformatičnem cevovodu. Utišanje EcK1 ali EcK2 je povzročilo znatno umrljivost pri samcih (razširjeni podatki, slika 4a), kar kaže na to, da je fosforilacija ekdizona in s tem njegova inaktivacija pomembna za preživetje. Ker se je EcK2 izražal na višjih ravneh kot EcK1 in je bil proteomika zaznana v MAG (slika 2b, c in dodatna tabela 2), smo njegovo aktivnost ekdisteroidne kinaze potrdili z inkubacijo z 20E, kar je povzročilo fosforilacijo 20E22P (razširjeni podatki, slika 2).4b). Pri uporabi 3D20E kot substrata nismo mogli zaznati fosforiliranega produkta 3D20E22P (razširjeni podatki, slika 4c), kar kaže na to, da je 20E namesto 3D20E morda prednostna tarča EcK2.
Glede na našo analizo RNA-sekvenciranja je bil EcK2 močno izražen tudi v LRT deviških samic, kjer se je po parjenju izklopil (slika 2b). Te podatke smo potrdili in ugotovili, da na izražanje EcK2 ni vplivalo hranjenje s krvjo (razširjeni podatki, slika 5a). Z razširitvijo naših začetnih MS poskusov smo ugotovili, da je bil vrh 20E22P tesno povezan z vrhom 20E (22–26 ur po obroku s krvjo; razširjeni podatki, slika 5b). Utišanje EcK2 pri deviških samicah je povzročilo 3-kratno povečanje relativnega razmerja med 20E in 20E22P 26 ur po obroku s krvjo (razširjeni podatki, sliki 2c in 5c), kar potrjuje, da EcK2 fosforilira tudi 20E pri samicah. Omeniti velja, da so device z zmanjšano vsebnostjo EcK2 ohranile polno spolno receptivnost (razširjeni podatki, slika 5d,e), kar nadalje kaže, da proizvodnja 20E pri samicah ne povzroča refraktornih obdobij parjenja. Vendar pa so imele te samice znatno povečane stopnje odlaganja jajčec v primerjavi s kontrolno skupino, pri čemer je več kot 30 % devic odložilo jajčeca (razširjeni podatki, slika 5f). Če so bile injekcije dvoverižne Eck2 RNA (dsEcK2) izvedene po hranjenju s krvjo, do drstenja ni prišlo, pri čemer se je vrh 20E zaradi zaužitja krvi zmanjšal. Na splošno ti rezultati podpirajo model, da lahko 20E, ki nastane po sesanju krvi, povzroči drstenje, vendar le, če parjenje izklopi blokado drstenja (EcK2 in morda drugi dejavniki). Niti injekcije 20E niti 3D20E niso zavirale izražanja EcK2 pri devicah (razširjeni podatki, slika 5g), kar kaže na to, da drugi dejavniki posredujejo pri zaviranju te kinaze. Vendar pa ravni 20E po hranjenju s krvjo niso bile zadostne za povzročitev nelagodja pri parjenju, temveč so jih učinkovito sprožili visoki titri spolno prenesenega 3D20E.
Naši rezultati ponujajo pomemben vpogled v mehanizme, ki uravnavajo reproduktivni uspeh A. gambiae. Pojavil se je model, v katerem so se samci razvili v sintezo visokih titrov 3D20E, moško specifičnega modificiranega ekdizona, ki zagotavlja starševstvo z desenzibilizacijo samic za nadaljnje parjenje. Hkrati so ti prenašalci malarije razvili tudi učinkovit sistem za aktivacijo 3D20E pri samicah kot odziv na spolni prenos moško specifičnega EPP. Kolikor vemo, je to prvi primer steroidnega hormonskega sistema, v katerem prevladujejo samci in samice, ki opravlja edinstveno in ključno funkcijo pri žuželkah. Moško specifična funkcija ekdizona je bila postulirana, vendar ni bila dokončno dokazana. Na primer, v veliki meri ovržena hipoteza18 je, da te funkcije lahko opravlja predhodnik 20E E1. Dobro je znano, da pri Drosophili monandrijo sproži spolni prenos majhnih spolnih peptidov19,20, ki interagirajo z nevroni, ki oživčujejo ženski reproduktivni trakt prek specifičnih receptorjev za spolne peptide21,22. Potrebno je nadaljnje delo za določitev kaskad signalizacije navzdol. nadzorovanih s 3D20E pri samicah A. gambiae in ugotoviti, ali se te kaskade lahko ohranijo med komarji in Drosophilo.
Glede na pomembno vlogo 3D20E pri plodnosti in vedenju samic, ugotovljeno v naši študiji, poti, ki vodijo do sinteze in aktivacije 3D20E, ponujajo nove priložnosti za prihodnje strategije zatiranja komarjev, kot je ustvarjanje konkurenčnih sterilnih samcev v strategijah sterilne tehnologije žuželk, ki se uporabljajo za sproščanje v naravo ali za posnemanje 3D20E pri igri brez device. Funkcija 3D20E, specifična za samce, se je morda razvila, ko so A. gambiae in druge vrste Cellia pridobile sposobnost koagulacije svoje sperme v paritvene čepe, saj to omogoča učinkovit prenos velikega števila hormonov in encimov, ki aktivirajo hormone. Evolucija 3D20E z uvedbo monandrije pa zagotavlja mehanizem za samice (z visoko ekspresijo MISO), ki spodbuja njihovo reproduktivno sposobnost na območjih z visoko razširjenostjo malarije, kar posredno prispeva k prenosu plazmodija. Glede na to, da se je pokazalo, da ima samica 20E velik vpliv na preživetje in rast P. falciparum pri samicah komarjev Anopheles,24 so tako samci kot samice poti steroidnih hormonov zdaj ključni vidiki interakcij med komarji in paraziti.
Sevi A. gambiae G3 so bili vzrejeni v standardnih pogojih za žuželke (26–28 °C, 65–80 % relativna vlažnost, fotoperioda 12:12 ur svetlobe/teme). Ličinke so hranili s hrano za ribe v prahu (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets in Tetra Pond Sticks v razmerju 7:7:2). Odrasli komarji so bili po želji hranjeni z 10 % raztopino dekstroze in tedensko s človeško krvjo (preučevane krvne komponente). Deviški komarji so bili pridobljeni z ločevanjem spolov v fazi bube po mikroskopskem pregledu koncev. Samci, ki nosijo transgen DsRed, so bili opisani že prej.
Poskusi prisilnega parjenja so bili izvedeni v skladu s predhodno opisanimi protokoli. Za naravno parjenje so bile 4 dni stare deviške samice dve noči v razmerju 1:3 s spolno zrelimi deviškimi samci. Pri poskusih, v katerih so samci prejeli dsEPP, je sočasno bivanje v kletki sovpadalo s 3. in 4. dnem po injiciranju, ko je bila aktivnost fosfataze maksimalno utišana (razširjeni podatki, slika 2b).
Tkiva komarjev, preostale kadavre (preostanek telesa) ali celotno telo so secirali v 100 % metanol in homogenizirali z mešalnikom (2 mm steklene kroglice, 2400 vrt/min, 90 sekund). Količine tkiva in volumni metanola so bili naslednji: preostanek telesa, 50 v 1000 µl; MAG, 50–100 80 µl; samice LRT, 25–50 80 µl. Oborina je bila podvržena drugi ekstrakciji z metanolom z enakim volumnom metanola. Celične ostanke so odstranili s centrifugiranjem. Metanol iz obeh ekstrakcij so združili in posušili pod tokom dušika, nato pa resuspendirali v naslednjih volumnih 80 % metanola v vodi: preostanek telesa, 50 µl; MAG in samice LRT, 30 µl.
Vzorce smo analizirali na masnem spektrometru (ID-X, Thermo Fisher), povezanem z instrumentom LC (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl vzorca smo vbrizgali na 3 µm, 100 × 4,6 mm kolono (Inspire C8, Dikma), ki smo jo vzdrževali pri 25 °C. Mobilni fazi za LC sta bili A (voda, 0,1 % mravljinčna kislina) in B (acetonitril, 0,1 % mravljinčna kislina). Gradient LC je bil naslednji: 5 % B 1 minuto, nato povečan na 100 % B v 11 minutah. Po 8 minutah pri 100 % smo kolono ponovno uravnotežili pri 5 % B 4 minute. Pretok je bil 0,3 ml min-1. Ionizacija v MS viru se doseže z ionizacijo z segretim elektrosprejem v pozitivnem in negativnem načinu.
Masni spektrometer meri podatke v območju m/z od 350 do 680 pri ločljivosti 60.000 v polnem MS načinu. Podatki MS/MS so bili pridobljeni za [M + H]+ (vse tarče), [M - H2O + H]+ (vse tarče) in [M - H]- (fosforilirane tarče). Podatki MS/MS so bili uporabljeni za potrditev lastnosti ekdizona tarč, za katere ni bil na voljo standard. Za identifikacijo neciljnih ekdisteroidov so bili analizirani podatki MS/MS za vse vrhove HPLC z relativno abundanco >15 %. Kvantificirajte z uporabo standardnih krivulj, ustvarjenih iz čistih standardov (20E, 3D20E), da izračunate absolutne količine ali razredčitve enega specifičnega vzorca (vse druge tarče) za izračun njihove enakovrednosti količinam, najdenim pri enem samcu. Za 3D20E je bila kvantifikacija izvedena z uporabo vsote naslednjih aduktov: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.Podatki so bili ekstrahirani in kvantificirani z uporabo programa Tracefinder (različica 4.1). Podatki MS/MS so bili analizirani z uporabo programa Xcalibur (različica 4.4). MS spektri E, 20E in 3D20E so bili primerjani z ustreznimi standardi. 3D20E22P je bil analiziran z derivatizacijo z Girardovim reagentom. 20E22P je bil analiziran z razmerjem m/z.
3D20E22P smo očistili iz MAG. Čiščenje smo izvedli v analitskem merilu z uporabo ultrazmogljivega tekočinskega kromatografa (Acquity, Waters) s kvadrupolnim detektorjem na osnovi mase (QDa, Acquity, Waters) pod enakimi pogoji LC kot pri analizi HPLC-MS/MS. Zbiranje frakcij smo sprožili, ko smo zaznali m/z, ki ustreza 3D20E22P, ob istem retencijskem času, kot smo ga določili prej. Čistost ekstrahiranih spojin smo nato preverili s HPLC-MS/MS, kot je opisano zgoraj.
Celotna RNA je bila ekstrahirana iz 10–12 reproduktivnih tkiv ali drugih delov telesa (brez glave) z uporabo reagenta TRI (Thermo Fisher) po navodilih proizvajalca. RNA je bila obdelana s TURBO DNazo (Thermo Fisher). cDNA je bila sintetizirana z uporabo reverzne transkriptaze virusa mišje levkemije Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher) po navodilih proizvajalca. Primerji za kvantitativno PCR z reverzno transkripcijo (RT-qPCR; Razširjena tabela podatkov 2) so bili predhodno objavljeni24 ali zasnovani z uporabo Primer-BLAST26, pri čemer je bila prednost dana produktom velikosti 70–150 bp, ki segajo na stičišča ekson-ekson ali pa so primerji s pari primerjev ločevali eksone. Vzorci cDNA iz treh do štirih bioloških ponovitev so bili štirikrat razredčeni v vodi za RT-qPCR. Kvantifikacija je bila izvedena v 15 µl ponovitvenih reakcijah, ki so vsebovale 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primerje in 5 µl razredčene cDNA. Reakcije so bile izvedene na sistemu za PCR v realnem času QuantStudio 6 Pro (Thermo Fisher) in podatki so bili zbrani in analizirani z uporabo programa Design and Analysis (različica 2.4.3). Kot je bilo prikazano v tej študiji, so bile relativne količine normalizirane na ribosomski gen RpL19 (AGAP004422), katerega izražanje se ni bistveno spremenilo s hranjenjem s krvjo 27 ali parjenjem 3.
Kakovost RNK je bila preverjena z uporabo Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Knjižnice parnih koncev Illumina so bile pripravljene in izvedene na Broad Institute na MIT in Harvardu. Sekvencni odčitki so bili poravnani z genomom A. gambiae (sev PEST, različica 4.12) z uporabo HISAT2 (različica 2.0.5) s privzetimi parametri. Odčitki z rezultati kakovosti preslikave (MAPQ) <30 so bili odstranjeni z uporabo Samtools (različica 1.3.1). Število odčitkov, preslikanih na gene, je bilo prešteto z uporabo htseq-count (različica 0.9.1) s privzetimi parametri. Normalizirano število odčitkov je bilo izračunano in diferencialna genska ekspresija analizirana z uporabo paketa DESeq2 (različica 1.28.1) v R (različica 4.0.3).
Kandidati za gene, ki modificirajo ekdizon, so bili identificirani tako, da so najprej iskali genom A. gambiae z uporabo algoritma PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) z uporabo privzetih vrednosti parametrov z naslednjimi zaporedji poizvedbenih proteinov: iz Bombyx mori (pristopna št. NP_001038956.1), Musca domestica (pristopna št. XP_005182020.1, XP_005175332.1 in XP_011294434.1) in Microplitis demolitor (pristopna št. XP_008552646.1 in XP_008552645.1) EcK iz B. mori (pristopna št. NP_001036900), Drosophila melanogaster (pristopna št. NP_651202), Apis mellifera (pristopna št. XP_394838) in Acyrthosiphon pisum (pristopna št. XP_001947166); ter EPP iz B. mori (pristopna št. XP_001947166) NP_001177919.1 in NP_001243996.1) in EO D. melanogaster (pristopna št. NP_572986.1) (1. korak). Nato filtrirajte zadetke na podlagi visoke ekspresije mRNA (>100 fragmentov/kilobaznih eksonov na milijon preslikanih odčitkov (FPKM) ali >85 %) v reproduktivnem tkivu (samice LRT ali MAG) v Gambiji (2. korak). Za izboljšanje specifičnosti smo izbrali kandidatne encime, ki se izražajo tudi v reproduktivnem tkivu A. albimanus, vrste Anopheles, ki med parjenjem ne sintetizira ali prenaša ekdizona. Kandidatne gene smo filtrirali na podlagi nizke ekspresije (<100 FPKM ali <85. percentil) v reproduktivnem tkivu A. albimanus (korak 3). Kot končni filter (korak 4) morajo kandidatni geni izpolnjevati vsaj enega od naslednjih pogojev: (1) znatno povečana ekspresija po parjenju (P < 0,05) v skladu z analizo diferencialno izraženih genov in (2) v nereproduktivnih tkivih (< 85 % ali <100 FPKM).
Predhodno opisane metode 28, 29, 30 smo spremenili, da bi dosegli izotopsko označevanje celotnega organizma. Na kratko, divji tip Saccharomyces cerevisiae tipa II (YSC2, Sigma) smo testirali v kvasovki z dušikovo bazo (BD Difco, DF0335), ki je vsebovala (m/v) 2 % glukoze (G7528, Sigma), 1,7 % gojišča brez aminokislin in amonijevega sulfata) in 5 % 15N amonijevega sulfata (NLM-713, >99 %, Cambridge Isotope Laboratories) kot edini vir dušika. Kvas smo pridobili s centrifugiranjem, ličinke komarjev pa smo hranili ad libitum do zabubljanja. Dodali smo ribjo moko (0,5 mg na 300 ličink), da bi preprečili smrtnost v četrtem stadiju. V poskusih parjenja z neoznačenimi samci smo nato uporabili samo samice za analizo moškega proteoma, prenesenega med parjenjem.
4-6 dni stare samice z oznako 15N so bile prisiljene pariti se z neoznačenimi samci enake starosti. Uspešno parjenje so potrdili z odkrivanjem paritvenih čepov pod epifluorescenčno mikroskopijo. Pri 3, 12 in 24 urah na minuto so bili preddvori 45-55 parjenih samic secirani v 50 µl amonijevega bikarbonatnega pufra (pH 7,8) in homogenizirani s pestilom. Homogenat so centrifugirali in supernatant zmešali s 50 µl 0,1% RapiGest (186001860, Waters) v 50 mM amonijevem bikarbonatu. Supernatant in pelet iz vsakega vzorca sta bila zamrznjena na suhem ledu in čez noč poslana v laboratorij MacCoss na Univerzi v Washingtonu, kjer je bila končana priprava vzorca za LC-MS/MS. Peleto smo resuspendirali v 50 µl 0,1% RapiGest v 50 mM amonijevem bikarbonatu in sonificirali v vodni kopeli. Koncentracijo beljakovin v peleti in supernatantu smo izmerili z BCA. V testu so bili vzorci reducirani s 5 mM ditiotreitolom (DTT; Sigma), alkilirani s 15 mM jodoacetamidom (Sigma) in inkubirani pri 37 °C (1:0 50) 1 uro z razmerjem tripsinizacija:tripsin:substrat). RapiGest smo lizirali z dodatkom 200 mM HCl, nato pa smo ga inkubirali pri 37 °C 45 minut in centrifugirali pri 14.000 vrt/min 10 minut pri 4 °C, da smo odstranili delce. Vzorce smo oprali z dvojno ekstrakcijo na trdni fazi (kartridži Oasis MCX, Waters) in resuspendirali v 0,1 % mravljinčni kislini za končno koncentracijo beljakovin 0,33 µg µl-1. Neoznačeni MAG proteomi so bili podobno analizirani pri deviških samcih. Za vsak vzorec smo analizirali dve analitični ponovitvi. Nato smo analizirali 1 µg vsakega z uporabo 25-cm kolone iz taljenega silicijevega dioksida 75 μm s 4 cm... past iz taljenega silicijevega dioksida Kasil1 (PQ), polnjena z reverzno fazno smolo Jupiter C12 (Phenomenex), in 180-minutna tekočinska kromatografija. Prebava vzorcev – MS/MS je bila izvedena na masnem spektrometru Q-Exactive HF (Thermo Fisher) s sistemom nanoACQUITY UPLC (Waters). Podatki, povezani z zajemom podatkov, ustvarjeni za vsak preizkus, so bili pretvorjeni v format mzML z uporabo programa Proteowizard (različica 3.0.20287) in z uporabo programa Comet31 (različica 3.2) v podatkovni bazi FASTA, ki vsebuje beljakovinska zaporedja iz Anopheles gambiae (različica VectorBase 54), Anopheles coluzzi. Iskanje je bilo izvedeno v Mali-NIH (različica VectorBase 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, marec 2021), A. gambiae RNA-seq in tri-frame translacijah znanih človeških onesnaževalcev. FDR, ki se ujemajo s peptidnim zemljevidom, so bili določeni z uporabo programa Percolator32 (različica 3.05) s pragom 0,01, peptidi pa so bili sestavljeni v identifikacijske kode beljakovin z uporabo programa Proteowizard33 (različica 2.2.0). Relativna abundanca beljakovin je bila ocenjena z uporabo normaliziranega faktorja spektralne abundance (NSAF), izračunanega za vsako beljakovino v vsakem poskusu, kot je bilo opisano prej. NSAF glede na vsako beljakovino je bil povprečen za vzorce iz dveh različnih bioloških ponovitev. Označevanje z 15N je uspešno prikrilo ženski proteom, čeprav je bilo mogoče iz označenih deviških vzorcev zaznati majhno količino neoznačenih beljakovin. Zaznali smo zaznavo zmanjšanja moških beljakovin (1-5 spektri) v surovih vzorcih samic le v tehničnih poskusih, kjer so bili surovi vzorci analizirani po vzorcih samcev/parjenja, kot posledica "prenosa" HPLC. Občasni proteini, najdeni kot "kontaminanti" iz označenih deviških vzorcev, so navedeni v dodatni tabeli 1.
Dva antigena peptida, QTTDRVAPAPDQQQ (znotraj izotipa PA) in MESDGTTPSGDSEQ (znotraj izotipa PA in PB) v Genscriptu. Peptida sta bila združena, nato konjugirana z nosilnim proteinom KLH in injicirana novozelandskim kuncem. Kunce so po četrti injekciji žrtvovali, skupni IgG pa so izolirali z afinitetnim čiščenjem. IgG iz najbolj EPP-specifičnega kunca so uporabili za nadaljnji Western blot.
Za Western blot smo ločeno dodali MAG (n = 10, kjer n predstavlja število biološko neodvisnih vzorcev komarjev) in samice LRT (n = 30) 4 dni starih deviških samcev in deviških ali prisilno parjenih samic (<10 po parjenju). Pufer za ekstrakcijo beljakovin (50 mM Tris, pH 8,0; 1 % NP-40; 0,25 % natrijev deoksiholat; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× koktajl zaviralcev proteaz (Roche)). Vzorce smo takoj po disekciji homogenizirali z mešalnikom (2 mm steklene kroglice, 2400 vrt/min, 90 sekund). Netopne delce smo odstranili s centrifugiranjem pri 20.000 g pri 4 °C. Beljakovine smo kvantificirali z Bradfordovim testom (Bio-Rad). Nato smo denaturirali 20 µg beljakovin MAG, 40 µg beljakovin LRT in 20 µg preostalih beljakovin v razsutem stanju in ločili z 10 %... Bis-Tris NuPAGE z uporabo MOPS pufra. Proteine ​​smo prenesli na poliviniliden fluoridne membrane z uporabo prenosnega sistema iBlot2 (Thermo Fisher). Membrane smo dvakrat sprali v 1× PBS-T (0,1 % Tween-20 v PBS) in nato 1 uro blokirali v blokirnem pufru Odyssey (Li-Cor) pri 22 °C. Membrane smo stresali čez noč pri 4 °C s prilagojenim kunčjim poliklonskim primarnim protitelesom proti EPP (1:700 v blokirnem pufru) in podganjim monoklonskim primarnim protitelesom proti aktinu MAC237 (Abeam; 1:4000). Membrane smo sprali s PBS-T in nato inkubirali s sekundarnimi protitelesi (oslovsko anti-kunčje 800CW in kozje anti-podganje 680LT (Li-Cor), oba 1:20.000) v blokirnem pufru, ki je vseboval 0,01 % SDS in 0,2 % Tween-20, 1 uro pri 22 °C. Membrane smo sprali s PBS-T. in posnete s skenerjem Odyssey CLx. Slike so bile zbrane in obdelane v programu Image Studio (različica 5.2). Specifičnega pasu, ki ustreza izoobliki EPP-RA (82 kDa), niso zaznali.
Kodirni regiji EPP (kot izoforma AGAP002463-RB, ki vsebuje domeno histidin fosfataze, iskanje ohranjene domene NCBI 34) in EcK2 (AGAP002181) sta bili klonirani v plazmid pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); primerji so navedeni v tabeli razširjenih podatkov 2. Osem povezovalcev GS4 (v tandemu) je bilo vstavljenih pred C-terminalno oznako 6xHis konstrukta pET-21a(+)-EcK2. Rekombinantni proteini so bili proizvedeni z uporabo reakcije sinteze proteinov E. coli brez celic NEBExpress (New England BioLabs). Rekombinantni proteini so bili očiščeni z uporabo NEBExpress Ni spin kolon (New England BioLabs). Kontrolni protein dihidrofolat reduktaze (DHFR) je bil proizveden z uporabo DNA predloge iz kompleta za sintezo proteinov E. coli brez celic NEBExpress. Beljakovine so bile shranjene v 50 % glicerolu v PBS pri -20 °C do 3 mesece.
Fosfatazno aktivnost EPP in tkivnih ekstraktov smo izmerili z uporabo 4-nitrofenil fosfata (pNPP; Sigma-Aldrich). Reakcijski pufer je vseboval 25 mM Tris, 50 mM ocetno kislino, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA in 1 mM DTT. Tkivo smo homogenizirali v reakcijskem pufru, celične ostanke pa smo odstranili s centrifugiranjem. Reakcijo smo začeli z dodajanjem encima ali tkivnega ekstrakta reakcijskemu pufru, ki je vseboval 2,5 mg ml-1 pNPP. Reakcijsko zmes smo inkubirali pri sobni temperaturi v temi, količino pNP, pretvorjenega iz pNPP, pa smo kvantificirali z merjenjem absorbance pri 405 nm ob različnih časih.
Za in vitro aktivnost EcK smo protein inkubirali z 0,2 mg 20E ali 3D20E v 200 µl pufra (pH 7,5), ki je vseboval 10 mM HEPES-NaOH, 0,1 % BSA, 2 mM ATP in 10 mM MgCl2, 2 uri pri 27 °C. Reakcijo smo ustavili z dodatkom 800 µl metanola, nato ohladili na -20 °C 1 uro in nato centrifugirali pri 20.000 g 10 minut pri 4 °C. Supernatant smo nato analizirali s HPLC-MS/MS. Za toplotno inaktivacijo proteinov, uporabljenih v kontrolni skupini, smo proteine ​​inkubirali v 50 % glicerolu v PBS 20 minut pri 95 °C.
Za in vitro aktivnost EPP smo protein inkubirali s 3D20E22P (kar ustreza količini, najdeni v 18 parih MAG, prečiščenih s HPLC-MS/MS) v 100 µl pufra (pH 7,5), ki je vseboval 25 mM Tris, 50 mM ocetno kislino, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA in 1 mM DTT, 3 ure pri 27 °C. Reakcijo smo ustavili z dodatkom 400 µl metanola in ohladili na -20 °C 1 uro, nato pa centrifugirali pri 20.000 g 10 minut pri 4 °C. Supernatant smo analizirali s HPLC-MS/MS.
PCR fragmente za EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) in EcK2 (556 bp) smo pomnožili iz cDNA, pripravljene iz mešanih spolov brezglavih komarjev. PCR fragment kontrolnega eGFP (495 bp) smo pomnožili iz prej opisanega pCR2.1-eGFP; Primerji za PCR so navedeni v razširjeni tabeli podatkov 2. Fragment PCR je bil vstavljen med invertirane promotorje T7 na plazmidu pL4440. Plazmidne konstrukte smo pridobili iz kompetentne E. coli NEB 5-α (New England Biolabs) in pred uporabo preverili s sekvenciranjem DNK (za zaporedje vstavkov glejte dodatne podatke 1). Primerje, ki se ujemajo s promotorjem T7 (razširjena tabela podatkov 2), smo uporabili za amplifikacijo vstavka iz plazmida na osnovi pL4440. Velikost produkta PCR smo potrdili z elektroforezo na agaroznem gelu. dsRNA smo prepisali iz predlog za PCR z uporabo kompleta za transkripcijo Megascript T7 (Thermo Fisher) in očistili v skladu z navodili proizvajalca z zgoraj opisanimi spremembami.
Za injiciranje dsRNA je bilo v prsni koš odraslih samcev ali samic (Nanoject III, Drummond) v enem dnevu po ekloziji injiciranih 1380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) v koncentraciji 10 ng nl-1. Stopnje genske knockdown so bile določene v vsaj treh bioloških ponovitvah z ekstrakcijo RNA, sintezo cDNA in RT-qPCR. Za injiciranje ekdizona so bile 4 dni stare deviške ali 6 dni stare deviške samice, hranjene s krvjo, injicirane z 0,13, 0,21 ali 0,63 µg 20E ali 3D20E (Nanoject III, Drummond) v koncentracijah 1,3 oziroma 2,1, odvisno od zasnove eksperimenta, ali 6,3 ng nl-1. Vbrizgajte 100 nl 10 % (vol/vol) etanola v vodi; 100 nl 3D20E22P v 10 % etanolu (kar ustreza 75 % količine, najdene v paru MAG). Komarji so bili naključno dodeljeni skupini, ki jim je bilo injicirano.
Za teste drstenja so 3 dni stare samice po želji hranili s človeško krvjo. Odstranili so delno hranjene ali nehranjene komarje. Glede na način zdravljenja so samice za štiri noči, vsaj 48 ur po obroku krvi, namestili v ločene drstilne skodelice. Jajčeca so prešteli pod stereoskopom (Stemi 508, Zeiss); pri parjenih samicah so jajčeca, ki so se izlegla v ličinke, šteli za oplojena.
Za poskuse parjenja so samice imele vsaj 2 dni časa, odvisno od načina zdravljenja, da razvijejo odpornost na parjenje, nato pa so v isto kletko vnesli samce divjega tipa, ki so ustrezali starosti. Dve noči kasneje so oplojene vezikle samic secirali in genomsko DNK sprostili z zamrzovanjem-odtajanjem in sonikacijo v pufru, ki je vseboval 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA in 25 mM NaCl (pH 8,2). Vzorce smo inkubirali s proteinazo K (0,86 µg µl-1) 15 minut pri 55 °C, nato pa 10 minut pri 95 °C. Pripravljene surove genomske DNK smo 10-krat razredčili in jih podvrgli detekciji zaporedij kromosoma Y s qPCR; primerji so navedeni v razširjeni tabeli podatkov 2. Odsotnost zaporedja kromosoma Y kaže na odsotnost parjenja.
Za teste ponovnega parjenja so prisilno parjene samice pregledali na prisotnost paritvenih čepov, da bi potrdili status parjenja, in jim pustili 2 dni, da so razvile odpornost na parjenje v odsotnosti samcev, kot je bilo opisano že prej36. Samce, ki so nosili transgeno spermo DsRed, so nato vnesli v kletke samic. Dve noči kasneje so oploditvene vezikle secirali iz samic in pripravili genomsko DNK, kot je opisano zgoraj, ter jo podvrgli detekciji transgena DsRed s qPCR; primerji so navedeni v razširjeni tabeli podatkov 2. Odsotnost transgena DsRed je pokazala, da do ponovnega parjenja ni prišlo.
3D20E smo sintetizirali, kot je bilo opisano že prej37. Na kratko, 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) smo raztopili v 10 ml vode, nato pa dodali 30 mg platinastega črnega (v obliki prahu, Sigma-Aldrich). V reakcijsko zmes smo neprekinjeno uvajali rahel tok O2, ki smo jo mešali pri sobni temperaturi. Po 6 urah smo dodali 30 ml metanola, da smo ustavili reakcijo. Zmes smo centrifugirali, da smo odstranili delce katalizatorja. Supernatant smo v vakuumu uparili do suhega pri sobni temperaturi. Posušeni reakcijski produkt smo raztopili v 10 % etanolu in metanolu za injekcijo za analizo HPLC-MS/MS. Stopnja pretvorbe (iz 20E v 3D20E) je bila približno 97 % (slika 4b), MS spekter sintetiziranega 3D20E pa se je ujemal s spektrom, ki smo ga našli pri parjenih samicah (slika 4c).
Legenda vsebuje specifične podrobnosti o izvedenih statističnih testih. GraphPad (različica 9.0) je bil uporabljen za izvedbo Fisherjevega natančnega testa, Mantel-Coxovega testa in Studentovega t-testa. Cochran-Mantel-Haenszelovi testi so bili izvedeni z uporabo skripte R po meri (na voljo na https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Porazdelitev podatkov je bila preizkušena glede normalnosti z uporabo Shapiro-Wilkovega testa s pragom pomembnosti 0,05. Ko podatki niso prestali testa normalnosti, je bil izveden Mann-Whitneyjev test. Podatki o preživetju so bili analizirani z Mantel-Coxovim testom. Za izvedbo analize diferencialne ekspresije na ravni genov RNA-seq je bil uporabljen paket DESeq2 (različica 1.28.1). Vodoravna črta na grafu predstavlja mediano. Kot prag za vse teste je bila uporabljena vrednost pomembnosti P = 0,05.
Za več informacij o zasnovi študije glejte povzetek poročila o raziskavah narave, ki je povezan s tem člankom.
Podatki o proteomiki MS so bili deponirani v konzorcij ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) prek partnerskega repozitorija PRIDE (https://www.ebi.ac.uk/pride/) z identifikatorjem nabora podatkov PXD032157.
Nabor podatkov RNA-seq je shranjen v knjižnici Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) pod serijsko številko GSE198665.
Dodatne nabore podatkov, ustvarjene in/ali analizirane med trenutno študijo, lahko na razumno zahtevo pridobite od ustreznih avtorjev. Ta članek vsebuje izvorne podatke.
De Loof, A. Ekdisteroidi: Zanemarjeni spolni steroidi žuželk? Moški: Black Box. Znanost o žuželkah. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hidroksiekdizon in razvoj jajčnikov pri Anopheles stephens. J. Insect Physiology. 28, 97–109 (1982).