Imunomodulatorni metaboliti so ključna značilnost tumorskega mikrookolja (TME), vendar njihova identiteta z nekaj izjemami ostaja večinoma neznana. Tukaj smo analizirali tumorje in celice T iz tumorjev in ascitesa bolnikov z visokostopenjskim seroznim karcinomom (HGSC), da bi razkrili metabolom teh različnih predelkov TME. Ascites in tumorske celice se močno razlikujejo po metabolitih. V primerjavi z ascitesom so tumor-infiltrirajoče celice T znatno obogatene z 1-metilnikotinamidom (MNA). Čeprav je raven MNA v celicah T povišana, je izražanje nikotinamid N-metiltransferaze (encima, ki katalizira prenos metilnih skupin iz S-adenozilmetionina v nikotinamid) omejeno na fibroblaste in tumorske celice. Funkcionalno MNA inducira celice T k izločanju tumor-spodbujajočega citokina tumor-nekrozni faktor alfa. Zato MNA, pridobljen iz TME, prispeva k imunski regulaciji celic T in predstavlja potencialno tarčo imunoterapije za zdravljenje raka pri ljudeh.
Presnovki, ki izvirajo iz tumorjev, imajo lahko močan zaviralni učinek na protitumorsko imunost in vse več dokazov kaže, da lahko služijo tudi kot ključna gonilna sila za napredovanje bolezni (1). Poleg Warburgovega učinka so se nedavna dela začela ukvarjati z opisovanjem presnovnega stanja tumorskih celic in njegove povezave z imunskim stanjem tumorskega mikrookolja (TME). Študije na mišjih modelih in človeških celicah T so pokazale, da lahko presnova glutamina (2), oksidativna presnova (3) in presnova glukoze (4) delujejo neodvisno na različne podskupine imunskih celic. Več presnovkov v teh poteh zavira protitumorsko delovanje celic T. Dokazano je, da lahko blokada koencima tetrahidrobiopterina (BH4) poškoduje proliferacijo celic T, povečanje BH4 v telesu pa lahko okrepi protitumorski imunski odziv, ki ga posredujeta CD4 in CD8. Poleg tega lahko imunosupresivni učinek kinurenina rešimo z dajanjem BH4 (5). Pri glioblastomu z izocitrat dehidrogenazo (IDH) izločanje enantiometabolnega (R)-2-hidroksiglutarata (R-2-HG) zavira aktivacijo, proliferacijo in citolizo celic T (6). Nedavno je bilo dokazano, da metilglioksal, stranski produkt glikolize, proizvajajo supresorske celice mieloidnega izvora, prenos metilglioksala s celicami T pa lahko zavira delovanje efektorskih celic T. Pri zdravljenju lahko nevtralizacija metilglioksala premaga aktivnost supresorskih celic, pridobljenih iz mieloidov (MDSC), in sinergistično okrepi terapijo z blokado kontrolnih točk pri mišjih modelih (7). Te študije skupaj poudarjajo ključno vlogo presnovkov, pridobljenih iz TME, pri uravnavanju delovanja in aktivnosti celic T.
Disfunkcija celic T je bila pogosto opisana pri raku jajčnikov (8). To je deloma posledica presnovnih značilnosti, ki so lastne hipoksiji in nenormalnemu tumorskemu žilju (9), kar povzroči pretvorbo glukoze in triptofana v stranske produkte, kot sta mlečna kislina in kinurenin. Prekomerni zunajcelični laktat zmanjša proizvodnjo interferona-γ (IFN-γ) in spodbuja diferenciacijo mielosupresivnih podskupin (10, 11). Uživanje triptofana neposredno zavira proliferacijo celic T in zavira signalizacijo receptorjev celic T (12–14). Kljub tem opažanjem je bilo veliko dela na področju imunskega metabolizma opravljenega v in vitro kulturi celic T z uporabo optimiziranih medijev ali omejenega na homologne mišje modele in vivo, od katerih nobeno ne odraža v celoti heterogenosti človeških rakov in fiziološkega makro in mikro okolja.
Pogosta značilnost raka jajčnikov je peritonealna razširitev in pojav ascitesa. Kopičenje celične tekočine v ascitesu je povezano z napredovalo boleznijo in slabo prognozo (15). Po poročilih je ta edinstveni predel hipoksičen, ima visoke ravni vaskularnega endotelijskega rastnega faktorja (VEGF) in indolamin 2,3-dioksigenaze (IDO) ter je infiltriran z regulatornimi celicami T in mieloidnimi inhibitornimi celicami (15-18). Presnovno okolje ascitesa se lahko razlikuje od okolja samega tumorja, zato reprogramiranje celic T v peritonealnem prostoru ni jasno. Poleg tega lahko ključne razlike in heterogenost med ascitesom in presnovki, prisotnimi v tumorskem okolju, ovirajo infiltracijo imunskih celic in njihovo delovanje na tumorje, zato so potrebne nadaljnje raziskave.
Da bi rešili te težave, smo zasnovali občutljivo metodo ločevanja celic in tandemske masne spektrometrije s tekočinsko kromatografijo (LC-MS/MS) za preučevanje različnih tipov celic (vključno s celicami CD4+ in CD8+ T), pa tudi znotraj in med tumorji. Njeni metaboliti se širijo po celicah v istem ascitesu in tumorskem okolju pacienta. To metodo uporabljamo v povezavi z visokodimenzionalno pretočno citometrijo in sekvenciranjem RNA posameznih celic (scRNA-seq), da bi zagotovili visoko ločljiv portret presnovnega stanja teh ključnih populacij. Ta metoda je pokazala znatno povečanje ravni 1-metilnikotinamida (MNA) v tumorskih celicah T, poskusi in vitro pa so pokazali, da imunomodulatorni učinek MNA na delovanje celic T prej ni bil znan. Na splošno ta metoda razkriva medsebojne presnovne interakcije med tumorji in imunskimi celicami ter ponuja edinstven vpogled v presnovke imunske regulacije, kar je lahko koristno za zdravljenje raka jajčnikov na osnovi imunoterapije na osnovi celic T. Možnosti zdravljenja.
Za sočasno kvantifikacijo privzema glukoze [2-(N-(7-nitrofenil-2-oksa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-deoksiglukoza (2-NBDG) in mitohondrijska aktivnost [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) sta tipična vzporedna označevalca, ki ločujeta imunske celice in populacije tumorskih celic (tabela S2 in slika S1A). Ta analiza je pokazala, da imajo ascites in tumorske celice v primerjavi s celicami T višje ravni privzema glukoze, vendar manjše razlike v mitohondrijski aktivnosti. Povprečni privzem glukoze tumorskih celic [CD45-EpCAM (EpCAM)+] je tri- do štirikrat večji kot pri celicah T, povprečni privzem glukoze celic CD4+ T pa je 1,2-krat večji kot pri celicah CD8+ T, kar kaže, da imajo tumorsko infiltrirajoči limfociti (TIL) različne presnovne potrebe celo v istem tumorskem mezenhimskem tkivu (slika 1A). V nasprotju s tem je mitohondrijska aktivnost v tumorskih celicah podobna aktivnosti celic CD4+ T, mitohondrijska aktivnost obeh vrst celic pa je višja kot pri celicah CD8+ T (slika 1B). Na splošno ti rezultati razkrivajo raven presnove. Presnovna aktivnost tumorskih celic je višja kot pri celicah CD4+ T, presnovna aktivnost celic CD4+ T pa je višja kot pri celicah CD8+ T. Kljub tem učinkom med vrstami celic ni dosledne razlike v presnovnem stanju celic CD4+ in CD8+ T ali njihovih relativnih deležih v ascitesu v primerjavi s tumorji (slika 1C). Nasprotno pa se je v frakciji celic CD45 delež celic EpCAM+ v tumorju povečal v primerjavi z ascitesom (slika 1D). Opazili smo tudi jasno presnovno razliko med komponentami celic EpCAM+ in EpCAM-. Celice EpCAM+ (tumorske) imajo večji privzem glukoze in mitohondrijsko aktivnost kot celice EpCAM-, kar je veliko višje od presnovne aktivnosti fibroblastov v tumorskih celicah pri TME (slika 1, E in F).
(A in B) Mediana intenzivnost fluorescence (MFI) privzema glukoze (2-NBDG) (A) in mitohondrijska aktivnost celic CD4+ T (temno rdeča MitoTracker) (B) Reprezentativni grafi (levo) in tabelarni podatki (desno), celice CD8+ T in tumorske celice EpCAM+ CD45 iz ascitesa in tumorja. (C) Razmerje med celicami CD4+ in CD8+ (celic CD3+ T) v ascitesu in tumorju. (D) Delež tumorskih celic EpCAM+ v ascitesu in tumorju (CD45−). (E in F) Privzem glukoze EpCAM+ CD45-tumor in EpCAM-CD45-matriks (2-NBDG) (E) in mitohondrijska aktivnost (temno rdeča MitoTracker) (F) Reprezentativni grafi (levo) in tabelarni podatki (desno) Ascites in tumorske celice. (G) Reprezentativni grafi izražanja CD25, CD137 in PD1 s pretočno citometrijo. (H in I) Izražanje CD25, CD137 in PD1 na celicah CD4+ T (H) in celicah CD8+ T (I). (J in K) Naivni fenotipi centralnega spomina (Tcm), efektorski (Teff) in efektorski spomin (Tem) na podlagi izražanja CCR7 in CD45RO. Reprezentativne slike (levo) in tabelarni podatki (desno) celic CD4+ T (J) in celic CD8+ T (K) v ascitesu in tumorjih. Vrednosti P so bile določene s parnim t-testom (*P<0,05, **P<0,01 in ***P<0,001). Črta predstavlja ujemajoče se bolnike (n = 6). FMO, fluorescenca minus ena; MFI, mediana intenzivnost fluorescence.
Nadaljnja analiza je razkrila druge pomembne razlike med fenotipskim statusom visoko razločenih celic T. Aktivirani (slika 1, G do I) in efektorski spomin (slika 1, J in K) so v tumorjih veliko pogostejši kot ascites (delež celic CD3+ T). Podobno je analiza fenotipa z izražanjem aktivacijskih markerjev (CD25 in CD137) in markerjev izčrpanosti [protein programirane celične smrti 1 (PD1)] pokazala, da čeprav so presnovne značilnosti teh populacij različne (slika S1, B do E), niso bile dosledno opažene pomembne presnovne razlike med naivnimi, efektorskimi ali spominskimi podskupinami (slika S1, F do I). Te rezultate so potrdili z uporabo metod strojnega učenja za samodejno dodeljevanje celičnih fenotipov (21), kar je nadalje razkrilo prisotnost velikega števila celic kostnega mozga (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) v bolnikovem ascitesu (slika S2A). Med vsemi identificiranimi tipi celic je ta populacija mieloidnih celic pokazala najvišjo absorpcijo glukoze in mitohondrijsko aktivnost (slika S2, B do G). Ti rezultati poudarjajo močne presnovne razlike med več tipi celic, ki jih najdemo v ascitesu in tumorjih pri bolnikih s HGSC.
Glavni izziv pri razumevanju metabonomskih značilnosti TIL je potreba po izolaciji vzorcev T-celic zadostne čistosti, kakovosti in količine iz tumorjev. Nedavne študije so pokazale, da lahko metode sortiranja in obogatitve s kroglicami, ki temeljijo na pretočni citometriji, povzročijo spremembe v profilih celičnih metabolitov (22-24). Da bi premagali to težavo, smo optimizirali metodo obogatitve s kroglicami za izolacijo in izolacijo TIL iz kirurško odstranjenega človeškega raka jajčnikov pred analizo z LC-MS/MS (glejte Materiali in metode; slika 2A). Da bi ocenili celoten vpliv tega protokola na spremembe metabolitov, smo primerjali profile metabolitov T-celic, ki so jih aktivirali zdravi darovalci po zgornjem koraku ločevanja kroglic, s celicami, ki niso bile ločene s kroglicami, ampak so ostale na ledu. Ta analiza kontrole kakovosti je pokazala, da obstaja visoka korelacija med tema dvema pogojema (r = 0,77) in da ima tehnična ponovljivost skupine 86 metabolitov visoko ponovljivost (slika 2B). Zato lahko te metode izvedejo natančno analizo metabolitov v celicah, ki so v procesu obogatitve celičnega tipa, in tako zagotovijo prvo platformo visoke ločljivosti za identifikacijo specifičnih metabolitov v HGSC, kar ljudem omogoča globlje razumevanje specifičnosti celic v programu spolnega metabolizma.
(A) Shematski diagram obogatitve z magnetnimi kroglicami. Pred analizo z LC-MS/MS bodo celice podvržene trem zaporednim krogom obogatitve z magnetnimi kroglicami ali bodo ostale na ledu. (B) Vpliv vrste obogatitve na številčnost metabolitov. Povprečje treh meritev za vsako vrsto obogatitve ± standardna napaka. Siva črta predstavlja razmerje 1:1. Znotrajrazredna korelacija (ICC) ponavljajočih se meritev je prikazana na osi. NAD, nikotinamid adenin dinukleotid. (C) Shematski diagram poteka dela analize metabolitov pri pacientih. Ascites ali tumorji se odvzamejo od pacientov in kriokonzervirajo. Majhen del vsakega vzorca je bil analiziran s pretočno citometrijo, preostali vzorci pa so bili podvrženi trem krogom obogatitve za celice CD4+, CD8+ in CD45-. Te celične frakcije so bile analizirane z LC-MS/MS. (D) Toplotni zemljevid standardizirane številčnosti metabolitov. Dendrogram predstavlja Wardovo združevanje evklidskih razdalj med vzorci. (E) Analiza glavnih komponent (PCA) zemljevida metabolitov vzorca, ki prikazuje tri ponovitve vsakega vzorca, vzorci istega pacienta so povezani s črto. (F) PCA profila metabolitov vzorca, pogojenega s pacientom (tj. z uporabo delne redundance); vrsta vzorca je omejena s konveksnim ovojem. PC1, glavna komponenta 1; PC2, glavna komponenta 2.
Nato smo s to metodo obogatitve analizirali 99 metabolitov v frakcijah celic CD4+, CD8+ in CD45- v primarnem ascitesu in tumorjih šestih bolnikov s HGSC (slika 2C, slika S3A ter tabeli S3 in S4). Populacija, ki nas zanima, predstavlja od 2 % do 70 % prvotnega velikega vzorca živih celic, delež celic pa se med bolniki zelo razlikuje. Po ločitvi kroglic obogatena frakcija, ki nas zanima (CD4+, CD8+ ali CD45-), v povprečju predstavlja več kot 85 % vseh živih celic v vzorcu. Ta metoda obogatitve nam omogoča analizo celičnih populacij iz presnove človeškega tumorskega tkiva, kar je nemogoče storiti iz velikih vzorcev. S tem protokolom smo ugotovili, da sta bila l-kinurenin in adenozin, ta dva dobro označena imunosupresivna metabolita, povišana v tumorskih celicah T ali tumorskih celicah (slika S3, B in C). Zato ti rezultati dokazujejo natančnost in sposobnost naše tehnologije ločevanja celic in masne spektrometrije za iskanje biološko pomembnih metabolitov v tkivih bolnikov.
Naša analiza je pokazala tudi močno presnovno ločitev tipov celic znotraj in med bolniki (slika 2D in slika S4A). Zlasti bolnik 70 je v primerjavi z drugimi bolniki pokazal drugačne presnovne značilnosti (slika 2E in slika S4B), kar kaže na to, da lahko med bolniki obstaja znatna presnovna heterogenost. Omeniti velja, da je bila v primerjavi z drugimi bolniki (1,2 do 2 litra; tabela S1) skupna količina zbranega ascitesa pri bolniku 70 (80 ml) manjša. Kontrola heterogenosti med bolniki med analizo glavnih komponent (na primer z uporabo analize delne redundance) kaže dosledne spremembe med tipi celic, tipi celic in/ali mikrookolje pa so jasno združeni glede na profil metabolitov (slika 2F). Analiza posameznih metabolitov je poudarila te učinke in razkrila pomembne razlike med tipi celic in mikrookoljem. Omeniti velja, da je najbolj ekstremna opažena razlika MNA, ki je običajno obogatena s celicami CD45- ter s celicami CD4+ in CD8+, ki infiltrirajo tumor (slika 3A). Pri celicah CD4+ je ta učinek najbolj očiten, na MNA v celicah CD8+ pa se zdi, da okolje močno vpliva. Vendar to ni pomembno, saj je mogoče le tri od šestih bolnikov oceniti glede na rezultate tumorskih CD8+. Poleg MNA so v različnih vrstah celic v ascitesu in tumorjih različno bogati tudi drugi presnovki, ki so v TIL slabo označeni (sliki S3 in S4). Zato ti podatki razkrivajo obetaven nabor imunomodulatornih presnovkov za nadaljnje raziskave.
(A) Normalizirana vsebnost MNA v celicah CD4+, CD8+ in CD45- iz ascitesa in tumorja. Škatlasti diagram prikazuje mediano (črta), interkvartilni razpon (tečaj okvirja) in razpon podatkov, do 1,5-kratnika interkvartilnega razpona (brki okvirja). Kot je opisano v poglavju Materiali in metode za paciente, uporabite vrednost lime pacienta za določitev vrednosti P (*P<0,05 in **P<0,01). (B) Shematski diagram presnove MNA (60). Presnovki: S-adenozil-1-metionin; SAH, S-adenozin-1-homocistein; NA, nikotinamid; MNA, 1-metilnikotinamid; 2-PY, 1-metil-2-piridon-5-karboksamid; 4-PY, 1-metil-4-piridon-5-karboksamid; NR, nikotinamid riboza; NMN, nikotinamid mononukleotid. Encimi (zeleno): NNMT, nikotinamid N-metiltransferaza; SIRT, sirtuini; NAMPT, nikotinamid fosforibozil transferaza; AOX1, aldehid oksidaza 1; NRK, nikotinamid ribozidna kinaza; NMNAT, nikotinamid mononukleotid adenilat transferaza; Pnp1, purinska nukleozidna fosforilaza. (C) t-SNE scRNA-seq ascitesa (sivo) in tumorja (rdeče; n = 3 bolniki). (D) Izražanje NNMT v različnih celičnih populacijah, identificiranih z uporabo scRNA-seq. (E) Izražanje NNMT in AOX1 v SK-OV-3, celicah človeške embrionalne ledvice (HEK) 293T, celicah T in celicah T, obdelanih z MNA. Prikazana je zložena ekspresija glede na SK-OV-3. Prikazan je vzorec ekspresije s SEM (n = 6 zdravih darovalcev). Vrednosti Ct, večje od 35, se štejejo za nezaznavne (UD). (F) Ekspresija SLC22A1 in SLC22A2 v SK-OV-3, HEK293T, celicah T in celicah T, obdelanih z 8 mM MNA. Prikazana je zložena ekspresija glede na SK-OV-3. Prikazan je vzorec ekspresije s SEM (n = 6 zdravih darovalcev). Vrednosti Ct, večje od 35, se štejejo za nezaznavne (UD). (G) Vsebnost celičnega MNA v aktiviranih zdravih celicah T darovalcev po 72 urah inkubacije z MNA. Prikazan je vzorec ekspresije s SEM (n = 4 zdravi darovalci).
MNA nastane s prenosom metilne skupine iz S-adenozil-1-metionina (SAM) na nikotinamid (NA) z nikotinamid N-metiltransferazo (NNMT; slika 3B). NNMT je prekomerno izražen v različnih vrstah raka pri ljudeh in je povezan s proliferacijo, invazijo in metastazami (25-27). Da bi bolje razumeli vir MNA v celicah T pri TME, smo uporabili scRNA-seq za karakterizacijo izražanja NNMT v različnih tipih celic v ascitesu in tumorjih treh bolnikov s HGSC (tabela S5). Analiza približno 6500 celic je pokazala, da je bila v ascitesu in tumorskem okolju izražanje NNMT omejeno na domnevne populacije fibroblastov in tumorskih celic (slika 3, C in D). Omeniti velja, da v nobeni populaciji, ki izraža PTPRC (CD45+), ni očitne ekspresije NNMT (slika 3D in slika S5A), kar kaže, da je bil MNA, zaznan v spektru metabolitov, vnesen v celice T. Izražanje aldehid oksidaze 1 (AOX1) pretvori MNA v 1-metil-2-piridon-5-karboksamid (2-PYR) ali 1-metil-4-piridon-5-karboksamid (4-PYR); slika 3B) je prav tako omejena na populacijo fibroblastov, ki izražajo COL1A1 (slika S5A), kar skupaj kaže, da celice T nimajo sposobnosti običajnega metabolizma MNA. Vzorec izražanja teh genov, povezanih z MNA, je bil potrjen z uporabo drugega neodvisnega nabora podatkov o celicah iz ascitesa bolnikov s HGSC (slika S5B; n = 6) (16). Poleg tega je kvantitativna analiza s polimerazno verižno reakcijo (qPCR) zdravih donorskih celic T, zdravljenih z MNA, pokazala, da se v primerjavi s kontrolnimi celicami tumorja jajčnikov SK-OV-3 NNMT ali AOX1 skoraj nista izražala (slika 3E). Ti nepričakovani rezultati kažejo, da se MNA lahko izloča iz fibroblastov ali tumorjev v sosednje celice T pri TME.
Čeprav kandidati vključujejo družino organskih kationskih prenašalcev 1 do 3 (OCT1, OCT2 in OCT3), ki jih kodira družina topnih nosilcev 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 in SLC22A3), potencialni prenašalci MNA še niso opredeljeni (28). QPCR mRNA iz zdravih donorskih celic T je pokazala nizke ravni izražanja SLC22A1, vendar nezaznavne ravni SLC22A2, kar je potrdilo, da je bila ta lastnost že prej opisana v literaturi (slika 3F) (29). Nasprotno pa je celična linija tumorja jajčnikov SK-OV-3 izražala visoke ravni obeh prenašalcev (slika 3F).
Da bi preverili možnost, da imajo celice T sposobnost absorpcije tujega MNA, so zdrave donorske celice T gojili 72 ur v prisotnosti različnih koncentracij MNA. V odsotnosti eksogenega MNA celične vsebnosti MNA ni mogoče zaznati (slika 3G). Vendar pa so aktivirane celice T, zdravljene z eksogenim MNA, pokazale od odmerka odvisno povečanje vsebnosti MNA v celicah, do 6 mM MNA (slika 3G). Ta rezultat kaže, da lahko TIL kljub nizki ravni izražanja transporterjev in pomanjkanju glavnega encima, odgovornega za znotrajcelični metabolizem MNA, še vedno privzame MNA.
Spekter metabolitov v bolnikovih T-celicah in poskusi absorpcije MNA in vitro povečujejo možnost, da z rakom povezani fibroblasti (CAF) izločajo MNA in da lahko tumorske celice uravnavajo fenotip in funkcijo TIL. Za določitev učinka MNA na T-celice so bile zdrave donorske T-celice aktivirane in vitro v prisotnosti ali odsotnosti MNA ter ocenjena njihova proliferacija in proizvodnja citokinov. Po 7 dneh dodajanja MNA v najvišjem odmerku se je število podvojitev populacije zmerno zmanjšalo, medtem ko se je vitalnost ohranila pri vseh odmerkih (slika 4A). Poleg tega je zdravljenje z eksogenim MNA povzročilo povečanje deleža CD4+ in CD8+ T-celic, ki izražajo faktor tumorske nekroze-α (TNFα; slika 4B). Nasprotno pa se je znotrajcelična proizvodnja IFN-γ znatno zmanjšala v CD4+ T-celicah, ne pa tudi v CD8+ T-celicah, in ni bilo pomembne spremembe interlevkina 2 (IL-2; slika 4, C in D). Zato je encimsko-imunski test (ELISA) supernatantov iz teh z MNA obdelanih kultur celic T pokazal znatno povečanje TNFα, zmanjšanje IFN-γ in nobene spremembe IL-2 (slika 4, E do G). Zmanjšanje IFN-γ kaže, da ima MNA lahko vlogo pri zaviranju protitumorske aktivnosti celic T. Da bi simulirali učinek MNA na citotoksičnost, ki jo posredujejo celice T, so mononuklearne celice periferne krvi zdravih darovalcev (PBMC) proizvedle himerne celice antigenskega receptorja T (FRα-CAR-T), ki ciljajo na folatni receptor α in celice CAR-T (GFP), ki jih regulira zeleni fluorescentni protein (GFP)-CAR-T. Celice CAR-T so bile gojene 24 ur v prisotnosti MNA in nato sokultivirane s človeškimi tumorskimi celicami jajčnikov SK-OV-3, ki izražajo folatni receptor α v razmerju efektorja in tarče 10:1. Zdravljenje z MNA je povzročilo znatno zmanjšanje ubijalske aktivnosti celic FRα-CAR-T, kar je bilo podobno kot pri celicah FRα-CAR-T, zdravljenih z adenozinom (slika 4H).
(A) Skupno število živih celic in podvojitev populacije (PD) neposredno iz kulture 7. dan. Stolpični graf predstavlja povprečje + SEM šestih zdravih darovalcev. Predstavlja podatke iz vsaj n = 3 neodvisnih poskusov. (B do D) CD3/CD28 in IL-2 sta bila uporabljena za aktivacijo celic T pri njihovih ustreznih koncentracijah MNA 7 dni. Pred analizo so bile celice stimulirane s PMA/ionomicinom z GolgiStopom 4 ure. Izražanje TNFα (B) v celicah T. Primer slike (levo) in tabelaričnih podatkov (desno) izražanja TNFα v živih celicah. Izražanje IFN-γ (C) in IL-2 (D) v celicah T. Izražanje citokinov je bilo izmerjeno s pretočno citometrijo. Stolpični graf predstavlja povprečje (n = 6 zdravih darovalcev) + SEM. Za določitev vrednosti P uporabite enosmerno analizo variance in ponovljene meritve (*P<0,05 in **P<0,01). Predstavlja podatke iz vsaj n = 3 neodvisnih poskusov. (E do G) CD3/CD28 in IL-2 sta bila uporabljena za aktivacijo celic T pri ustreznih koncentracijah MNA 7 dni. Gojišče je bilo zbrano pred in po 4 urah stimulacije s PMA/ionomicinom. Koncentracije TNFα (E), IFN-γ (F) in IL-2 (G) so bile izmerjene z ELISA. Stolpični graf predstavlja povprečje (n = 5 zdravih darovalcev) + SEM. Vrednost P je bila določena z enosmerno analizo variance in ponovljenimi meritvami (*P<0,05). Črtkana črta označuje mejo detekcije. (H) Test celične lize. Celice FRα-CAR-T ali GFP-CAR-T so bile 24 ur obdelovane z adenozinom (250 μM) ali MNA (10 mM) ali pa niso bile tretirane (Ctrl). Izmerjen je bil odstotek uničenja celic SK-OV-3. Vrednost P je bila določena z Welchovim t-testom (*P<0,5 in **P<0,01).
Da bi pridobili mehanistično razumevanje regulacije izražanja TNFα, odvisne od MNA, so bile ovrednotene spremembe v mRNA TNFα celic T, zdravljenih z MNA (slika 5A). Zdrave donorske celice T, zdravljene z MNA, so pokazale dvakratno povečanje ravni transkripcije TNFα, kar kaže na to, da je MNA odvisen od transkripcijske regulacije TNFα. Za raziskavo tega možnega regulativnega mehanizma sta bila ovrednotena dva znana transkripcijska faktorja, ki uravnavata TNFα, in sicer aktivirani jedrni faktor celic T (NFAT) in specifični protein 1 (Sp1), kot odziv na vezavo MNA na proksimalni promotor TNFα (30). Promotor TNFα vsebuje 6 identificiranih vezavnih mest NFAT in 2 vezavni mesti Sp1, ki se prekrivata na enem mestu [-55 baznih parov (bp) od 5' pokrovčka] (30). Imunoprecipitacija s kromatinom (ChIP) je pokazala, da se je pri zdravljenju z MNA vezava Sp1 na promotor TNFα povečala za trikrat. Vključitev NFAT se je prav tako povečala in približala pomenu (slika 5B). Ti podatki kažejo, da MNA uravnava izražanje TNFα preko transkripcije Sp1 in v manjši meri izražanje NFAT.
(A) V primerjavi s celicami T, gojenimi brez MNA, je kratnost spremembe izražanja TNFα v celicah T, zdravljenih z MNA. Prikazan je vzorec izražanja s SEM (n = 5 zdravih darovalcev). Predstavlja podatke iz vsaj n = 3 neodvisnih poskusov. (B) Promotor TNFα celic T, zdravljenih z ali brez 8 mM MNA po kombiniranju NFAT in Sp1 s stimulacijo (Ctrl) in PMA/ionomicinom 4 ure. Imunoglobulin G (IgG) in H3 sta bila uporabljena kot negativna oziroma pozitivna kontrola za imunoprecipitacijo. Kvantifikacija ChIP je pokazala, da se je vezava Sp1 in NFAT na promotor TNFα v celicah, zdravljenih z MNA, večkrat povečala v primerjavi s kontrolo. Predstavlja podatke iz vsaj n = 3 neodvisnih poskusov. Vrednost P je bila določena z večkratnimi t-testi (*** P <0,01). (C) V primerjavi z ascitesom HGSC so celice T (necitotoksične) pokazale povečano izražanje TNF v tumorju. Barve predstavljajo različne bolnike. Prikazane celice so bile naključno vzorčene na 300 in pretresene, da se omeji prekomerno risanje (** Padj = 0,0076). (D) Predlagani model MNA za raka jajčnikov. MNA se proizvaja v tumorskih celicah in fibroblastih v TME in jo absorbirajo celice T. MNA poveča vezavo Sp1 na promotor TNFα, kar vodi do povečane transkripcije TNFα in proizvodnje citokinov TNFα. MNA povzroči tudi zmanjšanje IFN-γ. Zaviranje delovanja celic T vodi do zmanjšane sposobnosti ubijanja in pospešene rasti tumorja.
Glede na poročila ima TNFα sprednje in zadnje odvisne protitumorske in protitumorske učinke, vendar ima dobro znano vlogo pri spodbujanju rasti in metastaz raka jajčnikov (31-33). Glede na poročila je koncentracija TNFα v ascitesu in tumorskem tkivu pri bolnicah z rakom jajčnikov višja kot v benignih tkivih (34-36). Kar zadeva mehanizem, lahko TNFα uravnava aktivacijo, delovanje in proliferacijo belih krvničk ter spreminja fenotip rakavih celic (37, 38). V skladu s temi ugotovitvami je analiza diferencialne genske ekspresije pokazala, da je bil TNF v celicah T v tumorskih tkivih znatno povečan v primerjavi z ascitesom (slika 5C). Povečanje ekspresije TNF je bilo opazno le v populacijah celic T z necitotoksičnim fenotipom (slika S5A). Skratka, ti podatki podpirajo stališče, da ima MNA dvojne imunosupresivne in tumor spodbujajoče učinke pri HGSC.
Fluorescentno označevanje na podlagi pretočne citometrije je postalo glavna metoda za preučevanje metabolizma TIL. Te študije so pokazale, da imajo mišji in človeški TIL v primerjavi s perifernimi krvnimi limfociti ali celicami T iz sekundarnih limfoidnih organov večjo nagnjenost k privzemu glukoze (4, 39) in postopno izgubo mitohondrijske funkcije (19, 40). Čeprav smo v tej študiji opazili podobne rezultate, je ključni razvoj primerjava metabolizma tumorskih celic in TIL iz istega reseciranega tumorskega tkiva. V skladu z nekaterimi od teh prejšnjih poročil imajo tumorske (CD45-EpCAM+) celice iz ascitesa in tumorjev večji privzem glukoze kot celice CD8+ in CD4+ T, kar podpira, da je mogoče visok privzem glukoze tumorskih celic primerjati s celicami T. Koncept tekmovanja celic T. TME. Vendar je mitohondrijska aktivnost tumorskih celic višja kot pri celicah CD8+ T, mitohondrijska aktivnost pa je podobna aktivnosti celic CD4+ T. Ti rezultati krepijo nastajajočo tezo, da je oksidativni metabolizem pomemben za tumorske celice (41, 42). Prav tako nakazujejo, da so celice CD8+ T morda bolj dovzetne za oksidativno disfunkcijo kot celice CD4+ T ali da celice CD4+ T za vzdrževanje mitohondrijske aktivnosti uporabljajo druge vire ogljika kot glukozo (43, 44). Treba je opozoriti, da v ascitesu nismo opazili nobene razlike v privzemu glukoze ali mitohondrijski aktivnosti med efektorji CD4+ T, efektorskimi spominskimi celicami T in centralnimi spominskimi celicami T. Podobno stanje diferenciacije celic CD8+ T v tumorjih nima nobene zveze s spremembami v privzemu glukoze, kar poudarja pomembno razliko med celicami T, gojenimi in vitro, in humanimi TIL in vivo (22). Ta opažanja so bila potrjena tudi z uporabo nepristranske avtomatske dodelitve celične populacije, ki je nadalje pokazala, da so celice CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ z večjim privzemom glukoze in mitohondrijsko aktivnostjo kot tumorske celice prevladujoče, vendar imajo presnovno aktivno celično populacijo. Ta populacija lahko predstavlja domnevno subpopulacijo mieloidnih supresorskih celic ali plazmacitoidnih dendritičnih celic, identificiranih v analizi scRNA-seq. Čeprav sta bila oba opisana pri človeških tumorjih jajčnikov [45], ju je še vedno treba nadaljevati z delom na opisu te mieloidne subpopulacije.
Čeprav lahko metode, ki temeljijo na pretočni citometriji, razjasnijo splošne razlike v presnovi glukoze in oksidativnem metabolizmu med tipi celic, natančni presnovki, ki jih proizvaja glukoza ali drugi viri ogljika za mitohondrijski metabolizem pri TME, še niso bili določeni. Dodelitev prisotnosti ali odsotnosti presnovkov določeni podskupini TIL zahteva čiščenje celične populacije iz izrezanega tkiva. Zato lahko naša metoda obogatitve celic v kombinaciji z masno spektrometrijo zagotovi vpogled v presnovke, ki so različno obogateni v celicah T in populacijah tumorskih celic v ujemajočih se vzorcih bolnikov. Čeprav ima ta metoda prednosti pred sortiranjem celic, aktiviranih s fluorescenco, so lahko nekatere knjižnice presnovkov prizadete zaradi inherentne stabilnosti in/ali hitre stopnje obnavljanja (22). Kljub temu je naša metoda uspela identificirati dva prepoznana imunosupresivna presnovka, adenozin in kinurenin, ker se med tipi vzorcev zelo razlikujeta.
Naša metabonomska analiza tumorjev in podtipov TIL ponuja boljši vpogled v vlogo metabolitov pri TME jajčnikov. Prvič, z uporabo pretočne citometrije smo ugotovili, da ni razlike v mitohondrijski aktivnosti med tumorji in celicami CD4+ T. Vendar pa je analiza LC-MS/MS pokazala pomembne spremembe v številčnosti metabolitov med temi populacijami, kar kaže, da je treba sklepe o metabolizmu TIL in njegovi celotni metabolni aktivnosti skrbno interpretirati. Drugič, MNA je metabolit z največjo razliko med celicami CD45 in celicami T v ascitesu, ne pa v tumorjih. Zato imata lahko kompartmentalizacija in lokacija tumorja različne učinke na metabolizem TIL, kar poudarja možno heterogenost v danem mikrookolju. Tretjič, izražanje encima NNMT, ki proizvaja MNA, je večinoma omejeno na CAF, ki je v manjši meri prisoten v tumorskih celicah, vendar so zaznavne ravni MNA opažene v celicah T, ki izvirajo iz tumorjev. Prekomerno izražanje NNMT v CAF jajčnikov ima znan učinek spodbujanja raka, deloma zaradi spodbujanja metabolizma CAF, invazije tumorja in metastaz (27). Čeprav je splošna raven TIL zmerna, je izražanje NNMT v CAF tesno povezano z mezenhimskim podtipom TCGA (Cancer Genome Atlas), ki je povezan s slabo prognozo (27, 46, 47). Nazadnje je izražanje encima AOX1, odgovornega za razgradnjo MNA, prav tako omejeno na populacijo CAF, kar kaže na to, da celice T nimajo sposobnosti presnove MNA. Ti rezultati podpirajo idejo, da čeprav je za potrditev te ugotovitve potrebno nadaljnje delo, lahko visoke ravni MNA v celicah T kažejo na prisotnost imunosupresivnega mikrookolja CAF.
Glede na nizko raven izražanja transporterjev MNA in nezaznavne ravni ključnih beljakovin, ki sodelujejo pri presnovi MNA, je prisotnost MNA v celicah T nepričakovana. Niti NNMT niti AOX1 ni bilo mogoče zaznati z analizo scRNA-seq in ciljno usmerjeno qPCR dveh neodvisnih kohort. Ti rezultati kažejo, da MNA ne sintetizirajo celice T, temveč se absorbira iz okoliškega TME. Poskusi in vitro kažejo, da celice T ponavadi kopičijo eksogeni MNA.
Naše študije in vitro so pokazale, da eksogeni MNA inducira izražanje TNFα v celicah T in poveča vezavo Sp1 na promotor TNFα. Čeprav ima TNFα tako protitumorsko kot protitumorsko delovanje, lahko pri raku jajčnikov TNFα spodbuja rast raka jajčnikov (31-33). Nevtralizacija TNFα v kulturi tumorskih celic jajčnikov ali izločanje signala TNFα v mišjih modelih lahko izboljša produkcijo vnetnih citokinov, ki jih posreduje TNFα, in zavre rast tumorja (32, 35). Zato lahko v tem primeru MNA, pridobljen iz TME, deluje kot provnetni presnovek prek mehanizma, odvisnega od TNFα, preko avtokrine zanke, s čimer spodbuja nastanek in širjenje raka jajčnikov (31). Na podlagi te možnosti se blokada TNFα preučuje kot potencialno terapevtsko sredstvo za raka jajčnikov (37, 48, 49). Poleg tega MNA zmanjšuje citotoksičnost celic CAR-T za tumorske celice jajčnikov, kar zagotavlja nadaljnje dokaze za imunosupresijo, ki jo posreduje MNA. Ti rezultati skupaj kažejo na model, v katerem tumorji in celice CAF izločajo MNA v zunajcelični TME. Z (i) stimulacijo rasti raka jajčnikov, ki jo povzroča TNF, in (ii) zaviranjem citotoksične aktivnosti celic T, ki jo povzroča MNA, ima to lahko dvojni učinek na tumor (slika 5D).
Skratka, ta študija je z uporabo kombinacije hitre obogatitve celic, sekvenciranja posameznih celic in metabolnega profiliranja razkrila ogromne imunometabolomske razlike med tumorskimi in ascitesi pri bolnikih s HGSC. Ta celovita analiza je pokazala razlike v privzemu glukoze in mitohondrijski aktivnosti med celicami T ter identificirala MNA kot necelični avtonomni imunski regulatorni metabolit. Ti podatki vplivajo na to, kako TME vpliva na presnovo celic T pri raku pri ljudeh. Čeprav je bila poročana neposredna konkurenca za hranila med celicami T in rakavimi celicami, lahko metaboliti delujejo tudi kot posredni regulatorji za spodbujanje napredovanja tumorja in morebiti zaviranje endogenih imunskih odzivov. Nadaljnji opis funkcionalne vloge teh regulatornih metabolitov lahko odpre alternativne strategije za izboljšanje protitumorskega imunskega odziva.
Vzorci bolnikov in klinični podatki so bili pridobljeni prek repozitorija tkiva tumorja raka dojke, ki ga je certificirala Kanadska mreža repozitorij tkiv. V skladu s protokolom, ki ga je odobril Odbor za etiko raziskav raka dojke in Univerza v Britanski Kolumbiji (H07-00463), so vsi vzorci in klinični podatki bolnikov pridobili pisno soglasje ali pa so se od njega formalno odpovedali. Vzorci so shranjeni v certificirani BioBank (BRC-00290). Podrobne značilnosti bolnikov so prikazane v preglednicah S1 in S5. Za krioprezervacijo se vzorec tumorja bolnika mehansko razgradi s skalpelom, nato pa se potisne skozi 100-mikronski filter, da se dobi suspenzija posameznih celic. Pacientov ascites je bil centrifugiran pri 1500 vrt/min 10 minut pri 4 °C, da se celice zdrobijo in odstrani supernatant. Celice, pridobljene iz tumorja in ascitesa, so bile krioprezervirane v 50 % toplotno inaktiviranem človeškem serumu AB (Sigma-Aldrich), 40 % RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) in 10 % dimetil sulfoksidu. Te konzervirane suspenzije posameznih celic so bile odtajane in uporabljene za metabolomiko in določanje presnovkov, opisano spodaj.
Celoten medij je sestavljen iz 0,22 μm filtriranega 50:50 dopolnjenega RPMI 1640:AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific), dopolnjenega z 10 % toplotno inaktiviranim človeškim serumom AB (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific), 1 x raztopine penicilina in streptomicina (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) in 50 μMB-merkaptoetanola. AimV (Invitrogen) je dopolnjen z 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) in 2 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific). Pufer za barvanje s pretočnim citometrom je bil sestavljen iz 0,22 μm filtrirane fosfatno puferirane fiziološke raztopine (PBS; Invitrogen), dopolnjene s 3 % toplotno inaktiviranim človeškim serumom AB (Sigma). Pufer za obogatitev celic je sestavljen iz 0,22 μm filtriranega PBS in dopolnjenega z 0,5 % toplotno inaktiviranega humanega seruma AB (Sigma-Aldrich).
V popolnem mediju pri 37 °C smo celice 30 minut obarvali z 10 nM MT DR in 100 μM 2-NBDG. Nato smo celice 15 minut obarvali z barvilom za viabilnost eF506 pri 4 °C. Celice resuspendirajte v FC Block (eBioscience) in Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), razredčite v pufru za barvanje s pretočno citometrijo (v skladu z navodili proizvajalca) in inkubirajte 10 minut pri sobni temperaturi. Celice obarvajte s kompletom protiteles (tabela S2) v pufru za barvanje s pretočno citometrijo pri 4 °C 20 minut. Pred analizo smo celice resuspendirali v pufru za barvanje s pretočno citometrijo (Cytek Aurora; konfiguracija 3L-16V-14B-8R). Za analizo podatkov o številu celic uporabite SpectroFlo in FlowJo V10, za ustvarjanje podatkov pa GraphPad Prism 8. Mediana intenzivnost fluorescence (MFI) 2-NBDG in MT DR je bila logaritemsko normalizirana, nato pa je bil za statistično analizo uporabljen parni t-test za upoštevanje ujemajočih se bolnikov. Iz analize odstranite vse populacije z manj kot 40 dogodki; pred izvedbo statistične analize in vizualizacije podatkov vnesite vrednost MFI 1 za vse negativne vrednosti.
Da bi dopolnili strategijo ročnega dodeljevanja podatkov v zgornjem procesnem panelu, smo uporabili celotno anotacijo z drevesom omejitev oblik (FAUST) (21), da smo po odstranitvi mrtvih celic v FlowJo samodejno dodelili celice populaciji. Izhod smo ročno upravljali, da smo združili populacije, ki se zdijo napačno dodeljene (združevanje PD1+ s tumorskimi celicami PD1), in ohranjene populacije. Vsak vzorec vsebuje povprečno več kot 2 % celic, kar je skupno 11 populacij.
Za ločitev PBMC od produktov ločevanja levkocitov je bilo uporabljeno centrifugiranje z gradientno gostoto Ficoll (STEMCELL Technologies). Celice CD8+ T so bile izolirane iz PBMC z uporabo CD8 MicroBeads (Miltenyi) in ekspandirane v popolnem mediju z uporabo TransAct (Miltenyi) 2 tedna v skladu z navodili proizvajalca. Celice so bile 5 dni stati v popolnem mediju, ki je vseboval IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), nato pa ponovno stimulirane s TransAct. 7. dan so bile v skladu z navodili proizvajalca za obogatitev celic v treh zaporednih krogih uporabljene človeške CD45 MicroBeads (Miltenyi). Celice so bile alikvotirane za analizo s pretočno citometrijo (kot je opisano zgoraj), milijon celic pa je bil trikrat alikvotiran za analizo LC-MS/MS. Vzorce smo obdelali z LC-MS/MS, kot je opisano spodaj. Vrednost manjkajočega metabolita smo ocenili z ionskim številom 1000. Vsak vzorec je pred analizo normaliziran glede na skupno število ionov (TIC), logaritmično pretvorjen in samodejno normaliziran v MetaboAnalystR.
Suspenzija posameznih celic vsakega pacienta je bila odtajana in filtrirana skozi 40 μm filter v popoln medij (kot je opisano zgoraj). V skladu s protokolom proizvajalca so bili za obogatitev vzorcev za celice CD8+, CD4+ in CD45- (na ledu) uporabljeni trije zaporedni krogi pozitivne selekcije z magnetnim ločevanjem z uporabo MicroBeads (Miltenyi). Skratka, celice so bile resuspendirane v pufru za obogatitev celic (kot je opisano zgoraj) in preštete. Celice so bile inkubirane s človeškimi kroglicami CD8, človeškimi kroglicami CD4 ali človeškimi kroglicami CD45 (Miltenyi) pri 4 °C 15 minut in nato sprane s pufrom za obogatitev celic. Vzorec je bil prepuščen skozi kolono LS (Miltenyi) in pozitivne in negativne frakcije so bile zbrane. Da bi skrajšali trajanje in povečali korak pridobivanja celic, se frakcija CD8 nato uporabi za drugi krog obogatitve s CD4+, frakcija CD4 pa za nadaljnjo obogatitev s CD45. Raztopino hranite na ledu ves čas postopka ločevanja.
Za pripravo vzorcev za analizo metabolitov smo celice enkrat sprali z ledeno mrzlo raztopino soli in vsakemu vzorcu dodali 1 ml 80 % metanola, nato jih vrtinčili in zamrznili v tekočem dušiku. Vzorce smo trikrat zamrznili in odtajali ter centrifugirali pri 14.000 vrt/min 15 minut pri 4 °C. Supernatant, ki je vseboval metabolite, smo uparili do suhega. Metabolite smo ponovno raztopili v 50 μl 0,03 % mravljinčne kisline, jih vrtinčili, da smo jih premešali, in nato centrifugirali, da smo odstranili delce.
Presnovke ekstrahirajte, kot je opisano zgoraj. Supernatant prenesite v stekleničko za visokozmogljivo tekočinsko kromatografijo za metabolomske raziskave. Za obdelavo vsakega vzorca s podobnim številom celic uporabite protokol naključne obdelave, da preprečite učinke šarže. Izvedli smo kvalitativno oceno globalnih presnovkov, ki je bila predhodno objavljena na masnem spektrometru AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole (50). Kromatografsko analizo in integracijo površine vrhov smo izvedli z uporabo programske opreme MultiQuant različice 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Za oceno vrednosti manjkajočega metabolita je bilo uporabljeno število ionov 1000, TIC vsakega vzorca pa je bil uporabljen za izračun normalizirane površine vrha vsakega zaznanega metabolita, da se popravijo spremembe, ki jih je povzročila instrumentalna analiza pri obdelavi vzorca. Po normalizaciji TIC se za logaritemsko pretvorbo in samodejno skaliranje normativne linije uporabi MetaboAnalystR(51) (privzeti parameter). Za izvedbo raziskovalne analize razlik v metabolomu med tipi vzorcev smo uporabili PCA z veganskim paketom R, za analizo pacientov pa smo uporabili analizo delne redundance. Za izdelavo dendrograma toplotnega zemljevida za združevanje evklidske razdalje med vzorci smo uporabili Wardovo metodo. Za identifikacijo različno številčnih metabolitov v celotnem tipu celic in mikrookolju smo uporabili limo (52) na standardizirani številčnosti metabolitov. Za poenostavitev razlage smo za določitev modela uporabili parameter povprečja skupine in kot vsako skupino upoštevali tipe celic v mikrookolju (n = 6 skupin); za test pomembnosti smo izvedli tri ponovljene meritve za vsak metabolit. Da bi se izognili lažni replikaciji, je bil pacient vključen kot ovira v zasnovo lime. Da bi preverili razlike v metabolitih med različnimi pacienti, smo prilagodili model lime, ki je paciente vključil na fiksen način. Poročamo o pomembnosti vnaprej določenega kontrasta med tipom celic in mikrookoljem Padj < 0,05 (Benjamini-Hochbergova korekcija).
Po obogatitvi z vigorjem z uporabo kompleta Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80 % viabilnost) je bilo izvedeno sekvenciranje transkriptomov posameznih celic na celotnih živih zamrznjenih vzorcih ascitesa in tumorjev z uporabo protokola za izražanje genov 10x 5′. Analiziranih je bilo pet primerov z ujemajočimi se tumorji in ascitesom, čeprav je nizka viabilnost enega vzorca tumorja preprečila njegovo vključitev. Da bi dosegli večkratno izbiro bolnikov, smo združili vzorce vsakega bolnika v stezah 10x kromovega kontrolerja in ločeno analizirali mesta ascitesa in tumorja. Po sekvenciranju [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), genom Quebec; povprečno 73.488 oziroma 41.378 odčitkov na celico za tumor oziroma ascites]], smo uporabili CellSNP in Vireo (53) (na podlagi CellSNP kot skupnega človeškega SNP (VCF), ki ga zagotavlja GRCh38, je dodeljena identiteta darovalca. SNPRelate uporabljamo za sklepanje o najbližji identiteti (IBS) bolnikovega genotipa (IBS), pri čemer izključujemo nedodeljene celice in celice, identificirane kot dupleksi, ter ujemajoče se darovalce med vzorci ascitesa in tumorja (54). Na podlagi te naloge smo za nadaljnjo analizo ohranili tri primere z obilno zastopanostjo celic v tumorju in ascitesu. Po izvedbi koraka masne filtracije v embalaži BioConductor scater (55) in scran (56) je to dalo 6975 celic (2792 oziroma 4183 celic iz tumorja oziroma ascitesa) za analizo. Za analizo uporabljamo igraphovo (57) Louvainovo združevanje skupne mreže najbližjih sosedov (SNN) na podlagi Jaccardove razdalje do celic v gručih po ekspresiji. Gruče so bile ročno označene z domnevnimi tipi celic na podlagi izražanja markernih genov in vizualizirane s t-SNE. Citotoksične celice T so definirane z izražanjem CD8A in GZMA, pri čemer so izključene podskupine z nizko ekspresijo ribosomskih proteinov. Dostopali smo do objavljenih podatkov Izarja in sodelavcev (16), ki vključujejo njihovo vgradnjo t-SNE, in lahko nadzorujejo prekrivanje izražanja med markerji imunskih celic in izražanjem NNMT.
PBMC smo ločili od produktov ločevanja levkocitov (STEMCELL Technologies) s centrifugiranjem v gradientni gostoti Ficoll. Celice CD3+ smo izolirali iz PBMC z uporabo CD3 kroglic (Miltenyi). V prisotnosti ali odsotnosti MNA smo celice CD3+ aktivirali s CD3, vezanim na ploščo (5 μg/ml), topnim CD28 (3 μg/ml) in IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Zadnji dan ekspanzije smo s pretočno citometrijo ocenili viabilnost (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) in proliferacijo (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific). Efektorsko funkcijo ocenite s stimulacijo celic s PMA (20 ng/ml) in ionomicinom (1 μg/ml) z GolgiStopom 4 ure ter spremljajte CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) in TNFα-fluorescein izotiocianatom (FITC) (MAb11, BD). Celice qPCR in ChIP stimulirajte s PMA (20 ng/ml) in ionomicinom (1 μg/ml) 4 ure. Supernatant ELISA je bil zbran pred in po stimulaciji s PMA (20 ng/ml) in ionomicinom (1 μg/ml) 4 ure.
Za izolacijo RNA z uporabo kompleta RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) sledite protokolu proizvajalca. Za homogenizacijo vzorca uporabite QIAshredder (QIAGEN). Za sintezo komplementarne DNA (cDNA) uporabite komplet High-Capacity RNA to cDNA (Thermo Fisher Scientific). Za kvantifikacijo izražanja genov (v skladu s protokolom proizvajalca) uporabite TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) z naslednjimi sondami: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliceraldehid-3-fosfat iz vodika (GAPDH)] in Hs01010726_m1 (SLC22A2). Vzorci so bili analizirani na sistemu za PCR v realnem času StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) v hitri optični reakcijski plošči MicroAmp s 96 vdolbinami (Applied Biosystems) z optičnim filmom MicroAmp. Vsaka vrednost Ct, ki presega 35, se šteje za vrednost nad pragom zaznavnosti in je označena kot nezaznavna.
Izvedite ChIP, kot je bilo opisano že prej (58). Skratka, celice so bile obdelane s formaldehidom (končna koncentracija 1,42 %) in inkubirane pri sobni temperaturi 10 minut. Uporabite dopolnjeni pufer za nabrekanje (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl in 0,1 % NP-40) na ledu 10 minut, nato resuspendirajte v imunoprecipitacijskem pufru, kot je opisano (58). Vzorec je bil nato sonificiran z naslednjimi cikli: 10 ciklov (20 1-sekundnih impulzov) in statični čas 40 sekund. Inkubirajte protitelesa imunoglobulina G (Cell Signaling Technology; 1 μl), histona H3 (Cell Signaling Technology; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) in SP1 (Cell Signaling Technology; 3 μl) stopnje ChIP z vzorcem pri 4 °C in stresajte čez noč. Kroglice proteina A (Thermo Fisher Scientific) inkubirajte z vzorcem pri 4 °C z rahlim stresanjem 1 uro, nato uporabite chelex kroglice (Bio-Rad) za obogatitev DNK in proteinazo K (Thermo Fisher) za razgradnjo beljakovin. Promotor TNFα smo zaznali s PCR: naprej, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; nasprotno, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (produkt z 207 bp). Slike smo izdelali s programsko opremo Image Lab (Bio-Rad) in kvantificirali s programsko opremo ImageJ.
Supernatant celične kulture smo zbrali, kot je opisano zgoraj. Določanje smo izvedli v skladu s postopki proizvajalca za komplet ELISA za humani TNFα (Invitrogen), komplet ELISA za humani IL-2 (Invitrogen) in komplet ELISA za humani IFN-γ (Abcam). V skladu s protokolom proizvajalca smo supernatant razredčili v razmerju 1:100 za detekcijo TNFα in IL-2 ter v razmerju 1:3 za detekcijo IFN-γ. Za merjenje absorbance pri 450 nm smo uporabili EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer).
PBMC smo ločili od produktov ločevanja levkocitov (STEMCELL Technologies) s centrifugiranjem z gradientno gostoto Ficoll. Celice CD3+ smo izolirali iz PBMC z uporabo CD3 kroglic (Miltenyi). V prisotnosti ali odsotnosti MNA smo celice CD3+ aktivirali s CD3 (5 μg/ml), vezanim na ploščo, topnim CD28 (3 μg/ml) in IL-2 (300 U/ml; Proleukin) 3 dni. Po 3 dneh smo celice zbrali in sprali z 0,9 % fiziološko raztopino, pelet pa smo hitro zamrznili. Štetje celic smo izvedli s pretočno citometrijo (Cytek Aurora; konfiguracija 3L-16V-14B-8R) z uporabo 123count eBeads.
Presnovke ekstrahirajte, kot je opisano zgoraj. Posušeni ekstrakt smo rekonstituirali pri koncentraciji 4000 celičnih ekvivalentov/μl. Vzorec analizirajte z reverzno fazno kromatografijo (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) in kolono CORTECS T3 (2,1 × 150 mm, velikost delcev 1,6 μm, velikost por 120 Å; #186008500, Waters). Polarni masni spektrometer (6470, Agilent), v katerem elektrosprejna ionizacija deluje v pozitivnem načinu. Mobilna faza A je 0,1 % mravljinčna kislina (v H2O), mobilna faza B je 90 % acetonitril, 0,1 % mravljinčna kislina. Gradient LC je od 0 do 2 minuti za 100 % A, od 2 do 7,1 minute za 99 % B in od 7,1 do 8 minut za 99 % B. Nato kolono ponovno uravnotežite z mobilno fazo A pri pretoku 0,6 ml/min 3 minute. Pretok je 0,4 ml/min, komora kolone pa se segreje na 50 °C. Za določitev retencijskega časa (RT) in transformacije (RT = 0,882 minute, transformacija 1 = 137→94,1, transformacija 2 = 137→92, konverzija 3 = 137→78) uporabite MNA-jev standard čiste kemije (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada). Ko se vsi trije prehodi pojavijo ob pravilnem retencijskem času, se za kvantifikacijo uporabi prehod 1, da se zagotovi specifičnost. Standardna krivulja MNA (Toronto Research Chemical Company) je bila ustvarjena s šestimi serijskimi razredčitvami osnovne raztopine (1 mg/ml), da so dobili standarde tekočine z 0,1, 1,0, 10 in 100 ng/ml oziroma 1,0 in 10 μg/ml. Meja detekcije je 1 ng/ml, linearni odziv pa je med 10 ng/ml in 10 μg/ml. Vsaka injekcija dveh mikrolitrov vzorca in standarda se uporabi za LC/MS analizo, mešani vzorec za kontrolo kakovosti pa se izvede vsakih osem injekcij, da se zagotovi stabilnost analitske platforme. Odzivi MNA vseh celičnih vzorcev, obdelanih z MNA, so bili znotraj linearnega območja testa. Analiza podatkov je bila opravljena z uporabo programske opreme za kvantitativno analizo MassHunter (v9.0, Agilent).
Konstrukt αFR-CAR druge generacije je bil vzet po Song et al. (59). Skratka, konstrukt vsebuje naslednjo vsebino: vodilno zaporedje CD8a, humani αFR-specifični enoverižni variabilni fragment, tečajno in transmembransko regijo CD8a, znotrajcelično domeno CD27 in znotrajcelično domeno CD3z. Celotno zaporedje CAR je bilo sintetizirano z GenScript in nato klonirano v lentivirusni ekspresijski vektor druge generacije pred ekspresijsko kaseto GFP, uporabljeno za oceno učinkovitosti transdukcije.
Lentivirus se proizvaja s transfekcijo celic HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); gojene v Dulbeccovem modificiranem Eagleovem mediju, ki vsebuje 10 % fetalnega govejega seruma (FBS) in 1 % PenStrep, z uporabo vektorja CAR-GFP in pakirnih plazmidov (psPAX2 in pMD2.G, Addgene) z lipofekcijskim aminom (Sigma-Aldrich). Supernatant, ki je vseboval virus, smo zbrali 48 in 72 ur po transfekciji, filtrirali in koncentrirali z ultracentrifugiranjem. Koncentrirani virusni supernatant shranjujte pri -80 °C do transdukcije.
PBMC so ločene od produktov ločevanja levkocitov zdravih darovalcev (STEMCELL Technologies) s centrifugiranjem z gradientno gostoto Ficoll. Za izolacijo celic CD8+ iz PBMC uporabite mikrokroglice CD8 s pozitivno selekcijo (Miltenyi). Celice T stimulirajte s TransAct (Miltenyi) in v mediju TexMACS [Miltenyi; dopolnjenem s 3 % toplotno inaktiviranega človeškega seruma, 1 % PenStrep in IL-2 (300 U/ml)]. Štiriindvajset ur po stimulaciji so bile celice T transducirane z lentivirusom (10 μl koncentriranega virusnega supernatanta na 106 celic). 1 do 3 dni po transdukciji na Cytek Aurora (na FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+) ocenite izražanje GFP celic, da dokažete učinkovitost transdukcije vsaj 30 %.
Celice CAR-T smo gojili 24 ur v mediju Immunocult (STEMCELL Technologies; dopolnjeno z 1 % PenStrep) pod naslednjimi pogoji: neobdelane, obdelane z 250 μM adenozina ali 10 mM MNA. Po predhodni obdelavi smo celice CAR-T sprali s PBS in združili z 20.000 celicami SK-OV-3 [ATCC; v mediju McCoy 5A (Sigma-Aldrich), dopolnjenem z 10 % FBS in 1 % PenStrep pri 10: Razmerje med efektorjem in tarčo 1 smo pomnožili v treh ponovitvah v dopolnjenem mediju Immunocult. Celice SK-OV-3 in celice SK-OV-3, lizirane z digitalis saponinom (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich), smo uporabili kot negativne oziroma pozitivne kontrole. Po 24 urah sokultivacije smo supernatant zbrali in izmerili laktat dehidrogenazo (LDH) v skladu z navodili proizvajalca (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Supernatant LDH smo razredčili v LDH pufru v razmerju 1:50. Odstotek uničenja smo izmerili z naslednjo formulo: odstotek uničenja = odstotek korekcije / največja stopnja uničenja x 100 %, kjer je odstotek korekcije = samo sokultura celic T, največja stopnja uničenja pa = pozitivna kontrola - negativna kontrola.
Kot je opisano v besedilu ali gradivih in metodah, za statistično analizo uporabite GraphPad Prism 8, Microsoft Excel ali R v3.6.0. Če je od istega pacienta zbranih več vzorcev (na primer ascites in tumor), uporabimo parni t-test ali pa pacienta vključimo kot naključni učinek v linearni ali posplošeni model, kot je ustrezno. Za metabolomsko analizo se test pomembnosti izvede v treh ponovitvah.
Za dodatno gradivo k temu članku glejte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
To je članek z odprtim dostopom, distribuiran pod pogoji licence Creative Commons Priznanje avtorstva-Nekomercialno, ki dovoljuje uporabo, distribucijo in reprodukcijo v katerem koli mediju, če končna uporaba ni namenjena komercialnemu dobičku in če je predpostavka, da je izvirno delo pravilno. Referenca.
Opomba: Prosimo vas, da navedete svoj e-poštni naslov le zato, da oseba, ki jo priporočite strani, ve, da želite, da vidi e-pošto in da ne gre za neželeno pošto. E-poštnih naslovov ne bomo zbirali.
To vprašanje se uporablja za preverjanje, ali ste obiskovalec, in za preprečevanje samodejnega pošiljanja neželene pošte.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA prispeva k imunosupresiji celic T in predstavlja potencialno tarčo imunoterapije za zdravljenje raka pri ljudeh.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA prispeva k imunosupresiji celic T in predstavlja potencialno tarčo imunoterapije za zdravljenje raka pri ljudeh.
©2021 Ameriško združenje za napredek znanosti. vse pravice pridržane. AAAS je partner HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef in COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.