Propionska kislina (PPA), protiglivično sredstvo in pogost prehranski dodatek, je pri miših povzročila nenormalen nevrološki razvoj, ki ga spremlja gastrointestinalna disfunkcija, ki jo lahko povzroči črevesna disbioza. Povezava med izpostavljenostjo PPA v prehrani in disbiozo črevesne mikrobiote je bila predlagana, vendar ni bila neposredno raziskana. Tukaj smo raziskali spremembe v sestavi črevesne mikrobiote, povezane s PPA, ki lahko vodijo do disbioze. Črevesni mikrobiomi miši, ki so se hranile z neobdelano dieto (n=9) in dieto, obogateno s PPA (n=13), so bili sekvencirani z uporabo metagenomskega sekvenciranja dolgega dosega, da bi ocenili razlike v mikrobni sestavi in bakterijskih presnovnih poteh. PPA v prehrani je bila povezana s povečanjem številčnosti pomembnih taksonov, vključno z več vrstami Bacteroides, Prevotella in Ruminococcus, katerih člani so bili že prej vpleteni v proizvodnjo PPA. Mikrobiomi miši, izpostavljenih PPA, so imeli tudi več poti, povezanih z metabolizmom lipidov in biosintezo steroidnih hormonov. Naši rezultati kažejo, da lahko PPA spremeni črevesno mikrobioto in z njo povezane presnovne poti. Te opažene spremembe poudarjajo, da lahko konzervansi, razvrščeni kot varni za uživanje, vplivajo na sestavo črevesne mikrobiote in posledično na zdravje ljudi. Med njimi se izbere P, G ali S, odvisno od analizirane ravni klasifikacije. Za zmanjšanje vpliva lažno pozitivnih klasifikacij je bil sprejet minimalni prag relativne številčnosti 1e-4 (1/10.000 odčitkov). Pred statistično analizo so bile relativne številčnosti, ki jih je poročal Bracken (fraction_total_reads), transformirane z uporabo transformacije centriranega logaritemskega razmerja (CLR) (Aitchison, 1982). Metoda CLR je bila izbrana za transformacijo podatkov, ker je nespremenljiva glede na merilo in zadostna za neredke nabore podatkov (Gloor et al., 2017). Transformacija CLR uporablja naravni logaritem. Podatki o štetju, ki jih je poročal Bracken, so bili normalizirani z uporabo relativnega logaritemskega izraza (RLE) (Anders in Huber, 2010). Slike so bile ustvarjene s kombinacijo matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 in zaporednih logaritmov (Gloor et al., 2017). 0,12,2 in stantanotacije v. 0,5,0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Razmerje Bacillus/Bacteroidetes je bilo izračunano za vsak vzorec z uporabo normaliziranega števila bakterij. Vrednosti, navedene v tabelah, so zaokrožene na 4 decimalna mesta. Simpsonov indeks raznolikosti je bil izračunan z uporabo skripta alpha_diversity.py, ki je na voljo v paketu KrakenTools v. 1,2 (Lu et al., 2022). V skriptu je na voljo Brackenovo poročilo, za parameter -an pa je naveden Simpsonov indeks »Si«. Pomembne razlike v številčnosti so bile opredeljene kot povprečne razlike CLR ≥ 1 ali ≤ -1. Povprečna razlika CLR ±1 pomeni 2,7-kratno povečanje številčnosti vzorčne vrste. Predznak (+/-) označuje, ali je takson številčnejši v vzorcu PPA oziroma kontrolnem vzorcu. Pomembnost je bila določena z Mann-Whitneyjevim U testom (Virtanen et al., 2020). Uporabljen je bil program Statsmodels v. 0.14 (Benjamini in Hochberg, 1995; Seabold in Perktold, 2010), za korekcijo večkratnega testiranja pa Benjamini-Hochbergov postopek. Kot prag za določitev statistične pomembnosti je bila uporabljena prilagojena p-vrednost ≤ 0,05.
Človeški mikrobiom se pogosto imenuje »zadnji organ telesa« in igra ključno vlogo pri človekovem zdravju (Baquero in Nombela, 2012). Zlasti črevesni mikrobiom je prepoznan po svojem vplivu na celoten sistem in vlogi pri številnih bistvenih funkcijah. Komenzalne bakterije so v črevesju številne, zasedajo več ekoloških niš, uporabljajo hranila in tekmujejo s potencialnimi patogeni (Jandhyala et al., 2015). Različne bakterijske komponente črevesne mikrobiote so sposobne proizvajati esencialna hranila, kot so vitamini, in spodbujati prebavo (Rowland et al., 2018). Dokazano je tudi, da bakterijski presnovki vplivajo na razvoj tkiv ter krepijo presnovne in imunske poti (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). Sestava človeškega črevesnega mikrobioma je izjemno raznolika in je odvisna od genetskih in okoljskih dejavnikov, kot so prehrana, spol, zdravila in zdravstveno stanje (Kumbhare et al., 2019).
Materina prehrana je ključni sestavni del razvoja ploda in novorojenčka ter domnevni vir spojin, ki lahko vplivajo na razvoj (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Ena takšnih zanimivih spojin je propionska kislina (PPA), stranski produkt kratkoverižne maščobne kisline, pridobljen z bakterijsko fermentacijo, in aditiv za živila (den Besten et al., 2013). PPA ima antibakterijske in protiglivične lastnosti, zato se uporablja kot konzervans za živila in v industrijskih aplikacijah za zaviranje rasti plesni in bakterij (Wemmenhove et al., 2016). PPA ima različne učinke v različnih tkivih. V jetrih ima PPA protivnetne učinke, saj vpliva na izražanje citokinov v makrofagih (Kawasoe et al., 2022). Ta regulativni učinek so opazili tudi v drugih imunskih celicah, kar vodi do zmanjšanja vnetja (Haase et al., 2021). Vendar pa so v možganih opazili nasproten učinek. Prejšnje študije so pokazale, da izpostavljenost PPA pri miših povzroča avtizmu podobno vedenje (El-Ansary et al., 2012). Druge študije so pokazale, da lahko PPA povzroči gliozo in aktivira provnetne poti v možganih (Abdelli et al., 2019). Ker je PPA šibka kislina, lahko difundira skozi črevesni epitelij v krvni obtok in tako prečka restriktivne ovire, vključno s krvno-možgansko pregrado in posteljico (Stinson et al., 2019), kar poudarja pomen PPA kot regulatornega presnovka, ki ga proizvajajo bakterije. Čeprav je potencialna vloga PPA kot dejavnika tveganja za avtizem trenutno v preiskavi, se njeni učinki na posameznike z avtizmom lahko razširijo preko spodbujanja nevronske diferenciacije.
Prebavni simptomi, kot sta driska in zaprtje, so pogosti pri bolnikih z nevrološkimi razvojnimi motnjami (Cao et al., 2021). Prejšnje študije so pokazale, da se mikrobiom bolnikov z motnjami avtističnega spektra (MAS) razlikuje od mikrobioma zdravih posameznikov, kar kaže na prisotnost disbioze črevesne mikrobiote (Finegold et al., 2010). Podobno se značilnosti mikrobioma bolnikov z vnetnimi črevesnimi boleznimi, debelostjo, Alzheimerjevo boleznijo itd. razlikujejo tudi od značilnosti zdravih posameznikov (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Vendar do danes ni bila ugotovljena vzročna povezava med črevesnim mikrobiomom in nevrološkimi boleznimi ali simptomi (Yap et al., 2021), čeprav naj bi pri nekaterih od teh bolezenskih stanj igralo vlogo več bakterijskih vrst. Na primer, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio in drugi rodovi so bolj zastopani v mikrobioti bolnikov z avtizmom (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Omeniti velja, da imajo vrste nekaterih teh rodov gene, povezane s proizvodnjo PPA (Reichardt et al., 2014; Yun in Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur in Dürre, 2023). Glede na protimikrobne lastnosti PPA je lahko povečanje njene količine koristno za rast bakterij, ki proizvajajo PPA (Jacobson et al., 2018). Tako lahko okolje, bogato s PFA, povzroči spremembe v črevesni mikrobioti, vključno s prebavnimi patogeni, kar so lahko potencialni dejavniki, ki vodijo do prebavnih simptomov.
Osrednje vprašanje v raziskavah mikrobioma je, ali so razlike v mikrobni sestavi vzrok ali simptom osnovnih bolezni. Prvi korak k razjasnitvi kompleksnega odnosa med prehrano, črevesnim mikrobiomom in nevrološkimi boleznimi je ocena učinkov prehrane na mikrobno sestavo. V ta namen smo uporabili metagenomsko sekvenciranje z dolgim odčitavanjem, da bi primerjali črevesni mikrobiom potomcev miši, ki so se hranile s prehrano, bogato s PPA, ali prehrano, ki je bila osiromašena s PPA. Potomci so se hranili z enako prehrano kot njihove matere. Postavili smo hipotezo, da bo prehrana, bogata s PPA, povzročila spremembe v sestavi črevesnih mikrobov in mikrobnih funkcionalnih poteh, zlasti tistih, ki so povezane s presnovo PPA in/ali proizvodnjo PPA.
V tej študiji so uporabili transgene miši FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories), ki prekomerno izražajo zeleni fluorescentni protein (GFP) pod nadzorom glia-specifičnega promotorja GFAP v skladu s smernicami Odbora za institucionalno oskrbo in uporabo živali Univerze v osrednji Floridi (UCF-IACUC) (številka dovoljenja za uporabo živali: PROTO202000002). Po odstavitvi so bile miši posamično nameščene v kletke z 1–5 mišmi vsakega spola na kletko. Miši so bile hranjene ad libitum s prečiščeno kontrolno dieto (modificirana odprta standardna dieta, 16 kcal% maščobe) ali s dieto, dopolnjeno z natrijevim propionatom (modificirana odprta standardna dieta, 16 kcal% maščobe, ki vsebuje 5000 ppm natrijevega propionata). Količina uporabljenega natrijevega propionata je bila enakovredna 5000 mg PFA/kg skupne teže hrane. To je najvišja koncentracija PPA, odobrena za uporabo kot konzervans za živila. Za pripravo na to študijo so starševske miši 4 tedne pred parjenjem prejemale obe dieti in nato nadaljevale s prehrano skozi celotno brejost matere. Potomci miši [22 miši, 9 kontrolnih (6 samcev, 3 samice) in 13 PPA (4 samci, 9 samic)] so bili odstavljeni in nato 5 mesecev nadaljevali z enako prehrano kot matere. Potomci miši so bili žrtvovani pri 5 mesecih starosti, njihova črevesna blata pa so bila zbrana in sprva shranjena v 1,5 ml mikrocentrifugalnih epruvetah pri -20 °C, nato pa prenesena v zamrzovalnik pri -80 °C, dokler ni bila izčrpana gostiteljska DNK in ekstrahirane mikrobne nukleinske kisline.
DNK gostitelja je bila odstranjena po spremenjenem protokolu (Charalampous et al., 2019). Na kratko, vsebino blata smo prenesli v 500 µl InhibitEX (Qiagen, kat. št./ID: 19593) in shranili zamrznjeno. Na ekstrakcijo smo obdelali največ 1-2 fekalna peletova. Vsebino blata smo nato mehansko homogenizirali s plastičnim pestilom v epruveti, da smo dobili suspenzijo. Vzorce smo centrifugirali pri 10.000 RCF 5 minut oziroma dokler se vzorci niso peletirali, nato pa smo supernatant aspirirali in pelet resuspendirali v 250 µl 1× PBS. Vzorcu smo kot detergent za rahljanje evkariontskih celičnih membran dodali 250 µl 4,4 % raztopine saponina (TCI, številka produkta S0019). Vzorce smo nežno premešali, dokler niso postali gladki, in jih 10 minut inkubirali pri sobni temperaturi. Nato smo za razgradnjo evkariontske celice vzorcu dodali 350 μl vode brez nukleaz, inkubirali 30 sekund in nato dodali 12 μl 5 M NaCl. Vzorce smo nato centrifugirali pri 6000 RCF 5 minut. Supernatant smo aspirirali in peleto resuspendirali v 100 μl 1X PBS. Za odstranitev gostiteljske DNK smo dodali 100 μl pufra HL-SAN (12,8568 g NaCl, 4 ml 1M MgCl2, 36 ml vode brez nukleaz) in 10 μl encima HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202). Vzorce smo temeljito premešali s pipetiranjem in inkubirali pri 37 °C 30 minut pri 800 vrt/min na mešalniku Eppendorf™ ThermoMixer C. Po inkubaciji smo jih centrifugirali 3 minute pri 6000 RCF in dvakrat sprali z 800 µl in 1000 µl 1X PBS. Na koncu smo peleto resuspendirali v 100 µl 1X PBS.
Celotno bakterijsko DNK smo izolirali z uporabo kompleta za čiščenje genomske DNK New England Biolabs Monarch (New England Biolabs, Ipswich, MA, kat. št. T3010L). Standardni operativni postopek, ki je priložen kompletu, je nekoliko spremenjen. Pred končno elucijo inkubirajte in vzdržujte vodo brez nukleaz pri 60 °C. Vsakemu vzorcu dodajte 10 µl proteinaze K in 3 µl RNaze A. Nato dodajte 100 µl pufra za lizo celic in nežno premešajte. Vzorce smo nato inkubirali v Eppendorf™ ThermoMixer C pri 56 °C in 1400 vrt/min vsaj 1 uro in do 3 ure. Inkubirane vzorce smo centrifugirali pri 12.000 RCF 3 minute, supernatant iz vsakega vzorca pa smo prenesli v ločeno 1,5 ml mikrocentrifugalno epruveto, ki je vsebovala 400 µL vezavne raztopine. Epruvete smo nato pulzno mešali v vrtincu 5–10 sekund v 1-sekundnih intervalih. Celotno tekočo vsebino vsakega vzorca (približno 600–700 µL) prenesite v filtrirni vložek, nameščen v pretočni zbiralni epruveti. Epruvete smo centrifugirali 3 minute pri 1000 RCF, da smo omogočili začetno vezavo DNK, nato pa smo jih centrifugirali 1 minuto pri 12.000 RCF, da smo odstranili preostalo tekočino. Stolpec z vzorcem smo prenesli v novo zbiralno epruveto in nato dvakrat sprali. Za prvo izpiranje smo v vsako epruveto dodali 500 µL pufra za izpiranje. Epruveto 3–5-krat obrnite in nato centrifugirali 1 minuto pri 12.000 RCF. Tekočino iz zbiralne epruvete zavrzite in filtrirni vložek smo vrnili v isto zbiralno epruveto. Za drugo izpiranje smo v filter dodali 500 µL pufra za izpiranje, ne da bi ga obračali. Vzorci so bili centrifugirani 1 minuto pri 12.000 RCF. Filter smo prenesli v 1,5 mL epruveto LoBind® in dodali 100 µL predhodno segrete vode brez nukleaz. Filtre smo inkubirali pri sobni temperaturi 1 minuto in nato centrifugirali pri 12.000 RCF 1 minuto. Eluirana DNK je bila shranjena pri -80 °C.
Koncentracijo DNK smo kvantificirali z uporabo fluorometra Qubit™ 4.0. DNK smo pripravili z uporabo kompleta Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit (kat. št. Q33231) v skladu z navodili proizvajalca. Porazdelitev dolžine fragmentov DNK smo izmerili z uporabo naprave Aglient™ 4150 ali 4200 TapeStation. DNK smo pripravili z uporabo reagentov Agilent™ Genomic DNA Reagents (kat. št. 5067-5366) in Genomic DNA ScreenTape (kat. št. 5067-5365). Priprava knjižnice je bila izvedena z uporabo kompleta Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) v skladu z navodili proizvajalca. DNK smo sekvencirali z uporabo sekvencerja ONT GridION™ Mk1 s pretočno celico Min106D (R 9.4.1). Nastavitve sekvenciranja so bile: visoko natančno klicanje baz, minimalna vrednost q 9, nastavitev črtne kode in obrezovanje črtne kode. Vzorci so bili sekvencirani 72 ur, nakar so bili podatki o baznih klicih poslani v nadaljnjo obdelavo in analizo.
Bioinformatična obdelava je bila izvedena z uporabo prej opisanih metod (Greenman et al., 2024). Datoteke FASTQ, pridobljene s sekvenciranjem, so bile razdeljene v imenike za vsak vzorec. Pred bioinformatično analizo so bili podatki obdelani z uporabo naslednjega cevovoda: najprej so bile datoteke FASTQ vzorcev združene v eno samo datoteko FASTQ. Nato so bili odčitki, krajši od 1000 bp, filtrirani z uporabo programa Filtlong v. 0.2.1, pri čemer je bil edini spremenjeni parameter –min_length 1000 (Wick, 2024). Pred nadaljnjim filtriranjem je bila kakovost odčitkov nadzorovana z uporabo programa NanoPlot v. 1.41.3 z naslednjimi parametri: –fastq –plots dot –N50 -o
Za taksonomsko klasifikacijo so bili odčitki in sestavljeni kontigi razvrščeni z uporabo programa Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019). Za odčitke oziroma sestave ustvarite poročila in izhodne datoteke. Za analizo odčitkov in sestavov uporabite možnost –use-names. Za segmente odčitkov sta določeni možnosti –gzip-compressed in –paired. Relativna številčnost taksonov v metagenomih je bila ocenjena z uporabo programa Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017). Najprej smo ustvarili bazo podatkov kmer, ki vsebuje 1000 baz, z uporabo programa bracken-build z naslednjimi parametri: -d
Označevanje genov in ocena relativne številčnosti sta bili izvedeni z uporabo spremenjene različice protokola, ki so ga opisali Maranga in sod. (Maranga in sod., 2023). Najprej so bili kontigi, krajši od 500 bp, odstranjeni iz vseh sestavov z uporabo SeqKit v. 2.5.1 (Shen in sod., 2016). Izbrani sestavi so bili nato združeni v pan-metagenom. Odprti bralni okvirji (ORF) so bili identificirani z uporabo Prodigal v. 1.0.1 (vzporedna različica Prodigal v. 2.6.3) z naslednjimi parametri: -d
Geni so bili najprej združeni v skladu z ortološkimi (KO) identifikatorji Kjotske enciklopedije genov in genomov (KEGG), ki jih je dodelil eggNOG, da bi primerjali številčnost genskih poti. Geni brez izpadov ali geni z več izpadi so bili pred analizo odstranjeni. Nato je bila izračunana povprečna številčnost vsakega KO na vzorec in izvedena je bila statistična analiza. Geni metabolizma PPA so bili definirani kot kateri koli gen, ki mu je bila v stolpcu KEGG_Pathway dodeljena vrstica ko00640, kar kaže na vlogo pri metabolizmu propionata v skladu s KEGG. Geni, identificirani kot povezani s proizvodnjo PPA, so navedeni v dodatni tabeli 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Izvedeni so bili permutacijski testi za identifikacijo genov metabolizma in proizvodnje PPA, ki so bili bistveno bolj številčni v vsaki vrsti vzorca. Za vsak analizirani gen je bilo izvedenih tisoč permutacij. Kot mejna vrednost za določitev statistične pomembnosti je bila uporabljena p-vrednost 0,05. Funkcionalne opombe so bile dodeljene posameznim genom znotraj gruče na podlagi oznak reprezentativnih genov znotraj gruče. Taksone, povezane s presnovo PPA in/ali proizvodnjo PPA, je bilo mogoče identificirati z ujemanjem ID-jev kontigov v izhodnih datotekah Kraken2 z istimi ID-ji kontigov, ohranjenimi med funkcionalno anotacijo z uporabo eggNOG. Testiranje pomembnosti je bilo izvedeno z Mann-Whitneyjevim U testom, opisanim prej. Popravek za večkratno testiranje je bil izveden z Benjamini-Hochbergovim postopkom. Kot mejna vrednost za določitev statistične pomembnosti je bila uporabljena p-vrednost ≤ 0,05.
Raznolikost črevesnega mikrobioma miši je bila ocenjena z uporabo Simpsonovega indeksa raznolikosti. Med kontrolnimi vzorci in vzorci PPA ni bilo opaziti pomembnih razlik v rodovni in vrstni raznolikosti (p-vrednost za rod: 0,18, p-vrednost za vrsto: 0,16) (slika 1). Mikrobna sestava je bila nato primerjana z uporabo analize glavnih komponent (PCA). Slika 2 prikazuje združevanje vzorcev po njihovih deblih, kar kaže na razlike v vrstni sestavi mikrobiomov med vzorci PPA in kontrolnimi vzorci. To združevanje je bilo na ravni rodu manj izrazito, kar kaže na to, da PPA vpliva na nekatere bakterije (dodatna slika 1).
Slika 1. Alfa raznolikost rodov in vrstna sestava mišjega črevesnega mikrobioma. Škatlasti diagrami prikazujejo Simpsonove indekse raznolikosti rodov (A) in vrst (B) v PPA in kontrolnih vzorcih. Pomembnost je bila določena z Mann-Whitneyjevim U testom, večkratna korekcija pa je bila izvedena z Benjamini-Hochbergovim postopkom. ns, p-vrednost ni bila pomembna (p>0,05).
Slika 2. Rezultati analize glavnih komponent sestave črevesnega mikrobioma miši na ravni vrste. Diagram analize glavnih komponent prikazuje porazdelitev vzorcev po prvih dveh glavnih komponentah. Barve označujejo vrsto vzorca: miši, izpostavljene PPA, so vijolične, kontrolne miši pa rumene. Glavni komponenti 1 in 2 sta prikazani na osi x oziroma y in sta izraženi kot njuno pojasnjeno razmerje variance.
Z uporabo transformiranih podatkov o številu RLE so pri kontrolnih miših in miših PPA (kontrolna skupina: 9,66, PPA: 3,02; p-vrednost = 0,0011) opazili znatno zmanjšanje mediane razmerja Bacteroidetes/Bacilli. Ta razlika je bila posledica večje številčnosti Bacteroidetes pri miših PPA v primerjavi s kontrolno skupino, čeprav razlika ni bila pomembna (povprečna CLR pri kontrolni skupini: 5,51, povprečna CLR pri PPA: 6,62; p-vrednost = 0,054), medtem ko je bila številčnost Bacteroidetes podobna (povprečna CLR pri kontrolni skupini: 7,76, povprečna CLR pri PPA: 7,60; p-vrednost = 0,18).
Analiza številčnosti taksonomskih članov črevesnega mikrobioma je pokazala, da se je med vzorci PPA in kontrolnimi vzorci bistveno razlikovalo 1 deblo in 77 vrst (dodatna tabela 2). Številčnost 59 vrst v vzorcih PPA je bila bistveno višja kot v kontrolnih vzorcih, medtem ko je bila številčnost le 16 vrst v kontrolnih vzorcih višja kot v vzorcih PPA (slika 3).
Slika 3. Različna številčnost taksonov v črevesnem mikrobiomu miši PPA in kontrolnih miši. Vulkanski diagrami prikazujejo razlike v številčnosti rodov (A) ali vrst (B) med vzorci PPA in kontrolnimi vzorci. Sive pike označujejo, da ni pomembne razlike v številčnosti taksonov. Barvne pike označujejo pomembne razlike v številčnosti (p-vrednost ≤ 0,05). Prvih 20 taksonov z največjimi razlikami v številčnosti med vrstami vzorcev je prikazanih z rdečo oziroma svetlo modro barvo (kontrolni in vzorci PPA). Rumene in vijolične pike so bile vsaj 2,7-krat večje v kontrolnih vzorcih ali vzorcih PPA kot v kontrolnih. Črne pike predstavljajo taksone s pomembno različno številčnostjo, s povprečnimi razlikami CLR med -1 in 1. Vrednosti P so bile izračunane z Mann-Whitneyjevim U testom in popravljene za večkratno testiranje z uporabo Benjamini-Hochbergovega postopka. Krepko napisane povprečne razlike CLR označujejo pomembne razlike v številčnosti.
Po analizi sestave črevesnih mikrobov smo izvedli funkcionalno anotacijo mikrobioma. Po filtriranju genov nizke kakovosti smo v vseh vzorcih identificirali skupno 378.355 edinstvenih genov. Transformirano številčnost teh genov smo uporabili za analizo glavnih komponent (PCA), rezultati pa so pokazali visoko stopnjo združevanja tipov vzorcev na podlagi njihovih funkcionalnih profilov (slika 4).
Slika 4. Rezultati PCA z uporabo funkcionalnega profila mišjega črevesnega mikrobioma. PCA diagram prikazuje porazdelitev vzorcev po prvih dveh glavnih komponentah. Barve označujejo vrsto vzorca: miši, izpostavljene PPA, so vijolične, kontrolne miši pa rumene. Glavni komponenti 1 in 2 sta prikazani na osi x oziroma y in sta izraženi kot njuno pojasnjeno razmerje variance.
Nato smo preučili številčnost izločkov KEGG v različnih vrstah vzorcev. Skupno je bilo identificiranih 3648 edinstvenih izločkov, od katerih jih je bilo 196 bistveno več v kontrolnih vzorcih in 106 v vzorcih PPA (slika 5). V kontrolnih vzorcih je bilo odkritih skupno 145 genov, v vzorcih PPA pa 61 genov, z bistveno različno številčnostjo. Poti, povezane z metabolizmom lipidov in aminosladkorjev, so bile v vzorcih PPA bistveno bolj bogate (dodatna tabela 3). Poti, povezane z metabolizmom dušika in sistemi žveplovih relej, so bile v kontrolnih vzorcih bistveno bolj bogate (dodatna tabela 3). Številčnost genov, povezanih z metabolizmom aminosladkorjev/nukleotidov (ko:K21279) in metabolizmom inozitol fosfata (ko:K07291), je bila v vzorcih PPA bistveno večja (slika 5). Kontrolni vzorci so imeli bistveno več genov, povezanih z metabolizmom benzoata (ko:K22270), metabolizmom dušika (ko:K00368) in glikolizo/glukoneogenezo (ko:K00131) (slika 5).
Slika 5. Različna številčnost KO v črevesnem mikrobiomu miši PPA in kontrolnih miši. Vulkanski diagram prikazuje razlike v številčnosti funkcionalnih skupin (KO). Sive pike označujejo KO, katerih številčnost se med vrstami vzorcev ni bistveno razlikovala (p-vrednost > 0,05). Barvne pike označujejo pomembne razlike v številčnosti (p-vrednost ≤ 0,05). 20 KO z največjimi razlikami v številčnosti med vrstami vzorcev je prikazanih v rdeči in svetlo modri barvi, kar ustreza kontrolnim vzorcem oziroma vzorcem PPA. Rumene in vijolične pike označujejo KO, ki so bile vsaj 2,7-krat bolj številčne v kontrolnih vzorcih oziroma vzorcih PPA. Črne pike označujejo KO s pomembno različno številčnostjo, s povprečnimi razlikami CLR med -1 in 1. Vrednosti P so bile izračunane z Mann-Whitneyjevim U testom in prilagojene za večkratne primerjave z uporabo Benjamini-Hochbergovega postopka. NaN označuje, da KO ne pripada poti v KEGG. Krepko napisane povprečne razlike CLR označujejo pomembne razlike v številčnosti. Za podrobne informacije o poteh, ki jim pripadajo navedeni KO, glejte dodatno tabelo 3.
Med označenimi geni se je 1601 genov med vrstami vzorcev bistveno razlikovalo v zastopanosti (p ≤ 0,05), pri čemer je bil vsak gen vsaj 2,7-krat bolj zastopan. Od teh genov so bili 4 geni bolj zastopani v kontrolnih vzorcih, 1597 genov pa v vzorcih PPA. Ker ima PPA protimikrobne lastnosti, smo preučili zastopanost genov za presnovo in proizvodnjo PPA med vrstami vzorcev. Med 1332 geni, povezanimi z presnovo PPA, je bilo 27 genov bistveno bolj zastopanih v kontrolnih vzorcih, 12 genov pa v vzorcih PPA. Med 223 geni, povezanimi s proizvodnjo PPA, je bil 1 gen bistveno bolj zastopan v vzorcih PPA. Slika 6A nadalje prikazuje večjo zastopanost genov, vključenih v presnovo PPA, s bistveno večjo zastopanostjo v kontrolnih vzorcih in velikimi učinki, medtem ko slika 6B poudarja posamezne gene s bistveno večjo zastopanostjo, opaženo v vzorcih PPA.
Slika 6. Različna abundanca genov, povezanih s PPA, v črevesnem mikrobiomu miši. Vulkanski diagrami prikazujejo razlike v abundanci genov, povezanih z metabolizmom PPA (A) in proizvodnjo PPA (B). Sive pike označujejo gene, katerih abundanca se med vrstami vzorcev ni bistveno razlikovala (p-vrednost > 0,05). Barvne pike označujejo pomembne razlike v abundanci (p-vrednost ≤ 0,05). 20 genov z največjimi razlikami v abundanci je prikazanih z rdečo in svetlo modro barvo (kontrolni in PPA vzorci). Abundanca rumenih in vijoličnih pik je bila vsaj 2,7-krat večja v kontrolnih in PPA vzorcih kot v kontrolnih vzorcih. Črne pike predstavljajo gene s bistveno različno abundanco, s povprečnimi razlikami CLR med -1 in 1. Vrednosti P so bile izračunane z Mann-Whitneyjevim U testom in popravljene za večkratne primerjave z uporabo Benjamini-Hochbergovega postopka. Geni ustrezajo reprezentativnim genom v katalogu neredundantnih genov. Imena genov so sestavljena iz simbola KEGG, ki označuje gen KO. Krepke povprečne razlike CLR označujejo bistveno različne abundance. Črtica (-) pomeni, da v podatkovni bazi KEGG ni simbola za gen.
Taksoni z geni, povezanimi s presnovo in/ali produkcijo PPA, so bili identificirani z ujemanjem taksonomske identitete kontigov z ID-jem kontiga gena. Na ravni rodu je bilo ugotovljenih, da ima 130 rodov gene, povezane s presnovo PPA, in 61 rodov, ki ima gene, povezane s produkcijo PPA (dodatna tabela 4). Vendar noben rod ni pokazal pomembnih razlik v številčnosti (p > 0,05).
Na ravni vrst so pri 144 bakterijskih vrstah odkrili gene, povezane s presnovo PPA, pri 68 bakterijskih vrstah pa gene, povezane s proizvodnjo PPA (dodatna tabela 5). Med metabolizatorji PPA je osem bakterij pokazalo znatno povečanje številčnosti med vrstami vzorcev, vsi pa so pokazali pomembne spremembe v učinku (dodatna tabela 6). Vsi identificirani metabolizatorji PPA s pomembnimi razlikami v številčnosti so bili v vzorcih PPA bolj številčni. Razvrstitev na ravni vrst je razkrila predstavnike rodov, ki se med vrstami vzorcev niso bistveno razlikovali, vključno z več vrstami Bacteroides in Ruminococcus, pa tudi Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus in Alcaligenes polymorpha. Med bakterijami, ki proizvajajo PPA, so štiri bakterije pokazale pomembne razlike v številčnosti med vrstami vzorcev. Vrste s pomembnimi razlikami v številčnosti so vključevale Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis in Ruminococcus bovis.
V tej študiji smo preučili učinke izpostavljenosti PPA na črevesno mikrobioto miši. PPA lahko pri bakterijah povzroči različne odzive, ker jo proizvajajo določene vrste, jo druge vrste uporabljajo kot vir hrane ali pa ima protimikrobne učinke. Zato ima lahko njen vnos v črevesno okolje s prehranskimi dopolnili različne učinke, odvisno od tolerance, občutljivosti in sposobnosti uporabe kot vira hranil. Občutljive bakterijske vrste se lahko izločijo in nadomestijo s tistimi, ki so bolj odporne na PPA ali jo lahko uporabijo kot vir hrane, kar vodi do sprememb v sestavi črevesne mikrobiote. Naši rezultati so pokazali pomembne razlike v mikrobni sestavi, vendar ne vpliva na splošno mikrobno raznolikost. Največji učinki so bili opaženi na ravni vrst, saj se je med vzorci PPA in kontrolnimi vzorci bistveno razlikovalo več kot 70 taksonov po številčnosti (dodatna tabela 2). Nadaljnja ocena sestave vzorcev, izpostavljenih PPA, je pokazala večjo heterogenost mikrobnih vrst v primerjavi z neizpostavljenimi vzorci, kar kaže na to, da lahko PPA izboljša značilnosti rasti bakterij in omeji bakterijske populacije, ki lahko preživijo v okoljih, bogatih s PPA. Tako lahko PPA selektivno povzroči spremembe, namesto da povzroči obsežno motnjo v raznolikosti črevesne mikrobiote.
Predhodno je bilo dokazano, da konzervansi za živila, kot je PPA, spreminjajo številčnost komponent črevesnega mikrobioma, ne da bi to vplivalo na splošno raznolikost (Nagpal et al., 2021). Tukaj smo opazili najbolj presenetljive razlike med vrstami Bacteroidetes znotraj debla Bacteroidetes (prej znanih kot Bacteroidetes), ki so bile znatno obogatene pri miših, izpostavljenih PPA. Povečana številčnost vrst Bacteroides je povezana s povečano razgradnjo sluzi, kar lahko poveča tveganje za okužbo in spodbudi vnetje (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Ena študija je pokazala, da so novorojeni samci miši, zdravljeni z Bacteroides fragilis, kazali socialno vedenje, ki spominja na motnjo avtističnega spektra (ASD) (Carmel et al., 2023), druge študije pa so pokazale, da lahko vrste Bacteroides spremenijo imunsko aktivnost in vodijo do avtoimunske vnetne kardiomiopatije (Gil-Cruz et al., 2019). Pri miših, izpostavljenih PPA, se je znatno povečalo tudi število vrst, ki pripadajo rodovom Ruminococcus, Prevotella in Parabacteroides (Coretti et al., 2018). Določene vrste Ruminococcus so povezane z boleznimi, kot je Crohnova bolezen, zaradi proizvodnje provnetnih citokinov (Henke et al., 2019), medtem ko so vrste Prevotella, kot je Prevotella humani, povezane s presnovnimi boleznimi, kot sta hipertenzija in občutljivost na inzulin (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Nazadnje smo ugotovili, da je bilo razmerje med Bacteroidetes (prej znanimi kot Firmicutes) in Bacteroidetes bistveno nižje pri miših, izpostavljenih PPA, kot pri kontrolnih miših zaradi večje skupne številčnosti vrst Bacteroidetes. To razmerje se je že prej izkazalo za pomemben kazalnik črevesne homeostaze, motnje v tem razmerju pa so bile povezane z različnimi bolezenskimi stanji (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), vključno z vnetnimi črevesnimi boleznimi (Stojanov et al., 2020). Zdi se, da so vrste iz debla Bacteroidetes skupno najbolj prizadete zaradi povišane prehranske PPA. To je lahko posledica večje tolerance na PPA ali sposobnosti uporabe PPA kot vira energije, kar se je izkazalo za resničnega za vsaj eno vrsto, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Druga možnost je, da izpostavljenost materi PPA pospeši razvoj ploda, saj črevesje mišjih potomcev postane bolj dovzetno za kolonizacijo z Bacteroidetes; vendar naša zasnova študije ni omogočila takšne ocene.
Metagenomska ocena vsebine je pokazala pomembne razlike v številčnosti genov, povezanih z metabolizmom in proizvodnjo PPA, pri čemer so miši, izpostavljene PPA, pokazale večjo številčnost genov, odgovornih za proizvodnjo PPA, medtem ko so miši, ki niso bile izpostavljene PPA, pokazale večjo številčnost genov, odgovornih za metabolizem PAA (slika 6). Ti rezultati kažejo, da učinek PPA na mikrobno sestavo morda ni zgolj posledica njene uporabe, sicer bi morala biti številčnost genov, povezanih z metabolizmom PPA, večja v črevesnem mikrobiomu miši, izpostavljenih PPA. Ena od razlag je, da PPA posreduje pri številčnosti bakterij predvsem s svojimi protimikrobnimi učinki in ne z uporabo bakterij kot hranila. Prejšnje študije so pokazale, da PPA zavira rast Salmonella Typhimurium na način, odvisen od odmerka (Jacobson et al., 2018). Izpostavljenost višjim koncentracijam PPA lahko izbere bakterije, ki so odporne na njene protimikrobne lastnosti in jih morda niso sposobne presnoviti ali proizvajati. Na primer, več vrst Parabacteroides je pokazalo bistveno večjo številčnost v vzorcih PPA, vendar niso bili zaznani nobeni geni, povezani s presnovo ali proizvodnjo PPA (dodatne tabele 2, 4 in 5). Poleg tega je proizvodnja PPA kot stranski produkt fermentacije široko razširjena med različnimi bakterijami (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Večja bakterijska raznolikost je lahko razlog za večjo številčnost genov, povezanih s presnovo PPA, v kontrolnih vzorcih (Averina et al., 2020). Poleg tega je bilo predvideno, da je le 27 (2,14 %) od 1332 genov genov, povezanih izključno s presnovo PPA. Mnogi geni, povezani s presnovo PPA, so vključeni tudi v druge presnovne poti. To dodatno dokazuje, da je bila številčnost genov, vključenih v presnovo PPA, večja v kontrolnih vzorcih; ti geni lahko delujejo v poteh, ki ne povzročajo izkoriščanja ali nastajanja PPA kot stranskega produkta. V tem primeru je le en gen, povezan z nastajanjem PPA, pokazal pomembne razlike v številčnosti med vrstami vzorcev. V nasprotju z geni, povezanimi z metabolizmom PPA, so bili markerni geni za proizvodnjo PPA izbrani, ker so neposredno vključeni v bakterijsko pot za proizvodnjo PPA. Pri miših, izpostavljenih PPA, so ugotovili, da imajo vse vrste znatno povečano številčnost in sposobnost proizvodnje PPA. To podpira napoved, da bodo PPA izbrale proizvajalce PPA in s tem napovedale, da se bo proizvodna zmogljivost PPA povečala. Vendar pa številčnost genov ni nujno povezana z izražanjem genov; zato je lahko stopnja izražanja, čeprav je številčnost genov, povezanih z metabolizmom PPA, v kontrolnih vzorcih višja (Shi et al., 2014). Za potrditev povezave med prevalenco genov, ki proizvajajo PPA, in proizvodnjo PPA so potrebne študije izražanja genov, ki sodelujejo pri proizvodnji PPA.
Funkcionalna anotacija metagenomov PPA in kontrolnih metagenomov je pokazala nekaj razlik. Analiza vsebnosti genov s PCA je pokazala diskretne skupine med vzorci PPA in kontrolnimi vzorci (slika 5). Združevanje znotraj vzorcev je pokazalo, da je bila vsebnost kontrolnih genov bolj raznolika, medtem ko so se vzorci PPA združevali. Združevanje po vsebnosti genov je bilo primerljivo z združevanjem po vrstni sestavi. Tako so razlike v številčnosti poti skladne s spremembami v številčnosti določenih vrst in sevov znotraj njih. V vzorcih PPA sta bili dve poti z bistveno večjo številčnostjo povezani z metabolizmom aminosladkorjev/nukleotidov (ko:K21279) in več potmi metabolizma lipidov (ko:K00647, ko:K03801; dodatna tabela 3). Znano je, da so geni, povezani s ko:K21279, povezani z rodom Bacteroides, enim od rodov z bistveno večjim številom vrst v vzorcih PPA. Ta encim se lahko izogne imunskemu odzivu z izražanjem kapsularnih polisaharidov (Wang et al., 2008). To lahko pojasni povečanje števila Bacteroidetes, opaženo pri miših, izpostavljenih PPA. To dopolnjuje povečano sintezo maščobnih kislin, opaženo v mikrobiomu PPA. Bakterije uporabljajo pot FASIIko:K00647 (fabB) za proizvodnjo maščobnih kislin, ki lahko vplivajo na presnovne poti gostitelja (Yao in Rock, 2015; Johnson et al., 2020), spremembe v presnovi lipidov pa lahko igrajo vlogo pri nevrološkem razvoju (Yu et al., 2020). Druga pot, ki kaže povečano številčnost v vzorcih PPA, je bila biosinteza steroidnih hormonov (ko:K12343). Vse več je dokazov, da obstaja obratna sorazmernost med sposobnostjo črevesne mikrobiote, da vpliva na raven hormonov, in sposobnostjo, da nanjo vplivajo hormoni, tako da imajo lahko povišane ravni steroidov zdravstvene posledice (Tetel et al., 2018).
Ta študija ni brez omejitev in premislekov. Pomembna razlika je, da nismo izvedli fizioloških ocen živali. Zato ni mogoče neposredno sklepati, ali so spremembe v mikrobiomu povezane s kakšno boleznijo. Drug premislek je, da so miši v tej študiji prejemale enako prehrano kot njihove matere. Prihodnje študije lahko ugotovijo, ali prehod s prehrane, bogate s PPA, na prehrano brez PPA izboljša njene učinke na mikrobiom. Ena od omejitev naše študije, tako kot mnogih drugih, je omejena velikost vzorca. Čeprav je mogoče sklepati veljavne zaključke, bi večji vzorec zagotovil večjo statistično moč pri analizi rezultatov. Prav tako smo previdni pri sklepanju o povezavi med spremembami v črevesnem mikrobiomu in katero koli boleznijo (Yap et al., 2021). Moteči dejavniki, vključno s starostjo, spolom in prehrano, lahko pomembno vplivajo na sestavo mikroorganizmov. Ti dejavniki lahko pojasnijo nedoslednosti, opažene v literaturi glede povezave črevesnega mikrobioma s kompleksnimi boleznimi (Johnson et al., 2019; Lagod in Naser, 2023). Na primer, pri živalih in ljudeh z avtizmom se je pokazalo, da je količina članov rodu Bacteroidetes bodisi povečana bodisi zmanjšana (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Podobno so študije sestave črevesja pri bolnikih z vnetnimi črevesnimi boleznimi odkrile tako povečanje kot zmanjšanje pri istih taksonih (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Da bi omejili vpliv spolne pristranskosti, smo poskušali zagotoviti enako zastopanost spolov, tako da so bile razlike najverjetneje posledica prehrane. Eden od izzivov funkcionalnega označevanja je odstranitev odvečnih genskih zaporedij. Naša metoda združevanja genov zahteva 95-odstotno identiteto zaporedja in 85-odstotno podobnost dolžine ter 90-odstotno pokritost poravnave, da se odpravi lažno združevanje. Vendar smo v nekaterih primerih opazili gradnike genov z enakimi oznakami (npr. MUT) (slika 6). Potrebne so nadaljnje študije, da se ugotovi, ali so ti ortologi različni, povezani s specifičnimi rodovi ali pa je to omejitev pristopa združevanja genov v gruče. Druga omejitev funkcionalne anotacije je morebitna napačna klasifikacija; bakterijski gen mmdA je znan encim, ki sodeluje pri sintezi propionata, vendar ga KEGG ne povezuje s presnovno potjo propionata. Nasprotno pa sta ortologa scpB in mmcD povezana. Veliko število genov brez označenih izločkov lahko povzroči nezmožnost identifikacije genov, povezanih s PPA, pri ocenjevanju številčnosti genov. Prihodnje študije bodo imele koristi od analize metatranskriptoma, ki lahko zagotovi globlje razumevanje funkcionalnih značilnosti črevesne mikrobiote in poveže izražanje genov s potencialnimi učinki. Za študije, ki vključujejo specifične nevrološke razvojne motnje ali vnetne črevesne bolezni, so potrebne fiziološke in vedenjske ocene živali, da se spremembe v sestavi mikrobioma povežejo s temi motnjami. Dodatne študije s presaditvijo črevesnega mikrobioma v miši brez mikrobov bi bile prav tako koristne za ugotovitev, ali je mikrobiom gonilo ali značilnost bolezni.
Skratka, pokazali smo, da prehranska PPA deluje kot dejavnik pri spreminjanju sestave črevesne mikrobiote. PPA je konzervans, ki ga je odobrila FDA in je pogosto prisoten v različnih živilih ter lahko pri dolgotrajni izpostavljenosti povzroči motnje v normalni črevesni flori. Ugotovili smo spremembe v številčnosti več bakterij, kar kaže na to, da lahko PPA vpliva na sestavo črevesne mikrobiote. Spremembe v mikrobioti lahko povzročijo spremembe v ravneh nekaterih presnovnih poti, kar lahko privede do fizioloških sprememb, ki so pomembne za zdravje gostitelja. Potrebne so nadaljnje študije, da bi ugotovili, ali lahko učinki prehranske PPA na mikrobno sestavo povzročijo disbiozo ali druge bolezni. Ta študija postavlja temelje za prihodnje študije o tem, kako lahko učinki PPA na sestavo črevesja vplivajo na zdravje ljudi.
Nabori podatkov, predstavljeni v tej študiji, so na voljo v spletnih repozitorijih. Ime repozitorija in dostopna številka sta: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
To študijo na živalih je odobril Odbor za institucionalno oskrbo in uporabo živali Univerze v osrednji Floridi (UCF-IACUC) (številka dovoljenja za uporabo živali: PROTO202000002). Ta študija je skladna z lokalnimi zakoni, predpisi in institucionalnimi zahtevami.
NG: Konceptualizacija, kuriranje podatkov, formalna analiza, preiskava, metodologija, programska oprema, vizualizacija, pisanje (prvotni osnutek), pisanje (pregled in urejanje). LA: Konceptualizacija, kuriranje podatkov, metodologija, viri, pisanje (pregled in urejanje). SH: Formalna analiza, programska oprema, pisanje (pregled in urejanje). SA: Preiskava, pisanje (pregled in urejanje). Glavni sodnik: Preiskava, pisanje (pregled in urejanje). SN: Konceptualizacija, upravljanje projekta, viri, nadzor, pisanje (pregled in urejanje). TA: Konceptualizacija, upravljanje projekta, nadzor, pisanje (pregled in urejanje).
Avtorji izjavljajo, da za raziskavo, avtorstvo in/ali objavo tega članka niso prejeli nobene finančne podpore.
Avtorji izjavljajo, da je bila raziskava izvedena v odsotnosti kakršnih koli komercialnih ali finančnih odnosov, ki bi jih lahko razumeli kot morebitno navzkrižje interesov. ni relevantno.
Vsa mnenja, izražena v tem članku, so izključno mnenja avtorjev in ne odražajo nujno stališč njihovih institucij, založnikov, urednikov ali recenzentov. Založnik ne jamči ali podpira nobenih izdelkov, ocenjenih v tem članku, ali kakršnih koli trditev njihovih proizvajalcev.
Dodatno gradivo k temu članku najdete na spletu: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). Propionska kislina povzroča gliozo in nevroinflamatorno aktivnost z uravnavanjem poti PTEN/AKT pri motnjah avtističnega spektra. Znanstvena poročila 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Statistična analiza podatkov o sestavi. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Razmerje med Firmicutes in Bacteroidetes kot dejavnik tveganja za raka dojke. Journal of Clinical Medicine, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Analiza diferencialne ekspresije podatkov o štetju zaporedij. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI in sod. (2013). Mikrobiota blata in metabolom pri otrocih z avtizmom in pervazivno razvojno motnjo, ki ni drugače opredeljena. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Bakterijske nevrometabolne značilnosti črevesne mikrobiote pri majhnih otrocih z motnjami avtističnega spektra. Journal of Medical Microbiology 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). Mikrobiom kot človeški organ. Klinična mikrobiologija in okužba 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Nova spoznanja o fiziologiji bakterij, ki proizvajajo propionsko kislino: Anaerotignum propionicum in Anaerotignum neopropionicum (prej Clostridium propionicum in Clostridium neopropionicum). Mikroorganizmi 11, 685. doi: 10.3390/mikroorganizmi11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Prehrana matere in razvoj ploda. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y. in Hochberg, J. (1995). Nadzor nad stopnjo lažno pozitivnih rezultatov: praktičen in učinkovit pristop k večkratnemu testiranju. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Čas objave: 18. april 2025